龔婷婷，陸震鳴，耿燕，龍榮，王海湘，石小和，史勁松，許正宏*

1(江南大學(xué) 藥學(xué)院，江蘇 無錫，214122) 2(糧食發(fā)酵工藝與技術(shù)國家工程實驗室(江南大學(xué))，江蘇 無錫，214122)3(江南大學(xué) 生物工程學(xué)院，江蘇 無錫，214122) 4(湖南未來藥源藥業(yè)有限公司，湖南 長沙，410013)

我國傳統(tǒng)釀造食醋主要以糯米、高粱或甘薯等淀粉含量較高的糧谷類為原料，采用多菌種天然開放式發(fā)酵工藝釀造而成，具有獨特的風(fēng)味。陳釀具有柔和醋液酸感，增加產(chǎn)品風(fēng)味品質(zhì)的作用，是傳統(tǒng)食醋生產(chǎn)過程中必要的一道工序。在天然陳釀過程中，醋液里會不斷產(chǎn)生一類膏狀沉淀物，被稱為醋膏、醋腳、醋泥等。也有企業(yè)將醋液在高溫下進行濃縮，從而加速醋膏形成與提高醋膏出率。在中醫(yī)藥領(lǐng)域，醋膏則主要是指利用食醋炮制中藥材后形成的膏劑。

與食醋受微生物污染后可能產(chǎn)生的黏性沉淀不同，醋膏不僅具有良好的醋香風(fēng)味、入口融化的口感，而且對人體具有一定的保健功效。日本學(xué)者對傳統(tǒng)黑醋kurozu的醋膏進行了較為全面的評價，發(fā)現(xiàn)其具有抗腫瘤[1-2]，降血糖[3]，降血脂[4-5]，抗過敏[6-7]，抗結(jié)腸炎[8]，抗血栓[9]，抗骨質(zhì)疏松[10]，等活性。醋膏在我國民間具有長期的服用歷史，但是對其藥理研究尚不深入。2015年劉蘭濤等[11]發(fā)現(xiàn)山西老陳醋醋泥凍干粉對高脂飲食小鼠具有顯著的降血脂和抗氧化作用，這種有益作用可能歸功于其含有的多糖、類黑精、多肽、膳食纖維、總多酚、總黃酮和川芎嗪等活性物質(zhì)。

本研究對谷物醋醋膏的多糖含量及其單糖組成、多肽含量及其氨基酸組成進行分析，并將其與醋液中乙醇沉淀出來的大分子物質(zhì)進行比較，從而明確醋膏中多糖和多肽類生物大分子的組成，以及明確其與醋液中多糖和多肽之間的區(qū)別，探討構(gòu)效關(guān)系，以期為促進醋膏資源的開發(fā)利用奠定研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

谷物醋樣品取自國內(nèi)某傳統(tǒng)食醋釀造企業(yè)，已在儲罐中陳釀2個月，總酸為6.7 g/100 mL。將谷物醋10 000 r/min離心10 min后取上清作為醋液，離心后的沉淀與谷物醋儲罐中的沉淀合并為濕醋膏。

氨基酸混合標(biāo)準(zhǔn)溶液等購買自美國Sigma公司；巖藻糖、鼠李糖、阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、木糖、甘露糖、果糖、半乳糖醛酸、葡萄糖醛酸、氨基葡萄糖等11種單糖標(biāo)準(zhǔn)品、鄰苯二甲酸氫鉀等購買自國藥集團化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

高速冷凍離心機(CR21)，株式會社日立制作所；酶標(biāo)儀(SpectraMax M2e)，上海美譜達儀器有限公司；pH臺式儀(Orion 410P-01A)，上海梅特勒-托利多儀器有限公司；高效液相色譜儀(Agilent 1260)，美國安捷倫公司；離子色譜儀(ICS-5000)，美國戴安公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 醋液醇提物的制備

在醋液中緩慢加入3倍體積的無水乙醇(乙醇體積分?jǐn)?shù)75%[12])，4 ℃平衡2 h后經(jīng)過離心分離沉淀，50 ℃烘干后計算得率。

1.3.2 水分的分析

參照《食品中水分的測定GB 5009.3—2010》測定濕醋膏和醋液醇沉物的水分含量[13]。

1.3.3 多糖含量及其組成分析

采用苯酚硫酸法測定醋膏及醋液醇沉物中的粗多糖含量[14]。采用修改后的離子色譜法分析醋膏及醋液醇沉物中的單糖組成[15]。在醋膏及醋液醇沉物加入5 mL 2 mol/L HCl溶液，96 ℃水浴提取5～6 h，再加入一定體積的5 mol/L NaOH溶液中和并定容至10 mL，12 000 r/min離心10 min。將上清稀釋一定倍數(shù)，用0.45 μm微孔濾膜過濾后進樣分析。以巖藻糖、鼠李糖、阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、木糖、甘露糖、果糖、半乳糖醛酸、葡萄糖醛酸、氨基葡萄糖共11種單糖為標(biāo)準(zhǔn)品。采用CarboPac PA20分離，用脈沖安培法檢測，流速為0.5 mL/min。流動相A為水，B為250 mmol/L NaOH，C為1 mol/L NaAc，程序如下：0～21 min，97.4% A，2.6% B；21～30 min，97.4%～92.4% A，2.6% B，5%～20% C；30～50 min，20% A，80% B。

