趙志成　史佩玉　鄧潔宜　邢萬里　王穎

〔摘要〕 目的 基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探討當(dāng)歸芍藥散治療慢性盆腔炎的作用機制。方法 利用TCMSP數(shù)據(jù)庫篩選出當(dāng)歸芍藥散活性成分及其相關(guān)靶標(biāo)基因;使用Genecards數(shù)據(jù)庫篩選慢性盆腔炎靶標(biāo)基因;借助STRING在線數(shù)據(jù)庫獲取靶標(biāo)基因相互作用關(guān)系;采用David數(shù)據(jù)庫進行GO生物學(xué)過程分析和KEGG通路功能富集分析;利用cytoscape軟件構(gòu)建當(dāng)歸芍藥散治療慢性盆腔炎“活性成分-作用靶標(biāo)-通路”網(wǎng)絡(luò)。結(jié)果 當(dāng)歸芍藥散的核心活性成分有山（木示）酚、β-谷甾醇等，核心作用靶標(biāo)有PTGS2、TNF、JUN等;GO生物學(xué)過程分析結(jié)果表明當(dāng)歸芍藥散活性成分的基因功能主要表現(xiàn)在藥物反應(yīng)、RNA聚合酶II啟動子轉(zhuǎn)錄的正調(diào)節(jié)、凋亡過程的負(fù)調(diào)節(jié)、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等生物學(xué)過程; KEGG結(jié)果表明當(dāng)歸芍藥散主要作用與TNF、Toll樣受體等信號通路有關(guān)。結(jié)論 當(dāng)歸芍藥散活性成分山柰酚、β-谷甾醇等可能通過TNF、Toll樣受體等信號通路作用于PTGS2、TNF-α、JUN、IL-6等關(guān)鍵靶標(biāo)基因進而發(fā)揮其臨床功效，達到治療慢性盆腔炎等疾病的目的。

〔關(guān)鍵詞〕 慢性盆腔炎;當(dāng)歸芍藥散;網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué);通路;機制

〔中圖分類號〕R285;R711? ? ? ?〔文獻標(biāo)志碼〕A? ? ? ?〔文章編號〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2019.09.013

Exploration on Mechanism of Danggui Shaoyao Powder in Chronic Pelvic

Inflammatory Based on Network Pharmacology

ZHAO Zhicheng1， SHI Peiyu2， DENG Jieyi3， XING Wanli2， WANG Ying1*

（1. The First Affiliated Hospital of Heilongjiang University of Chinese Medicine， Harbin， Heilongjiang 150040， China; 2. The First Clinical Medical College of Guangzhou University of Chinese Medicine， Guangzhou， Guangdong 510405， China; 3. The Second Clinical Medical College of Guangzhou University of Chinese Medicine， Guangzhou， Guangdong 510405， China）

〔Abstract〕 Objective To explore the mechanism of Danggui Shaoyao Powder in chronic pelvic inflammatory based on network pharmacology. Methods TCMSP database was used for screening effective components of Danggui Shaoyao Powder and related target genes; target genes for chronic pelvic inflammatory were screened by using Genecards database; interaction relationship of target genes was acquired by STRING online database; David database was used for GO biological progress analysis and pathway enrichment analysis of KEGG; active component-target-pathway network of Danggui Shaoyao Powder in chronic pelvic inflammatory was structured by Cytoscape software. Results The core active components of Danggui Shaoyao Powder were kaempferol， β-sitosterol， etc. and the core targets were PTGS2， TNF， JUN， etc. GO biological progress analysis showed that the gene functions of active components of Danggui Shaoyao Powder mainly manifested in biological progresses like drug reaction， positive regulation in transcription of RNA polymerase II promoter， negative regulation in apoptotic process， signal transduction and so on; KEGG results showed that the main function of Danggui Shaoyao Powder was related to signaling pathways like TNF signaling pathway， Toll-like receptor signaling pathway and so on. Conclusion Kaempferol， β-sitosterol and other active components of Danggui Shaoyao Powder may act on PTGS2， TNF-α， JUN， IL-6 and other key target genes through signaling pathways like TNF signaling pathway and Toll-like receptor signaling pathway， thus exerting its clinical efficacy， so as to achieve the goal of treating chronic pelvic inflammation and other diseases.

