王睿 張艷紅 胡貽椿 李敏 吳景歡 楊曉光 毛德倩

摘?要：目的：研究喂飼轉(zhuǎn)C0030.2.5基因玉米對大鼠的亞慢性毒性。方法：選用斷乳SD大鼠140只，隨機(jī)分為7組，即3個轉(zhuǎn)基因組（72.70%、36.35%、18.18%）、3個親本玉米組（72.7%、35.35%、18.18%）、1個常規(guī)基礎(chǔ)飼料對照組，每組20只，雌雄各半。動物2只/籠喂養(yǎng)，自由進(jìn)食飲水，連續(xù)觀察90d。觀察大鼠體重、進(jìn)食量、血液學(xué)指標(biāo)、血生化指標(biāo)，實驗結(jié)束后摘取動物臟器進(jìn)行病理組織學(xué)檢查。結(jié)果：各劑量組動物的體重均呈增長趨勢，體重增長正常，中、末期的血液學(xué)和血生化指標(biāo)中個別指標(biāo)雖有統(tǒng)計學(xué)差異，但并無生物學(xué)意義。各主要臟器系數(shù)及病理組織學(xué)檢查比較，均未發(fā)現(xiàn)有生物學(xué)意義的改變。結(jié)論：現(xiàn)有實驗結(jié)果不能證實該轉(zhuǎn)C0030.2.5基因玉米對大鼠有亞慢性毒性作用。

關(guān)鍵詞：轉(zhuǎn)基因玉米;C0030.2.5基因;亞慢性毒性

轉(zhuǎn)基因玉米利用轉(zhuǎn)基因方法可以顯著提高玉米抗蟲、抗除草劑的品質(zhì)，具有重要的經(jīng)濟(jì)效益，但這種技術(shù)是否會對人體帶來危害，是社會關(guān)注的熱點問題[1-4]。本研究依據(jù)“實質(zhì)等同性”原則[5]，按照中華人民共和國農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)（NY/T 1102—2006）《轉(zhuǎn)基因植物及其產(chǎn)品食用安全檢測—大鼠90d喂養(yǎng)實驗》[6]，對轉(zhuǎn)C0030.2.5基因玉米進(jìn)行了大鼠90d喂養(yǎng)實驗，了解分析該轉(zhuǎn)基因玉米是否會對大鼠產(chǎn)生亞慢性毒性作用，為該轉(zhuǎn)基因玉米的食用飼用性安全提供科學(xué)依據(jù)。

1?材料與方法

1.1?樣品

轉(zhuǎn)C0030.2.5基因玉米（以下簡稱轉(zhuǎn)基因玉米）、轉(zhuǎn)化受體DBN567（以下簡稱親本玉米）、常規(guī)基礎(chǔ)飼料AIN-93G（以下簡稱對照玉米），均為黃色籽粒;C0030.2.5、DBN567，由北京大北農(nóng)生物技術(shù)有限公司提供，經(jīng)產(chǎn)品檢測后開展本次實驗。

1.2?材料與主要儀器

L535R湘儀低速冷凍離心機(jī)、BS-220型全自動生化分析儀、BC-5000VET全自動五分類血液分析儀、Leica HI1220烘片機(jī)、Leica RM2016輪轉(zhuǎn)式切片機(jī)、Leica HI1210攤片機(jī)、Leica EG1150H型石蠟包埋機(jī)。血細(xì)胞稀釋液及溶血劑，深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司;血生化檢測試劑盒，深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司、重慶中元生物技術(shù)有限公司。

1.3?實驗動物和飼養(yǎng)條件

選用北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司提供的健康SD大鼠（SPF級，許可證號：SCXK（京）2012—0001）。飼養(yǎng)地點：匯智泰康生物技術(shù)（北京）有限公司，級別：屏障環(huán)境，許可證號：SYXK（京）2014—0022。

1.4?飼料配制

實驗開始前在北京市營養(yǎng)源研究所對各種玉米的營養(yǎng)成分進(jìn)行全面檢測，參照美國營養(yǎng)研究所的AIN-93G配方，在保證營養(yǎng)平衡的基礎(chǔ)上計算轉(zhuǎn)基因玉米能摻入飼料的最大比例。經(jīng)計算得出各玉米在飼料中的最大摻入量為72.70%，以此作為高劑量，中、低劑量的玉米摻入量分別設(shè)為35.35%、18.18%。以上飼料由北京華阜康生物科技股份有限公司制備。配制好的飼料輻照滅菌后真空包裝保存供實驗使用。

