鐘森杰　李欣春　李琳　胡志?！『?jiǎn)維雄　周瑤　姚濤　楊夢(mèng)

〔摘要〕 目的 研究參麥注射液對(duì)高血壓心衰大鼠血漿代謝組學(xué)的影響。方法 通過(guò)8%NaCl高鹽飼料喂養(yǎng)Dahl鹽敏感性大鼠制造高血壓心衰模型，成模大鼠分為模型組、參麥注射液組，并同時(shí)設(shè)置正常組，干預(yù)15 d后，采集正常組、模型組和參麥注射液組大鼠的血漿樣本，運(yùn)用氣相色譜-質(zhì)譜（GC-MS）聯(lián)用技術(shù)及多元統(tǒng)計(jì)分析進(jìn)行研究。結(jié)果 3組的代謝圖譜存在顯著差異。與正常組相比，模型組19種代謝物水平紊亂;經(jīng)參麥注射液干預(yù)后，亮氨酸、鳥(niǎo)氨酸、丙氨酸、4-羥基-脯氨酸、蘇氨酸、天冬酰胺、蘇糖醇、丙酮酸、尿素濃度向正常方向顯著回調(diào)，蘇糖酸、半胱氨酸、色氨酸、甲基半胱氨酸、花生四烯酸、膽固醇、木糖醇、核糖醇、焦谷氨酸、丙二酸濃度無(wú)顯著改變，此外還發(fā)現(xiàn)異亮氨酸濃度上升。結(jié)論 高血壓心衰大鼠血漿代謝組學(xué)出現(xiàn)變化，參麥注射液能有效改善部分紊亂的代謝物水平，其作用機(jī)制與改善糖代謝、氨基酸代謝紊亂，調(diào)節(jié)支鏈氨基酸水平相關(guān)，未發(fā)現(xiàn)有改善脂代謝紊亂的作用。

〔關(guān)鍵詞〕 心力衰竭;高血壓;參麥注射液;代謝組學(xué)

〔中圖分類號(hào)〕R285.5;R541.3? ? ? ?〔文獻(xiàn)標(biāo)志碼〕A? ? ? ?〔文章編號(hào)〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2019.09.004

Effects of Shenmai Injection on Plasma Metabolomics in Rats with Hypertensive Heart Failure

ZHONG Senjie1， LI Xinchun2， LI Lin1， HU Zhixi1*， JIAN Weixiong1*， ZHOU Yao1， YAO Tao1， YANG Meng1

（1. Hunan University of Chinese Medicine， Changsha， Hunan 410208， China; 2. Changsha Jinrun

Hospital of TCM， Changsha， Hunan 410014， China）

〔Abstract〕 Objective To study the effects of Shenmai Injection on plasma metabolomics in rats with hypertensive heart failure. Methods The hypertensive heart failure model was established by continuously feeding Dahl salt-sensitive rats with 8% NaCl diet. After modeling， the rats were randomly divided into model group， Shenmai Injection group and normal group. After 15 d of intervention， plasma samples of the normal group， the model group， and the Shenmai Injection group were collected， and gas chromatography-mass spectrometry （GC-MS） coupling technique and multivariate statistical analysis were applied for the study. Results There were significant differences in metabolic patterns of the 3 groups. Compared with the normal group， there were disorders in the levels of 19 metabolites in the model group; the concentrations of leucine， ornithine， alanine， 4-hydroxy-proline， threonine， asparagine， threitol， pyruvic acid and urea intervened by Shenmai Injection were significantly back-regulated towards the normal level， and there were no significant differences in the concentrations of threonic acid， cysteine， tryptophan， methyl cysteine， arachidonic acid， cholesterol， xylitol， ribitol， pyroglutamic acid and malonic acid. In addition， it was found that the concentration of isoleucine was increased. Conclusion The changes of plasma metabolomics in heart failure rats with hypertension indicates that Shenmai Injection can effectively improve the levels of some disordered metabolites. The mechanism of Shenmai Injection is related to the improvement of disorders in glucose metabolism and amino acid metabolism， and the regulation of the levels of branched chain amino acid， but no improvement of lipid metabolism disorder is found.