〔Keywords〕 chronic pelvic inflammatory; Danggui Shaoyao Powder; network pharmacology; pathway; mechanism

經(jīng)方當(dāng)歸芍藥散出自于醫(yī)圣張仲景所著的《金匱要略》，由當(dāng)歸、茯苓、白術(shù)、白芍、澤瀉和川芎等藥物組成，主治“婦人懷妊，腹中疞痛”。臨床上可廣泛治療多種婦科疾病，是婦科常用方之一。

慢性盆腔炎是由女性上生殖道感染而引起的一種常見婦科疾病，患者常感到明顯的下腹部脹墜感、腰骶部酸脹疼痛，該疾病給患者身心健康帶來較大的不良影響[1]。近年來，有較多文獻證實當(dāng)歸芍藥散對慢性盆腔炎具有確切的療效。戴璐等[2]通過臨床隨機對照實驗發(fā)現(xiàn)，當(dāng)歸芍藥散治療慢性盆腔炎患者的總有效率高達90%，明顯優(yōu)于對照組使用甲硝唑聯(lián)合左氧氟沙星。同樣，傅劍鋒[3]把124例慢性盆腔炎患者隨機分為試驗組62例和參照組62例，試驗組和參照組分別使用當(dāng)歸芍藥散和婦科千金片治療，結(jié)果顯示當(dāng)歸芍藥散治療慢性盆腔炎的療效明顯優(yōu)于婦科千金片。王志國[4]、張志鵬[5]和高升[6]等人通過大鼠動物實驗推測當(dāng)歸芍藥散治療慢性盆腔炎的作用機制與調(diào)節(jié)機體免疫功能，降低炎癥反應(yīng)有關(guān)，但是研究均是通過動物實驗及相關(guān)指標(biāo)的測量，其具體作用機制和信號通路等尚未完全闡明。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)與傳統(tǒng)的“一個藥物，一種活性成分，一個靶標(biāo)基因，一種疾病”的思維模式及框架不同[7]，其通過構(gòu)建多層次的網(wǎng)絡(luò)，從整體的角度去探究疾病與藥物間的聯(lián)系，具有良好的整體性，與中醫(yī)藥治療疾病的整體觀念與辨證論治原則相吻合[8]，已成為研究藥物與疾病間關(guān)系的重要方法之一。本研究通過對現(xiàn)有的數(shù)據(jù)進行分析處理，運用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法從分子機制和信號通路層面探討當(dāng)歸芍藥散治療慢性盆腔炎的具體作用機制。

1 資料和方法

1.1? 當(dāng)歸芍藥散活性成分與靶標(biāo)基因的獲取

本研究使用中藥系統(tǒng)藥理學(xué)分析平臺（TCMSP，http：//lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php），以“當(dāng)歸”“白芍”“茯苓”“白術(shù)”“澤瀉”和“川芎”6個中藥成分作為Herb name檢索當(dāng)歸芍藥散中當(dāng)歸、白芍、茯苓、白術(shù)、澤瀉和川芎的所有活性成分，并利用口服生物利用度（OB）和類藥性（DL）進行活性成分的篩選。OB是藥物吸收、分布、代謝、排泄特性中最重要的藥代學(xué)參數(shù)，其代表口服藥物到達體循環(huán)所占口服劑量的比例，是決定活性成分DL的關(guān)鍵指標(biāo)之一[9]。因此，本課題通過設(shè)置OB≥30%和DL≥0.18[10]來進行當(dāng)歸芍藥散活性成分的篩選，以提高數(shù)據(jù)分析處理的價值。通過TCMSP數(shù)據(jù)庫獲取當(dāng)歸芍藥散活性成分對應(yīng)的靶點，并輸入到STRING數(shù)據(jù)庫（https：//string-db.org/），獲得藥物靶點的標(biāo)準(zhǔn)基因名稱。

1.2? 慢性盆腔炎靶標(biāo)基因的篩選

以”Chronic pelvic inflammatory disease”為關(guān)鍵詞從GeneCards： The Human Gene Databas（https：//www.genecards.org/）數(shù)據(jù)庫中搜索慢性盆腔炎相關(guān)靶標(biāo)基因，設(shè)置Score>10以保證數(shù)據(jù)的可處理性。

1.3? 網(wǎng)絡(luò)模型的構(gòu)建和分析

將當(dāng)歸芍藥散所有靶標(biāo)基因輸入到STRING數(shù)據(jù)庫（https：//string-db.org/），設(shè)置物種為“Homo sapiens”，選擇最高置信度”highest confidence”（0.900），并隱藏PPI網(wǎng)絡(luò)中不相關(guān)的節(jié)點，其余參數(shù)設(shè)置保持默認(rèn)，獲取當(dāng)歸芍藥散靶標(biāo)基因PPI信息。同樣，獲取慢性盆腔炎靶標(biāo)基因PPI信息。運用Cytoscape

