牛見明，張波，史肖，李寧寧，李宏濤，韓舜愈*

1(甘肅農業(yè)大學 食品科學與工程學院，甘肅 蘭州，730070)2(甘肅省葡萄與葡萄酒工程學重點實驗室，甘肅省葡萄與葡萄酒產業(yè)技術研發(fā)中心，甘肅 蘭州，730070)3(寧夏西夏王葡萄酒業(yè)有限公司，寧夏 銀川，750104)

葡萄酒是以葡萄或葡萄汁為原料，經(jīng)全部或部分酒精發(fā)酵釀制而成的含有一定酒度的酒精性飲料。其中葡萄酒的外觀作為消費者對其品質評價的重要參考，不僅賦予酒一定的質量特征，同時還與香氣及口感指標一同決定著葡萄酒的整體和諧程度[1-2]。通常認為葡萄酒的外觀主要由澄清度和顏色兩方面構成。此外，外觀還是判斷葡萄酒生物穩(wěn)定性的重要指標之一，成為葡萄酒生產中的關鍵控制環(huán)節(jié)[3-4]，特別對于甜型葡萄酒而言，澄清方式直接影響著葡萄酒的品質[5]。

目前，葡萄酒實際生產過程中澄清方式可分為3種：自然澄清、機械澄清和化學澄清[6]。自然澄清是指酒中的顆粒懸浮物在其重力的作用下自然下沉，從而使酒體澄清的過程，這也是近年來有機葡萄酒釀造潮中的一個研究熱點。但經(jīng)自然澄清處理的葡萄酒的澄清度及耗時是該工藝的主要缺陷[7]，因此釀酒師在自然澄清的基礎上通過添加明膠、皂土、魚膠、果膠酶、聚乙烯吡咯烷酮(polyvinyl pyrrolidone，PVPP)等澄清劑來提高澄清效果、縮短澄清時間[8-9]。不過這些方法常會因外源化學試劑的添加而導致葡萄酒產生安全性問題，例如魚膠和酪蛋白等動物源的澄清劑可能會引起人畜共患病的傳播[10]。同時，酪蛋白還可能會引起一些特殊人群的過敏反應，若使用過量不僅使酒體渾濁，甚至會產生膠味等不良氣息[11]。

機械澄清在生產中是較為常用的措施之一，該過程主要是利用適當?shù)倪^濾器、離心機等多孔膜設備進行固相物質和液相物質的分離，達到去除葡萄酒中懸浮物和微生物的效果。常用的處理方式包括低速冷凍離心、框式過濾和硅藻土過濾、錯流過濾等[12]。特別是離心和錯流過濾，有研究顯示，其在工藝優(yōu)化、提高酒體質量、安全環(huán)保等方面具有明顯的優(yōu)勢[13]。EI-RAYESS等在比較錯流過濾與其他澄清方式后發(fā)現(xiàn)，錯流過濾自動化程度高，可極大地縮短葡萄酒澄清處理時間，提高生產效率，大量節(jié)省人力和物力消耗[14]。此外，相較于一般的過濾方式，離心和錯流過濾還可對部分原酒的褐變進行控制[15]。但是，盡管目前關于錯流過濾和離心澄清的研究已有報道，而綜合比較兩者在風味品質和除菌效果等方面的研究仍很有限。因此，本試驗采用離心及錯流過濾等澄清方式，通過研究其對美樂甜型桃紅葡萄酒澄清效果、風味品質和生物穩(wěn)定性的影響，以期為葡萄酒的釀造生產及工藝優(yōu)化提供一定的數(shù)據(jù)支撐和技術參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

美樂甜型桃紅葡萄酒:實驗室自行釀造，所選葡萄為2017年甘肅省武威黃羊鎮(zhèn)莫高釀酒葡萄基地美樂品種，含糖量約為 23.3 Brix°，含酸質量濃度 7.65 g/L(以酒石酸計)；釀酒酵母(紅佳釀，Vintage Red):意大利Enartis公司；