〔Keywords〕 heart failure; hypertension; Shenmai Injection; metabolomics

心衰是各種心臟疾病的終末期，具有并發(fā)癥多、致死率高的特點(diǎn)，為21世紀(jì)最重要的慢性心血管病癥[1]。高血壓病作為常見(jiàn)的心血管疾病，是心衰的高危因素，最新臨床流行病學(xué)調(diào)查[2]顯示：男性39%和女性59%的心衰發(fā)生可歸因于高血壓。高血壓患者由于血壓長(zhǎng)期增高，導(dǎo)致血管壁、心臟壓力負(fù)荷增大，引起血管平滑肌增生及心肌纖維化等一系列病理變化，最終導(dǎo)致心臟等靶器官損害，收縮和舒張功能降低，從而引發(fā)心衰[3-4]。

前期研究發(fā)現(xiàn)，參麥注射液能有效改善高血壓心衰大鼠的心功能、血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)和心肌組織形態(tài)，展現(xiàn)出良好的治療效果[5]。本實(shí)驗(yàn)利用氣相色譜-質(zhì)譜（GC-MS）聯(lián)用技術(shù)及多元統(tǒng)計(jì)分析，從生物學(xué)角度探討參麥注射液治療心衰的作用機(jī)制，為心衰的治療提供新思路。

1 材料與方法

1.1? 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

雄性Dahl鹽敏感性大鼠25只，體質(zhì)量（220±10）g，北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供（合格證編號(hào)：11400700134072），湖南中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心SPF級(jí)實(shí)驗(yàn)室內(nèi)飼養(yǎng)。

1.2? 主要藥物與試劑

主要藥物：參麥注射液（規(guī)格：20 mL/瓶），杭州正大青春寶藥業(yè)公司生產(chǎn)（批號(hào)：1402225）。

主要試劑：甲醇（沃凱，上海）;2-氯苯丙氨酸（Aladdin，美國(guó)）;十七碳酸（Aladdin，美國(guó)）;甲氧基胺鹽酸鹽（TCI，日本）;衍生化試劑（含1%三甲基氯硅烷的BSTFA試劑，日本TCI公司提供）。

1.3? 主要儀器設(shè)備

Forma 900系列超低溫冰箱（Thermo，美國(guó)）;7890A型氣相色譜儀、5975C型質(zhì)譜儀（Agilent，美國(guó)）;BP-2010A型智能無(wú)創(chuàng)大鼠血壓計(jì)（Softron，北京）;QL-866型混勻儀（Vortex Mixer，美國(guó)）;SonoScape-S2N型彩色多普勒超聲診斷儀（開(kāi)立，深圳）;H1650-W型冷凍離心機(jī)、53050型真空濃縮儀（Eppendorf，德國(guó)）。

1.4? 動(dòng)物模型制備

1.4.1? 造模方法? 隨機(jī)選取8只大鼠為正常組，其余均為造模組。根據(jù)課題組文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo)的方法[6]研制高血壓心衰大鼠模型，正常組予0.3%NaCl低鹽飼料喂養(yǎng)，造模組予8%NaCl高鹽飼料喂養(yǎng)，喂養(yǎng)20周。

1.4.2? 模型評(píng)價(jià)? 每15天測(cè)量一次大鼠鼠尾血壓，發(fā)現(xiàn)造模組自喂食高鹽飼料后，其鼠尾血壓一直大于140 mmHg，確定已成高血壓模型;而正常組血壓基本維持在140 mmHg以下，尚未達(dá)到高血壓診斷指標(biāo)，難以構(gòu)成心臟器質(zhì)性病變。喂養(yǎng)20周后，造模組大鼠死亡2只，對(duì)兩組大鼠進(jìn)行超聲心動(dòng)圖檢查和血清氨基末端腦鈉肽前體（N Terminal-pro brain natriuretic peptide， NT-proBNP）含量檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)與正常組相比，造模組左心室射血分?jǐn)?shù)（left ventricular ejection fraction， LVEF）、左室短軸縮短率（fraction shortening， FS）、NT-proBNP含量均有顯著差異，具體見(jiàn)表1。參照本課題組的文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo)[5-6]，評(píng)定造模組大鼠模型成立。

1.5? 分組給藥

造模成功大鼠15只，按隨機(jī)數(shù)字表法分為模型組（7只）和參麥注射液組（8只）。經(jīng)過(guò)人與動(dòng)物等效劑量換算（人體質(zhì)量60 kg），參麥注射液組的每次給藥劑量為6.0 mL/kg，每天1次，通過(guò)腹腔注射方式給藥，給藥15 d。

1.6? 血漿樣本采集

對(duì)所有大鼠進(jìn)行腹主動(dòng)脈取血，取血完畢后常溫靜置20 min，4 ℃、3 500 r/min離心10 min，提取上清液，保存于-80 ℃冰箱中。

1.7? GC-MS檢測(cè)