1.5?實驗方法

選用斷乳SD大鼠140只，隨機(jī)分為7組，即C0030.2.5低、中、高劑量組（以下簡稱轉(zhuǎn)低、轉(zhuǎn)中、轉(zhuǎn)高），轉(zhuǎn)化受體玉米DBN567低、中、高劑量組（以下簡稱親低、親中、親高），AIN-93G（以下簡稱對照組）。每組20只，雌雄各半。動物2只/籠喂養(yǎng)，自由飲食，每周稱量1次大鼠體重，每周記錄1次給食量和剩食量，連續(xù)觀察90d。各組于實驗中期和末期分別采血測定各項血液學(xué)、血生化指標(biāo)，實驗結(jié)束后摘取動物臟器進(jìn)行病理組織學(xué)檢查。

1.6?觀察指標(biāo)

1.6.1?動物的一般表現(xiàn)、體重、食物利用率?每周稱量1次大鼠體重，記錄1次給食量和剩食量。計算食物利用率：

食物利用率=實驗期內(nèi)動物體重增加（g）/實驗期內(nèi)動物總進(jìn)食量（g）×100%（1）

1.6.2?血液學(xué)檢查?分別于實驗中期和末期對實驗動物血液中紅細(xì)胞（RBC）數(shù)、血紅蛋白（Hb）量、血小板（PLT）數(shù)、白細(xì)胞（WBC）數(shù)及其分類（中性、淋巴、單核）進(jìn)行血液學(xué)指標(biāo)測定。實驗中期大鼠眼內(nèi)眥取血，實驗結(jié)束大鼠戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉，腹主動脈采血。

1.6.3?臨床生化學(xué)檢查?實驗中期和末期動物空腹采血進(jìn)行血液生化指標(biāo)測定。測定指標(biāo)為總蛋白（TP）、白蛋白（ALB）、血糖（GLU）、尿素氮（UREA）、肌酐（CREA）、膽固醇（TC）、甘油三酯（TG）、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）、乳酸脫氫酶（LDH）、堿性磷酸酶（ALP）。

1.6.4?臟體比?實驗結(jié)束處死動物取肝、腎、腎上腺、脾、胸腺、心臟、睪丸稱重，計算相應(yīng)的臟體比（以百克體重計算）。

1.6.5?病理組織學(xué)?解剖進(jìn)行大體觀察及組織病理學(xué)檢查。組織病理學(xué)檢查組分別為C0030.2.5高劑量組、對照玉米DBN567高劑量組、AIN-93G，檢查組織有腦、心臟、肺、肝、腎、腎上腺、脾、胃腸（十二指腸、空腸和回腸）、胸腺、甲狀腺、睪丸、附睪、前列腺、卵巢和子宮。

1.7?統(tǒng)計方法

轉(zhuǎn)C0030.2.5基因玉米低、中、高劑量組與相應(yīng)劑量的轉(zhuǎn)化受體DBN567組和AIN-93G對照組比較，采用SPSS統(tǒng)計軟件進(jìn)行單因素方差分析（ANOVA），方差齊時采用Bonferroni檢驗，方差不齊采用Games-Howell檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2?結(jié)果與分析

2.1?生長狀況及食物利用率

對照組中有1只雌性動物在第9周意外死亡，大體解剖臟器未見異常，該組其他動物以及其余各組動物在整個實驗期間活動、生長正常，被毛濃密有光澤。雄、雌性大鼠C0030.2.5各劑量組與相應(yīng)劑量的親本玉米DBN567組相比較，體重未見顯著差異（表1）。雄性大鼠轉(zhuǎn)中、轉(zhuǎn)低組總進(jìn)食量低于相應(yīng)劑量的親本組（P<0.05），雄性大鼠轉(zhuǎn)高組總食物利用率高于親高組（P<0.05），其余各劑量組雌、雄動物的總增重、總進(jìn)食量以及總食物利用率未見顯著差異（P>0.05）（表2）。與對照組相比，雄性大鼠轉(zhuǎn)高、轉(zhuǎn)中、轉(zhuǎn)低組和親高、親中、親低組體重（表1）均有顯著性增加（P<0.05），尤其在實驗?zāi)┢凇Ｐ坌源笫筠D(zhuǎn)高組總食物利用率高于對照組（P<0.05）（表2），雄性大鼠3個親本組及轉(zhuǎn)高組體重增重和總進(jìn)食量、轉(zhuǎn)低組體重增重、轉(zhuǎn)高組總食物利用率均高于對照組（P<0.05）。其余各雌、雄大鼠體重增重、總進(jìn)食量、總食物利用率在各玉米摻飼劑量組和對照組之間未見顯著差異（P>0.05）（表2）。