2-辛醇(色譜純)，美國Sigma公司；H3PO4、NaOH、偏重亞硫酸鈉(均為分析純):購于天津市科密歐化學試劑有限公司；費林試劑、次甲基藍指示劑及酚酞指示劑等:均按GB/T 603-2002，《化學試劑試驗方法中所用制劑及制品的制備》進行配制。

1.2 儀器與設備

TRACE 1310氣相色譜儀,美國Thermo Scientific公司；ISQ型單四級桿質譜儀,美國Thermo Scientific公司；固相微萃取裝置,美國Surpelco公司；色譜柱DB-WAX(60 m×2.5 mm×0.25 μm)，美國Agilent Technologies公司，Genesis 10S型紫外-可見分光光度儀，美國Thermo Scientific公司；DF-Ⅱ集熱式恒溫磁力攪拌器，金壇市恒豐儀器制造有限公司；TD5A-WS臺式低速離心機，東莞康潤實驗科技有限公司；UMP-153型錯流過濾機(中空纖維膜柱，0.2 μm，8 L/h)，頗爾過濾器有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 美樂甜型桃紅葡萄酒的釀造工藝

美樂葡萄→分選、除梗、破碎→壓榨、過濾→SO2、果膠酶處理→低溫浸漬→接種酵母→酒精發(fā)酵(比重降至約1.040添加酵母多糖)→酒精發(fā)酵結束(比重約為1.020)。

美樂葡萄經(jīng)分選、除梗、破碎后進行壓榨過濾，同時添加60 mg/L SO2、20 mg/L果膠酶，在4 ℃浸漬24 h 后，室溫下回溫至16 ℃，添加200 mg/L活性干酵母，進行酒精發(fā)酵，當比重下降至1.040時添加酵母多糖，下降至1.020時，采用自然澄清(ZC)、離心(LX)、錯流過濾(GL)3種澄清方式處理，之后取樣并在低溫下密封貯存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 葡萄酒理化指標測定

總糖、總酸、揮發(fā)酸、酒精度、pH、總酚參照國家標準GB/T 15038—2006進行測定[16]。

1.3.3 色度、色調測定

參照王媛等[17]的方法并略作修改。準確吸取1 mL 酒樣用蒸餾水定容至10 mL，取稀釋后的酒樣于1 cm光程玻璃比色皿中，并以蒸餾水為對照，分別在420、520、620 nm波長處測吸光值(A)，三者之和即為該酒樣的色度值，前兩者之比即為色調值。

1.3.4 生物穩(wěn)定性測定

將1.3.1中經(jīng)3種澄清處理的葡萄酒分別裝瓶放置2個月，在此期間分別在第7、21、35、60天取樣，并測定其OD600值。

1.3.5 葡萄酒揮發(fā)性成分測定

香氣成分萃取和GC-MS檢測條件參照魯榕榕等[18]的方法。

定性分析：采用保留指數(shù)(RI)、NIST-11、Wiley及香精香料譜庫檢索對比進行定性分析。譜庫比對時要求匹配度>800。

定量分析：采用內標法進行半定量分析，內標物為2-辛醇。計算如公式(1)：

各香氣成分質量濃度/(μg·L-1)=

(1)

1.3.6 感官評價

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

利用Microsoft Office Excel 2010對試驗所得數(shù)據(jù)進行基本處理和作圖，使用IBM SPSS Statistics 20.0進行多因素方差分析(Duncan法，P<0.05)，并用Heml軟件進行熱圖分析，香氣物質含量結果均以平均值±標準偏差(mean±SD)表示。