實(shí)驗(yàn)時(shí)將所有樣本在4℃下融化，每個(gè)樣本各取100 ？滋L于1.5 mL離心管，進(jìn)行預(yù)處理：（1）加入400 ？滋L甲醇，振蕩60 s;（2）加入內(nèi)標(biāo)（60 ？滋L 2-氯苯丙氨酸、60 ？滋L十七碳酸），渦旋振蕩60 s;（3）4 ℃、12 000 r/min離心10 min，取上清液至新離心管中，并用真空離心濃縮儀濃縮。

完成上述步驟后，對(duì)樣本進(jìn)行衍生化處理。GC-MS適用于檢測(cè)揮發(fā)性較好的代謝物，對(duì)于含有羧基、羥基、氨基等的代謝物，可以通過(guò)衍生化的方法增加其揮發(fā)性。具體步驟如下：（1）肟化處理：加入60 ？滋L甲氧基溶液，渦旋振蕩30 s，37 ℃反應(yīng)2 h;（2）硅烷化處理：加入60 ？滋L衍生化試劑，37 ℃反應(yīng)90 min;（3）4 ℃、12 000 r/min離心10 min，提取上清液，進(jìn)行GC-MS檢測(cè)。

GC-MS條件：氣相色譜采用HP-5MS毛細(xì)管柱以1 mL/min的恒流氦氣來(lái)分離衍生化物質(zhì)，1 ？滋L樣品以分流比20∶1的方式通過(guò)自動(dòng)進(jìn)樣器注入。注射溫度為280 ℃，接口設(shè)置為150 ℃和離子源調(diào)整到230 ℃。升溫程序以60 ℃為初始溫度，持續(xù)2 min，以10 ℃/min的速率上升到300 ℃，并在300 ℃停留5 min。質(zhì)譜采用的是范圍從35～750 m/z的全掃描方法。

1.8? 數(shù)據(jù)預(yù)處理

GC-MS分析后得到可供生物信息學(xué)分析的原始數(shù)據(jù)，通過(guò)G1701 MSD ChemStation軟件將數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)為netCDF格式（xcms輸入文件格式），利用R（v3.1.3）的XCMS程序包進(jìn)行峰識(shí)別、峰過(guò)濾、峰對(duì)齊，獲得包括質(zhì)核比、保留時(shí)間及峰面積等信息的數(shù)據(jù)矩陣。參照NIST商業(yè)數(shù)據(jù)庫(kù)和Wiley Registry代謝組數(shù)據(jù)庫(kù)，結(jié)合AMDIS程序注釋代謝物。

1.9? 統(tǒng)計(jì)分析方法

應(yīng)用SIMCA-P（v13.0）軟件，組間模式識(shí)別采用主成分分析（PCA）和偏最小二乘判別分析（PLS-DA），根據(jù)結(jié)果構(gòu)建相應(yīng)的得分圖。差異代謝物的篩選采用正交-偏最小二乘判別分析（OPLS-DA），根據(jù)OPLS-DA模型的VIP值（第一主成分變量重要性值），結(jié)合單因素方差分析的P值，以VIP值>1且P<0.05為條件進(jìn)行篩選。

2 結(jié)果

2.1? GC-MS分析

3組大鼠GC-MS代表性總離子流色譜圖（Total lon chromatography， TIC）如圖1所示。將各組TIC導(dǎo)入數(shù)據(jù)庫(kù)選擇出匹配度較好的內(nèi)源性代謝物85種，進(jìn)行后續(xù)的多元統(tǒng)計(jì)分析（PCA、PLS-DA、OPLS-DA）。

2.2? 模式識(shí)別

通過(guò)PCA和PLS-DA分析后，得到相應(yīng)的得分圖，見(jiàn)圖2。得分圖中每一點(diǎn)代表一個(gè)樣本的代謝成分積分點(diǎn)，越靠近的樣本點(diǎn)，表明兩者之間代謝差異越小;越遠(yuǎn)離的樣本點(diǎn)，表明兩者之間代謝差異越大。PCA得分圖和PLS-DA得分圖顯示3組的樣本點(diǎn)雖有交叉點(diǎn)，但仍能看出在空間分布上明顯分開(kāi)，分離程度較好，表明3組間的代謝模式存在差異。

2.3? 差異代謝物篩選

通過(guò)OPLS-DA對(duì)組間差異代謝物進(jìn)行分析，結(jié)合單因素方差分析的結(jié)果，確定以下19種代謝物對(duì)模型組和正常組的分類貢獻(xiàn)較大，同時(shí)通過(guò)KEGG通路數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//www.genome.jp/kegg/pathway.html）明確與其相關(guān)的代謝途徑。利用這19種代謝物作為潛在的藥物靶標(biāo)，發(fā)現(xiàn)參麥注射液組中9種代謝物水平向正常方向回調(diào)，其余10種代謝物水平無(wú)顯著變化，此外還發(fā)現(xiàn)異亮氨酸濃度上升。具體見(jiàn)表2。