3.7.0軟件（http：/cytoscape.org/）分別構(gòu)建當(dāng)歸芍藥散與慢性盆腔炎靶標(biāo)基因PPI網(wǎng)絡(luò)，使用軟件中的Merge功能將兩個PPI網(wǎng)絡(luò)進行交集映射，得到當(dāng)歸芍藥散治療慢性盆腔炎作用靶標(biāo)的PPI網(wǎng)絡(luò)圖。將獲得的作用靶標(biāo)輸入到DAVID數(shù)據(jù)庫（https：//david.ncifcrf.gov/）進行基因本體（GO）生物過程分析和KEGG通路分析。最后，將分析得到的KEGG通路與作用靶標(biāo)、當(dāng)歸芍藥散活性成分相對應(yīng)，構(gòu)建“活性成分—作用靶標(biāo)—KEGG信號通路”網(wǎng)絡(luò)圖。

2 結(jié)果

2.1? 當(dāng)歸芍藥散活性成分與靶標(biāo)基因的篩選

在TCMSP數(shù)據(jù)庫中檢索當(dāng)歸芍藥散各藥物活性成分，設(shè)置OB≥30%和DL≥0.18，同時篩去無對應(yīng)靶標(biāo)基因的成分，最終共獲得31個活性成分（見表1）與103個靶標(biāo)基因。

2.2? 慢性盆腔炎靶標(biāo)基因的篩選與PPI網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

在GeneCards： The Human Gene Databas數(shù)據(jù)庫中共篩選得到慢性盆腔炎靶標(biāo)基因1014個，將當(dāng)歸芍藥散靶標(biāo)基因PPI網(wǎng)絡(luò)與慢性盆腔炎靶標(biāo)基因PPI網(wǎng)絡(luò)進行交集映射，得到當(dāng)歸芍藥散治療慢性盆腔炎作用靶標(biāo)PPI網(wǎng)絡(luò)圖（由于部分作用靶標(biāo)未參與網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建，故舍去），見圖1。圖中40個節(jié)點代表當(dāng)歸芍藥散治療慢性盆腔炎的作用靶標(biāo)，節(jié)點顏色越深代表其在網(wǎng)絡(luò)中度值越大，這40個作用靶標(biāo)間有相互作用，表明這些作用靶標(biāo)可能在某些層面上是相互關(guān)聯(lián)的并通過多方面、多途徑的協(xié)調(diào)起到治療慢性盆腔炎的作用。

2.3? GO生物學(xué)過程富集分析和KEGG通路富集分析

將上述得到的當(dāng)歸芍藥散治療慢性盆腔炎的作用靶標(biāo)導(dǎo)入David數(shù)據(jù)庫中，選取排名前15名的GO生物學(xué)過程富集分析和KEGG通路富集分析。使用Omicshare軟件（http：//www.omicshare.com）分別繪制生物學(xué)過程氣泡圖（見圖2）和KEGG通路氣泡圖（見圖3）。由圖中可知，當(dāng)歸芍藥散對凋亡過程的負(fù)調(diào)節(jié)、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等的影響較大;當(dāng)歸芍藥散治療慢性盆腔炎涉及的通路主要是TNF信號通路、Toll樣受體信號通路等。

2.4? 當(dāng)歸芍藥散治療慢性盆腔炎“活性成分—作用靶標(biāo)—通路”網(wǎng)絡(luò)

將KEGG通路富集分析得到的基因富集數(shù)排名前15的通路與當(dāng)歸芍藥散治療慢性盆腔炎的作用靶標(biāo)和活性成分相對應(yīng)，得到“活性成分—作用靶標(biāo)—KEGG信號通路”網(wǎng)絡(luò)，見圖4。該網(wǎng)絡(luò)由57個節(jié)點和506條邊組成，13個綠色菱形節(jié)點代表當(dāng)歸芍藥散活性成分，29個紅色圓形節(jié)點代表當(dāng)歸芍藥散治療慢性盆腔炎的作用靶標(biāo)，15個橙色箭頭節(jié)點代表KEGG信號通路，邊代表三者間的相互作用。圖中節(jié)點越大，說明其在網(wǎng)絡(luò)中越重要，對慢性盆腔炎的影響也越大。網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋵W(xué)結(jié)果表明，山柰酚（kaempferol）、β-谷甾醇（beta-sitosterol）等活性成分與PTGS2、TNF-α、JUN等靶標(biāo)基因在網(wǎng)絡(luò)中的節(jié)點度值排名靠前可能是當(dāng)歸芍藥散治療慢性盆腔炎的核心活性成分與核心作用靶標(biāo)。網(wǎng)絡(luò)中每種活性成分對應(yīng)多個作用靶標(biāo)，每個作用靶標(biāo)又連接多種活性成分，且多條通路中間通過共有作用靶標(biāo)相互連接，表示當(dāng)歸芍藥散治療慢性盆腔炎具備多成分、多靶點、多通路的特點，與中醫(yī)學(xué)整體觀念不謀而合。