2 結果與分析

2.1 三種澄清處理方法對美樂甜型桃紅葡萄酒理化指標的影響

葡萄酒的理化指標是衡量葡萄酒質量好壞的最基本尺度，通常包括酒精度、殘?zhí)?、總酸和揮發(fā)酸等[20]。從表1數(shù)據(jù)可知，自然澄清(ZC)、離心(LX)、錯流過濾(GL)3種處理的酒樣其總糖質量濃度均>45 g/L，符合甜型葡萄酒的含糖要求。同時，與ZC相比，LX和GL處理后其酒精度和揮發(fā)酸分別降低1.81%～2.11%和11.11%～13.89%，并產生顯著影響(P<0.05)?？紤]這可能是由于離心產熱，以及錯流過濾的多管道循環(huán)造成的。葡萄酒的pH和總酸指標可反映其氫離子含量與酸濃度的高低水平，并進而對酒的穩(wěn)定性和感官質量起重要作用。由試驗結果可知(表1)，3種澄清方式對總酸、pH作用較小，但對供試酒樣的顏色影響較大。同ZC相比，經(jīng)LX、GL操作后葡萄酒色調值依次減小，其中錯流過濾對葡萄酒色調影響更為顯著(P<0.05)，這可能是由于離心與錯流過濾過程降低了葡萄酒的氧化褐變，使酒體顏色更偏向于紅色色調，這與本試驗中感官分析結果相吻合。色度主要反映酒體的顏色強度，其中經(jīng)錯流過濾后酒樣的色度值最小，并與總酚含量變化趨勢一致，這可能是因為葡萄酒中的某些花色苷酚在經(jīng)膜過濾時被膜柱上的極性基團吸附，使得葡萄酒中總酚含量降低，色度值減小造成的[3]。

表1 各處理酒樣的基本理化指標Table 1 Basic physical and chemical indicators of each treated wine sample

注:表中ZC表示自然澄清處理酒樣；LX表示離心處理酒樣；GL表示錯流過濾處理酒樣。不同字母代表差異顯著(P<0.05)。下同。

2.2 三種澄清處理方法對美樂甜型桃紅葡萄酒生物穩(wěn)定性的影響

由于甜型葡萄酒含糖量≥45 g/L[16]，酒中殘留的微生物可能在其儲存過程中進行發(fā)酵，降低瓶內生物穩(wěn)定性，從而影響葡萄酒品質與安全[21]。本試驗通過測定2個月內葡萄酒OD600值的變化來反映其生物穩(wěn)定性。由圖1可知，在第0天時，3種澄清處理的酒體均為澄清狀態(tài)，隨著儲存時間的延長，在第7天時，ZC處理的酒中出現(xiàn)少量絮狀沉淀，其他2種處理盡管OD600值有小幅增加，但酒樣外觀沒有明顯變化。貯存第21天后，ZC處理酒樣中出現(xiàn)明顯渾濁，此時，LX處理樣品也開始產生少量絮狀沉淀，但GL處理的葡萄酒狀態(tài)依然透明澄清。當貯藏結束時(第60天)，3種處理的酒體澄清度有顯著差異，ZC和LX處理的葡萄酒中在其底部可觀察到明顯的酒泥沉淀，這主要是因為自然澄清和過濾操作除菌效果較差，未去除的酵母在酒中繼續(xù)代謝引起的。另外，本試驗還發(fā)現(xiàn)，經(jīng)GL處理的葡萄酒雖不能達到完全除菌的效果(在儲存的60 d內，OD600從最初0.021 增加到0.053)，但這并不影響葡萄酒整體的澄清度。綜上，3種澄清處理方式下葡萄酒的生物穩(wěn)定性差異顯著(P<0.05)，其中錯流過濾效果最佳。

圖1 各處理酒樣OD600值的變化Fig.1 Changes in OD600 values of various treated wine samples注：圖中不同小寫字母代表差異顯著。下同。