3 討論

參麥注射液源自古方生脈散，主要成分為人參和麥冬的提取物，具有益氣復(fù)脈、養(yǎng)陰生津的功效，臨床上應(yīng)用于心衰等眾多心血管疾病的治療[7]?，F(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)，參麥注射液對(duì)心衰的作用機(jī)制與改善心肌舒縮功能和血流動(dòng)力學(xué)、調(diào)控神經(jīng)內(nèi)分泌及細(xì)胞因子、改善心肌復(fù)極、改善心率變異性等有關(guān)，表現(xiàn)出多靶點(diǎn)的作用特點(diǎn)。代謝組學(xué)致力于考察生物體在不同狀態(tài)下內(nèi)源性代謝產(chǎn)物種類、數(shù)量及變化規(guī)律，從而揭示代謝物與病理生理、藥物作用的關(guān)聯(lián)性。代謝組學(xué)技術(shù)的發(fā)展，為探索參麥注射液治療心衰的作用機(jī)制提供了新的工具和方法，有望發(fā)現(xiàn)新的治療靶點(diǎn)。

與正常組比較，模型組血漿中有19種代謝物水平出現(xiàn)明顯變化，可能為該模型的生物標(biāo)志物。在此基礎(chǔ)上，利用這些差異代謝物作為潛在的藥物靶標(biāo)進(jìn)一步研究參麥注射液的作用機(jī)制。結(jié)果發(fā)現(xiàn)與模型組比較，參麥注射液組血漿中有9種代謝物水平向正常方向顯著回調(diào)和異亮氨酸濃度上升，提示參麥注射液對(duì)部分代謝紊亂的調(diào)節(jié)作用，可能是其治療心衰的作用機(jī)制之一。

現(xiàn)代研究表明，正常心臟主要依靠脂肪酸、葡萄糖和乳酸氧化供能，氨基酸的供能只占總能量的1%，心肌供能的變化可直接或間接導(dǎo)致心衰，這一過(guò)程被稱為“代謝重構(gòu)”[8]。模型組出現(xiàn)顯著的氨基酸代謝紊亂，是因?yàn)樾乃r(shí)機(jī)體的脂、糖代謝氧化供能障礙，需要?jiǎng)訂T氨基酸代謝以增強(qiáng)供能[9]。本研究發(fā)現(xiàn)參麥注射液對(duì)氨基酸代謝紊亂具有調(diào)節(jié)作用，主要體現(xiàn)在鳥(niǎo)氨酸、丙氨酸、4-羥基-脯氨酸、蘇氨酸、天冬酰胺水平下調(diào)，以及亮氨酸、異亮氨酸水平上調(diào)。

亮氨酸、異亮氨酸屬于支鏈氨基酸（BCAAs），具有重要的供能作用。有研究[10]認(rèn)為BCAAs在心肌應(yīng)激時(shí)能加速分解以供給能量，促進(jìn)心肌的蛋白質(zhì)合成，減輕心肌的應(yīng)激損傷;趙曉麗等[8]發(fā)現(xiàn)BCAAs對(duì)衰竭心臟具有保護(hù)作用，主要作用機(jī)制與促進(jìn)衰竭心臟的蛋白質(zhì)合成、加強(qiáng)心臟的糖異生、調(diào)節(jié)心肌能量代謝等相關(guān)，并認(rèn)為給予機(jī)體適度補(bǔ)充BCAAs可以增加衰竭心臟的心肌能量供應(yīng)、改善心功能。本研究發(fā)現(xiàn)參麥注射液組的亮氨酸、異亮氨酸水平上調(diào)，提示該藥物通過(guò)調(diào)節(jié)BCAAs起到保護(hù)衰竭心臟的作用。

丙酮酸是糖酵解途徑的產(chǎn)物，其水平異常提示模型組大鼠處于無(wú)氧糖酵解的應(yīng)急代謝狀態(tài)，能量代謝效率降低[11]。丙氨酸可通過(guò)糖異生途徑轉(zhuǎn)化為葡萄糖，蘇糖醇為多元醇類代謝物，可通過(guò)不同途徑參與到糖類代謝中。上述代謝物的水平異常反映了模型組大鼠的糖代謝紊亂存在。參麥注射液組中丙氨酸、丙酮酸、蘇糖醇水平顯著回調(diào)，提示參麥注射液能有效調(diào)節(jié)糖代謝功能，機(jī)體的糖異生、糖酵解等代謝功能被過(guò)度激活的應(yīng)急代謝狀態(tài)得到改善。