3 討論

本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法探討當(dāng)歸芍藥散治療慢性盆腔炎的作用機制，結(jié)果顯示山柰酚、β-谷甾醇等可能是核心活性成分。山柰酚是一種黃酮類化合物，相關(guān)研究表明其具有抗氧化反應(yīng)、抗炎、保護神經(jīng)等諸多作用[11]。山柰酚可以抑制PTGS2（COX-2）、IL-6、IL-8、TNF-α等炎癥介質(zhì)的釋放，減少炎癥反應(yīng)的發(fā)生與減輕炎癥反應(yīng)過程中出現(xiàn)的黏膜充血、水腫、局部紅腫熱痛等癥狀[12-13]。β-谷甾醇能夠增強機體氧自由基清除能力，提升血清NO含量，抑制TNF-α等炎性因子的聚集與釋放，下調(diào)NF-κB信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的活化[14-15]，具有廣泛的抗炎活性。因此，筆者推測當(dāng)歸芍藥散的關(guān)鍵活性成分與抗炎機制有一定的關(guān)聯(lián)，其通過抗炎機制作用于慢性盆腔炎，與近年來研究當(dāng)歸芍藥散治療慢性盆腔炎的機制基本一致。

本研究預(yù)測出PTGS2、TNF-α、IL-6、JUN等為當(dāng)歸芍藥散治療慢性盆腔炎的核心作用靶標(biāo)。PTGS2又稱環(huán)氧酶-2（COX-2），在細胞受到促炎細胞因子等刺激時，COX-2 表達上調(diào)，并參與炎癥的形成和發(fā)展[16]。許多實驗研究表明，通過下調(diào)COX-2可以減輕炎癥反應(yīng)[17-18]。TNF-α、IL-6為重要的炎性因子，其大量分泌能夠?qū)е录毎蜃铀降氖Ш馀c紊亂，最終引起盆腔周圍結(jié)締組織發(fā)生充血、水腫，逐漸演變成慢性盆腔炎[19-20]。c-jun在整個月經(jīng)周期中對子宮內(nèi)膜的細胞增殖和凋亡起作用，c-jun蛋白水平的循環(huán)變化可以防止基質(zhì)細胞在晚期分泌期進入細胞凋亡[21]。因此，這些靶標(biāo)基因都在炎癥反應(yīng)、細胞增殖與凋亡、免疫反應(yīng)中起到重要作用，是當(dāng)歸芍藥散治療慢性盆腔炎的關(guān)鍵作用靶標(biāo)。

KEGG富集結(jié)果顯示，作用靶標(biāo)顯著富集在TNF信號通路、Toll樣受體信號通路等信號通路上。TNF信號通路是由于TNF與TNFR1相互結(jié)合而激活，激活的TNF信號通路可以加強促炎性細胞因子、生長因子和TNF-α本身等基因的表達[22]。Toll樣受體是Ⅰ型跨膜蛋白受體，屬于白細胞介素-1受體超家族成員，TLRs廣泛存在于免疫細胞表面，可激活先天性免疫系統(tǒng)產(chǎn)生親炎癥細胞因子，啟動后天性免疫系統(tǒng)。TLRs介導(dǎo)免疫的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中的 TLRs/NF-κB信號通路已基本闡明，此通路在免疫調(diào)節(jié)中發(fā)揮著極其重要的作用[23]。當(dāng)歸芍藥散可能通過作用于該通路，啟動如后天免疫系統(tǒng)，激活相關(guān)活性因子如NF-κB，調(diào)控相關(guān)炎癥的基因表達，激活特異性免疫系統(tǒng)，抑制相關(guān)炎癥因子的釋放，從而起到抗炎等治療效果，其與王志國[4]、張志鵬[5]和高升[6]等人通過大鼠動物實驗推測與調(diào)節(jié)機體免疫功能有關(guān)相吻合。

綜上所述，本研究通過運用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的研究方法，對當(dāng)歸芍藥散治療慢性盆腔炎的作用機制進行探討，結(jié)果表明：當(dāng)歸芍藥散活性成分山柰酚、β-谷甾醇等活性成分可能通過TNF、Toll樣受體等信號通路作用于PTGS2、TNF-α、JUN、IL-6等關(guān)鍵靶標(biāo)基因進而發(fā)揮其臨床功效，達到治療慢性盆腔炎等疾病的目的。分析結(jié)果與近年來基礎(chǔ)研究及臨床研究結(jié)果具有高度的一致性，具有一定的參考和提示價值，將為本課題組進一步深入設(shè)計實驗研究當(dāng)歸芍藥散抗炎抗菌、調(diào)控機體免疫力等復(fù)雜效用機制奠定基礎(chǔ)，也為其它復(fù)雜成分方藥的研究提供一定的方法學(xué)參考。

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