2.3 三種澄清處理方法對美樂甜型桃紅葡萄酒香氣的影響

香氣是評價葡萄酒品質的重要指標之一[22-23]，本試驗采用頂空固相微萃取結合氣相色譜-質譜聯(lián)用(HS-SPME/GC-MS)技術對3種澄清方式處理酒樣的香氣物質進行分析，試驗共檢出70種香氣物質(圖2)，其中醇類17種(約占香氣總量的24.29%)，酯類28種(約占香氣總量的40%)，酸類12種(約占香氣總量的17.14%)，萜烯類7種(約占香氣總量的10%)，其他類6種(約占香氣總量的8.57%)。

圖2 各處理酒樣香氣成分比較Fig.2 Comparison of aroma components of each treated wine sample注：圖中柱形圖表示香氣物質含量；折線圖表示香氣物質種類。

由圖2可知，ZC處理酒樣的香氣物質含量最高、種類最多，GL處理酒樣的香氣物質含量最低、種類最少。與ZC處理相比，LX和GL處理的酒樣香氣物質總量分別降低了34.99%和66.82%，并且不同物質下降幅度也有差異，其中醇類物質含量下降較多(分別為1.20和2.21 mg/L)，酯類、酸類、萜烯類物質含量下降較小(分別為0.28～0.59 mg/L、0.19～0.30 mg/L、0.02 ～0.14 mg/L)。LX和GL處理除對香氣物質含量影響較大外，經(jīng)LX和GL處理后香氣物質種類也分別減少18和22種，如2-壬醇、丙酸異戊酯、肉豆蔻酸異丙酯、壬酸等某些含量較低的香氣物質只出現(xiàn)在ZC處理的葡萄酒中，這可能是因為自然澄清、離心和錯流過濾3種澄清方式使發(fā)酵結束后的葡萄酒中的香氣物質的種類與含量進行重新分配，進而形成了各自不同的香氣品質。

2.3.1 醇類化合物

醇類化合物是酵母菌的次級代謝產物，是葡萄酒的主要香氣物質之一[24]，在酒精發(fā)酵過程中由糖代謝、氨基酸脫羧和脫氫產生，其含量受發(fā)酵條件、原料品質以及產品后處理等因素的影響[25-26]。由表2可以看出，經(jīng)ZC、LX和GL三種處理之后，其含量和種類依次減少，GL處理酒樣減少幅度最大。自然澄清處理的葡萄酒中醇類含量為2 873.86 μg/L，相比于LX和GL，分別顯著高出41.89%和77.94%(P<0.05)。本試驗還發(fā)現(xiàn)3種處理酒樣中個別物質含量也存在明顯差異，如2-壬醇等含量較低的高級醇類物質只出現(xiàn)在自然澄清的酒樣中，同時1-戊醇和正己醇等具有生青味的醇類化合物含量下降幅度較大，這減少了其帶給葡萄酒的負面影響。

表2 各處理酒樣醇類化合物的變化Table 2 Changes of alcohol compound in each treated wine

注：顯著性差異為同一因素下的3個水平在P<0.05 時的比較，不同字母表示具有顯著性差異； “-”表示樣品中未檢出該物質，表示未查閱到相關文獻。下同。

2.3.2 酯類化合物

酯類化合物是葡萄酒中最主要的揮發(fā)性化合物，由酵母代謝以及酒中的酯化反應產生，并賦予葡萄酒花香和果香[27-28]。分析表3可知，本試驗在3種處理酒樣中分別檢測出28種(ZC)、22種(LX)和16種(GL)酯類化合物。其中反式-3-己烯酸乙酯、肉豆蔻酸異丙酯等一些不常見的酯類化合物在LX和GL的酒樣中未被檢出。自然澄清處理的葡萄酒中酯類化合物總量為1 307.86 μg/L，而離心和過濾處理的酒樣分別降低了21.99%和45.87%，類似的變化趨勢在ARRIACADA-CARRAZANA等[1]的研究中也有報道?？紤]這可能是由于膜柱對酒中揮發(fā)性物質的吸附造成的。在3種處理中貢獻較大的酯類物質有乙酸異戊酯、己酸乙酯、辛酸乙酯、癸酸乙酯和乙酸乙酯，它們賦予了葡萄酒一定的果香[18]，與ZC相比，LX和GL處理酒樣中這些酯類物質分別降低了25.98%～64.07%、0.38%～8.07%、2.89% ～34.41%、27.06%～50.57%和9.56%～19.31%，這與本試驗感官分析結果中果香風味下降幅度較大相對應。