2.2?血液學(xué)指標(biāo)

實驗中期，雄性大鼠親高組、轉(zhuǎn)高組中性粒細(xì)胞顯著降低（P<0.05）;親高組、親低組、轉(zhuǎn)高組、轉(zhuǎn)中組淋巴細(xì)胞水平顯著增高（P<0.05）;轉(zhuǎn)高組、轉(zhuǎn)中組單核細(xì)胞百分比顯著降低（P<0.05）。在雌性大鼠中，親低組RBC水平顯著升高而WBC水平顯著降低（P<0.05），轉(zhuǎn)低組RBC與親本組比較顯著降低（P<0.05）（表3）。實驗?zāi)┢?，親高組1只雌性大鼠、轉(zhuǎn)高組2只雄性大鼠樣本出現(xiàn)凝血，對照組中1只雌性大鼠在第9周意外死亡，檢測結(jié)果未納入數(shù)據(jù)統(tǒng)計。與相應(yīng)劑量的親本組比較，雄性大鼠轉(zhuǎn)高組WBC、轉(zhuǎn)中組中性粒細(xì)胞及淋巴細(xì)胞水平顯著降低（P<0.05）;與對照組相比，雄性大鼠親高組WBC水平顯著升高，親中組、親低組中性粒細(xì)胞顯著升高，親中組、轉(zhuǎn)低組淋巴細(xì)胞水平顯著降低，親低組、轉(zhuǎn)高組、轉(zhuǎn)低組PLT數(shù)顯著降低（P<0.05）;雌性大鼠轉(zhuǎn)中組血紅蛋白顯著升高，親低組、轉(zhuǎn)低組PLT數(shù)顯著升高（P<0.05）（表4）。由表3～4可見，實驗中期或末期有個別指標(biāo)出現(xiàn)統(tǒng)計學(xué)差異，或盡在實驗中期出現(xiàn)，或未呈現(xiàn)劑量—反應(yīng)關(guān)系，且均在該品系動物正常值范圍內(nèi)[7-8]，認(rèn)為無生物學(xué)意義。其余各組各指標(biāo)與對照組相比，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），轉(zhuǎn)基因其余各組各項指標(biāo)與其相應(yīng)劑量的親本對照組比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。

2.3?血生化指標(biāo)

實驗中期，與對照組相比，雄性大鼠3個親本組、轉(zhuǎn)高組、轉(zhuǎn)中組ALT水平顯著升高（P<0.05）;轉(zhuǎn)基因玉米各劑量組、親本各劑量組AST水平顯著增高（P<0.05）;親中組、轉(zhuǎn)中組GLU水平顯著升高、TC水平顯著降低（P<0.05）;親中組、轉(zhuǎn)中組、轉(zhuǎn)低組UREA水平顯著降低（P<0.05）;親高組、轉(zhuǎn)高組LDH水平顯著增高（P<0.05）。在雌性大鼠中，親高組、親中組、轉(zhuǎn)基因玉米各劑量組ALT水平顯著升高（P<0.05）;親高組、親低組、轉(zhuǎn)高組、轉(zhuǎn)低組AST水平顯著增高（P<0.05）;親中組、轉(zhuǎn)中組、轉(zhuǎn)低組UREA水平顯著降低（P<0.05）;親高組LDH水平顯著增高（P<0.05）（表5）。實驗?zāi)┢?，與相應(yīng)劑量的親本組比較，雄性大鼠轉(zhuǎn)低組ALT、AST水平和轉(zhuǎn)中組TP、GLU水平顯著升高（P<0.05）。與對照組相比，雄性大鼠親高組、轉(zhuǎn)基因玉米各劑量組ALT水平顯著升高（P<0.05）;轉(zhuǎn)低組AST水平顯著增高（P<0.05）;親中組TP、ALB、GLU水平顯著降低（P<0.05）。在雌性大鼠中，親高組、親中組、轉(zhuǎn)低組AST水平顯著增高（P<0.05）（表6）。由表5～6可見，實驗中期與末期轉(zhuǎn)基因組和親本組有個別指標(biāo)與對照組差異有統(tǒng)計學(xué)意義，但無劑量-反應(yīng)關(guān)系且變化均在該品系動物正常值范圍內(nèi)[8-10]，認(rèn)為無生物學(xué)意義。其余各組各指標(biāo)與對照組相比，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），轉(zhuǎn)基因其余各組各項指標(biāo)與其相應(yīng)劑量的親本對照組比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。