花生四烯酸是人體中分布最廣的多不飽和脂肪酸，具有酯化膽固醇、增加血管彈性等作用[12];膽固醇作為體內(nèi)最豐富的類固醇化合物，是血脂的重要組成部分，花生四烯酸和膽固醇的水平上升提示模型組大鼠出現(xiàn)脂代謝紊亂，引起脂質(zhì)堆積[13-14]。經(jīng)參麥注射液干預(yù)后上述兩種代謝物的水平未出現(xiàn)顯著回調(diào)，提示該藥物治療心衰的作用機(jī)制可能與調(diào)節(jié)脂代謝無(wú)關(guān)。

本研究結(jié)果表明，與模型組相比，參麥注射液組的血漿代謝物水平更接近正常組。通過(guò)明確與差異代謝物相關(guān)的代謝途徑，揭示了參麥注射液對(duì)心衰的干預(yù)機(jī)制與改善糖代謝、氨基酸代謝紊亂，調(diào)節(jié)支鏈氨基酸，從而改善心臟能量代謝有關(guān)，未發(fā)現(xiàn)調(diào)節(jié)脂代謝紊亂的相關(guān)證據(jù)。

參考文獻(xiàn)

[1] 金雪娟，周京敏，葛均波.心力衰竭流行病學(xué)的研究進(jìn)展[J].中國(guó)臨床醫(yī)學(xué)，2013，20（6）：852-855.

[2] OOSTEROM-CALO R， VAN BALLEGOOIJEN A J， TERWEE C B， et al. Determinants of adherence to heart failure medication： A systematic literature review[J]. Heart Fail Reviews， 2013，18（4）：409-427.

[3] KRUEGER K， BOTERMANN L， SCHORR S G， et al. Age-related medication adherence in patients with chronic heart failure： A systematic literature review[J]. International Journal of Cardiology，2015，18（4）：728-735.

[4] 陳可冀，吳宗貴，朱明軍，等.慢性心力衰竭中西醫(yī)結(jié)合診療專家共識(shí)[J].中國(guó)中西醫(yī)結(jié)合雜志，2016，36（2）：133-141.

[5] 李欣春，梁? 昊，胡志希，等.高血壓心衰大鼠證候本質(zhì)及藥物干預(yù)研究[J].湖南中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2018，38（8）：853-857.

[6] 李欣春，梁? 昊，胡志希，等.高血壓心力衰竭大鼠動(dòng)物模型的研制[J].湖南中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2017，37（3）：245-248.

[7] 李? 盼，王? 婷，付姝菲，等.基于Meta分析的參附、參麥注射液臨床作用比較[J].中草藥，2016，47（16）：2949-2959.

[8] 趙曉麗.慢性充血性心力衰竭患者血漿支鏈氨基酸水平的臨床研究[D].西安：第四軍醫(yī)大學(xué)，2014.

[9] 鐘森杰，李欣春，李? 杰，等.心氣陰兩虛證心力衰竭大鼠血漿代謝組學(xué)研究[J].湖南中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2018，38（9）：981-985.

[10] 梁國(guó)榮，曾瑞峰，溫丹婷，等.心衰心陽(yáng)虛證血漿氨基酸（纈、苯丙、異亮、亮氨酸）代謝指紋圖譜研究[J].中華中醫(yī)藥雜志，2013，28（12）：3735-3738.

[11] 王? 歡，胡元會(huì)，孟? 浩，等.心復(fù)康口服液對(duì)心肌梗死后心力衰竭大鼠血漿代謝組學(xué)影響的研究[J].北京中醫(yī)藥，2013，32（8）：613-617.

[12] 韋藝丹，許美娟，季? 暉.花生四烯酸的ω-羥化代謝途徑與心腦血管疾病[J].中國(guó)臨床藥理學(xué)與治療學(xué)，2016，21（7）：826-833.

[13] 簡(jiǎn)維雄，左和寧，劉? 韶，等.基于代謝組學(xué)的心血瘀阻證動(dòng)態(tài)演變過(guò)程研究[J].中國(guó)中西醫(yī)結(jié)合雜志，2016，36（12）：1496-1503.

[14] 曾繁芳，王麗麗，龍? 娟，等.血漿總膽固醇水平與急性左心衰患者預(yù)后的相關(guān)性分析[J].中山大學(xué)學(xué)報(bào)（醫(yī)學(xué)科學(xué)版），2017，38（4）：556-560.