2.3.3 酸類化合物

葡萄酒中的脂肪酸類化合物主要是釀酒酵母和乳酸菌在發(fā)酵過程中代謝的副產物，這些化合物具有油脂、酸腐以及奶酪的氣息，當含量過高時，會給葡萄酒帶來不良的影響[23-24]。分析表4可知，ZC處理酒樣中酸類香氣物質的種類和含量均多于LX和GL處理酒樣，與ZC處理相比，經(jīng)LX和GL處理后的酸類香氣物質含量分別下降了33.33%和41.67%，且3種處理后的酸類香氣物質總量之間均具有顯著性差異(P<0.05)，這與3種處理酒樣的揮發(fā)酸含量趨勢一致，這可能是因為兩者同具有揮發(fā)性，故因其性質上的相似性從而對機械處理呈現(xiàn)出相似的差異趨勢。試驗中檢出的含量最高的酸類香氣物質為辛酸，其可賦予葡萄酒奶酪和奶油的氣味，但當其濃度過高時則會出現(xiàn)腐敗和刺激味等異味[22]，這在感官分析中也有一定程度的體現(xiàn)。

表3 各處理酒樣酯類化合物的變化Table 3 Changes of ester compounds in each treated wine

表4 各處理酒樣酸類化合物的變化Table 4 Changes of acid compound in each treated wine

2.3.4 萜烯類化合物

萜烯類化合物作為葡萄酒的品種香氣，主要以鍵合態(tài)的形式存在，釀造過程中在糖苷酶的作用下分解為游離態(tài)的香氣物質被逐漸釋放到葡萄酒中，同時賦予了葡萄酒濃郁的花香和果香[29-30]。其中芳樟醇和反式-橙花醇具有玫瑰花香和果香[31]，是葡萄酒較為重要的特征香氣物質，由表5可知，經(jīng)機械處理后3種單萜類化合物含量均在減少，并且ZC、LX、GL三種處理間單萜類化合物含量具有顯著差異，而其他4種非單萜類萜烯化合物含量變化相對較小，這主要是因為單萜化合物相對分子質量小，揮發(fā)性比其他4種萜烯高，因而在LX和GL過程中損失較大。但這些物質均為葡萄酒中典型的萜烯類化合物，并賦予葡萄酒強烈的花果香氣，增強了酒體香氣的復雜性。

表5 各處理酒樣萜烯類化合物的變化Table 5 Changes of terpenoid in each treated wine

2.4 香氣化合物聚類熱圖分析

為了進一步探討3種澄清處理對美樂甜型葡萄酒香氣化合物的影響，我們將3種處理酒中檢測出的所有香氣物質進行熱圖聚類分析(圖3)。其中圖右側的顏色條帶梯度一一對應著左邊的香氣物質的種類及其含量，用以解釋香氣物質的分布。從圖中變化可以看出，經(jīng)3種澄清處理的葡萄酒香氣成分有明顯差異(根據(jù)熱圖分析可分為自然澄清以及離心和錯流過濾兩大類)。圖中顏色由深色到淺色表明經(jīng)3種澄清處理酒中香氣化合物的含量和種類依次減少，因此可初步將所考察的香氣物質分為 Ⅰ(A9-B10)、Ⅱ(B13-B28)和Ⅲ(C1-B20)3個系列。數(shù)據(jù)分析可知，Ⅰ系列多以癸酸乙酯、乙酸乙酯、1-壬醇、香葉醇等具有水果香味的化合物為主，與ZC相比，LX處理保留了大量的此類物質成分，但GL則會引起較多損失；Ⅱ系列主要是以乙酸苯乙酯、β-大馬士酮、β-紫羅蘭酮、2-壬醇等具有花香和植物氣息的物質居多，不過經(jīng)過處理后發(fā)現(xiàn)，兩種機械方式間并未有明顯的差別；而分析以辛酸乙酯、反式-橙花叔醇、芳樟醇、辛酸等為代表的Ⅲ系列(具有花果、動物香味)后發(fā)現(xiàn)，GL處理會顯著降低此類香氣的含量，但LX卻不會產生明顯影響。