2.4?大鼠臟體比

實驗?zāi)┢趯Ω鲃┝拷M的臟器重量稱重，并計算臟體比。雄性大鼠親低組、轉(zhuǎn)低組肝臟臟體比顯著升高（P<0.05），親高、轉(zhuǎn)基因玉米各劑量組的腎臟臟體比顯著降低（P<0.05），親高組、親中組、轉(zhuǎn)低組腎上腺臟體比顯著降低（P<0.05），其余各組大鼠臟體比與對照組相比，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。轉(zhuǎn)基因各劑量組臟體比與相應(yīng)親本組相比，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）（表7）。

2.5?大體病理及組織學(xué)檢查

各組大鼠外觀、皮膚未見異常，胸、腹腔膜未見出血點、積液，主要臟器正常，未見明顯病理病變。對轉(zhuǎn)基因玉米、親本玉米以及AIN-93G對照組SD大鼠腦、心、肺、腎、肝、腎上腺、脾、胃腸（十二指腸、空腸和回腸）、胸腺、甲狀腺、睪丸、附睪、前列腺、卵巢及子宮進(jìn)行了病理組織學(xué)檢查，未見與受試物有關(guān)的特異性毒性病理改變。

3?討論

本研究將轉(zhuǎn)基因玉米及其親本對照分別摻入飼料給予大鼠90d，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，雄性、雌性大鼠轉(zhuǎn)基因玉米各劑量組與相應(yīng)劑量的親本對照玉米組相比較，體重、體重增長、周攝食量、對周食物利用度雖有個別統(tǒng)計學(xué)意義上的顯著性差異，但在歷史對照數(shù)據(jù)范圍內(nèi)，且總體重增加、總進(jìn)食量和總食物利用率未見顯著差異。實驗中期和末期各項血液學(xué)指標(biāo)和血生化指標(biāo)結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)基因玉米各劑量組與相應(yīng)劑量的親本對照玉米組相比較，有個別指標(biāo)有統(tǒng)計學(xué)差異，但大部分有差異的指標(biāo)沒有同時與2個對照組都存在差異或沒有同時在雌雄大鼠中存在差異，且基本上都在文獻(xiàn)報道的正常范圍之內(nèi)[5-10]，且未出現(xiàn)劑量-效應(yīng)關(guān)系。

臟器重量變化可轉(zhuǎn)基因玉米各劑量組與其相應(yīng)劑量的親本對照相比較，臟器重量和臟體比均無顯著性差異（P>0.05）。實驗?zāi)┢趯?組SD大鼠腦、心、肺、腎、肝、腎上腺、脾、胃腸（十二指腸、空腸和回腸）、胸腺、甲狀腺、睪丸、附睪、前列腺、卵巢及子宮進(jìn)行了病理組織學(xué)檢查，未見與受試物有關(guān)的特異性毒性病理改變。此外，動物實驗中會受轉(zhuǎn)基因食品特性外的一些不確定因素的影響[11]，因此認(rèn)為這些差異有可能與大鼠個體差異有關(guān)，而不應(yīng)認(rèn)為指標(biāo)升高是因飼喂轉(zhuǎn)基因飼料造成的。

綜上所述，本實驗結(jié)果未發(fā)現(xiàn)具有對大鼠有生物學(xué)意義的亞慢性毒性作用。本研究還將開展急性毒性實驗、多代繁殖實驗、營養(yǎng)功效等研究，以更好地評價該轉(zhuǎn)基因玉米的食用安全性。

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（責(zé)任編輯?唐建敏）