綜上，ZC處理酒樣深色部分所占比例最多，表明此種處理對香氣物質的保留具有較好的作用。而經(jīng)機械處理后的樣品香氣物質在種類和含量均有所降低，特別是GL處理，其對香氣物質的影響最大(圖3淺色部分所示)?？紤]這可能與錯流作用時，濾膜對香氣物質較高的吸附以及截留效果有關。這也與我們在試驗過程中觀察到的GL樣品具有較低的色度，以及較高的生物穩(wěn)定性相對應。但有關錯流過濾對香氣物質具體的作用機制仍需做進一步的研究。

圖3 各處理酒樣香氣化合物聚類熱圖Fig.3 Cluster heat map of aroma samples of various treated wine samples注：A為醇類，B為酯類，C為酸類，D為萜烯類；-1～1表示化合物的含量從低到高一次增大。

2.5 三種澄清處理方法對美樂甜型桃紅葡萄酒的感官影響

圖4為3種澄清處理酒樣感官分析雷達圖。從圖4可以看出，經(jīng)3種處理后的酒樣在異味、甜味、酸味、酒體、余味長短之間無較大差異。從外觀分析可知，LX和GL的酒樣澄清度明顯高于ZC處理，其中GL處理澄清度最高，LX次之。然而顏色強度具有不同程度的減弱，這主要與錯流過濾時膜柱的吸附有關，當葡萄酒樣經(jīng)過膜柱時，膜柱在吸附大顆粒懸浮物的同時，也會吸附一些大分子酚類物質，從而使酒樣的色度值下降，顏色強度減弱。ARRIAGADA-CARRAZANA等[1]研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)膜過濾的酒樣在顏色強度和多酚分布中呈顯著的降低，這與本試驗的研究結果一致。從香氣方面來看，ZC處理的酒樣其香氣的濃郁度和復雜性比較顯著，并且花香、果香味較為豐富，但存在香氣特征不突出的問題，而經(jīng)GL和LX處理的酒樣的香氣特征明顯，尤其是經(jīng)錯流過濾后的酒樣其香氣更加純正、優(yōu)雅。

圖4 感官分析雷達圖Fig.4 Radar chart of sensory analysis注：圖中0～8為各指標的得分高低，表示感覺強烈程度逐漸增大。

3 結論

本試驗研究了自然澄清、離心和錯流過濾3種澄清方式對美樂甜型桃紅葡萄酒澄清效果和揮發(fā)性品質的影響，結果表明：

(1) 3種澄清方式處理葡萄酒樣其基本理化指標均符合國標要求，其中錯流過濾處理酒樣澄清效果最好；

(2)錯流過濾雖不能達到完全除菌的效果，但在60 d的貯藏過程中其生物穩(wěn)定性要高于離心和自然澄清處理。

(3)GC-MS分析發(fā)現(xiàn)，自然澄清處理酒樣中檢出的香氣物質含量最高、種類最多，錯流過濾處理酒樣的香氣物質則相對較少，含量較低。結合感官數(shù)據(jù)表明，盡管自然澄清處理的葡萄酒香氣濃郁、復雜，但錯流過濾處理則會使樣品香氣變得純正、優(yōu)雅。