1.3.4 多糖中硫酸基含量的測定

采用氯化鋇明膠比濁法[16]測定醋膏與醋液多糖中的硫酸基含量。

1.3.5 多肽含量及其水解氨基酸組成分析

參照GB 5009.5—2016《食品中蛋白質(zhì)的測定》測定醋膏及醋液醇沉物中的粗多肽含量[17]。用柱前衍生化反向高效液相色譜法(RP-HPLC)對醋膏及醋液醇沉物中多肽的氨基酸組成進行分析[18]。取一定量醋膏、醋液醇沉物，加8 mL 6 mol/L HCl，充氮氣后封管，120 ℃水解22 h，于25 mL容量瓶中加入一定體積10 mol/L的NaOH溶液進行中和定容，雙層濾紙過濾，10 000 r/min離心10 min，取400 μL上清液進行HPLC測定。色譜柱采用Agilent Hypersil ODS柱(5 μm，4.0 mm×250 mm)，柱溫為40 ℃，檢測波長338 nm/262 nm。流動相A(pH 7.2)：27.6 mmol/L醋酸鈉-三乙胺-四氫呋喃(體積比500∶0.11∶2.5)，流動相B(pH 7.2)：80.9 mmol/L醋酸鈉-乙醇-乙腈(體積比1∶2∶2)，洗脫程序為：0 ～17 min，8%～50% B；17～20 min，50%～100% B；20～24 min，100%～0% B。

用必需氨基酸比值(RAA)、氨基酸比值系數(shù)(RC)及氨基酸比值系數(shù)分(SRC)，對醋膏和醋液醇沉物的水解氨基酸組成特性進行評價[19]。具體計算如式(1)、式(2)、式(3)：

(1)

(2)

SRC=100-CV×100

(3)

式中：CV為RC的變異系數(shù)，CV=各種必需氨基酸RC的標(biāo)準(zhǔn)偏差/各種必需氨基酸RC的平均值。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

本研究中每個樣品重復(fù)測定3次，并利用Excel軟件計算平均值及標(biāo)準(zhǔn)差。

2 結(jié)果與分析

2.1 醋膏、醋液醇沉物的得率

從食醋樣品中離心分離獲得醋膏的濕重為(1.0±0.1)g/100 mL，干燥后醋膏干重為(0.4±0.0)g/100 mL，水分含量為63.0 g/100 g。經(jīng)過離心后獲得的醋液進行乙醇沉淀，獲得的醇沉物濕重為(6.9±0.2)g/100 mL，干燥后的重量為(4.0±0.1)g/100 mL，水分含量為41.8 g/100 g。

2.2 多糖、多肽含量的測定

醋膏和醋液醇沉物中的粗多糖含量分別為(14.0±0.5)g/100 g和(42.5±0.8)g/100 g。經(jīng)換算，每100 mL食醋的醋膏中含有0.05 g粗多糖，醋液醇沉物中含有1.70 g粗多糖。

醋膏和醋液醇沉物中的粗多肽含量分別為(53.4±0.7)g/100 g和(30.5±0.0)g/100 g，經(jīng)換算，每100 mL食醋的醋膏中含有0.2 g多肽，醋液醇沉物中含有1.2 g 粗多肽。

醋膏和醋液醇沉物中多肽和多糖的相對含量總和分別為67.4 g/100 g和73.0 g/100 g(圖1)，說明多肽和多糖均是醋膏中的主要成分。醋膏中多肽與多糖的比值(3.8)顯著高于醋液醇沉物中多肽與多糖的比值(0.7)(P<0.05)(圖1)，提示食醋中多肽類物質(zhì)在醋膏自然形成過程中相對于多糖類物質(zhì)更容易沉淀析出。

圖1 醋膏及醋液醇沉物中多糖、多肽含量Fig.1 Contents of crude polysaccharides and polypeptides in vinegar sediment and vinegar ethanol precipitate

2.3 單糖組成分析

醋膏及醋液醇沉物粗多糖中的單糖組成分析結(jié)果如圖2所示。醋膏及醋液醇沉物的粗多糖均由6種單糖組成，但是單糖組成比例具有差異。醋膏粗多糖中單糖的相對峰面積大小為葡萄糖(33.3%)>氨基葡萄糖(27.4%)>木糖(17.1%)>半乳糖(9.9%)>阿拉伯糖(9.4%)>甘露糖(2.9%)，而醋液醇沉物多糖中的單糖相對峰面積大小為木糖(31.3%)>葡萄糖(24.8%)>阿拉伯糖(19.8%)>半乳糖(12.6%)>甘露糖(8.4%)>氨基葡萄糖(3.2%)。與醋液醇沉物相比，醋膏多糖中氨基葡萄糖相對含量明顯更高。

a-醋膏; b-醋液醇沉物圖2 醋膏及醋液醇沉物的單糖組成Fig.2 Monosaccharide compositions of vinegar sediment and vinegar ethanol precipitate

2.4 多糖硫酸基含量分析

醋膏和醋液多糖中硫酸基含量分別為(2.64±0.17)%和(0.30±0.02)%。多糖的生物活性與其物理化學(xué)性質(zhì)密切相關(guān)，如分子大小、單糖類型和比率以及糖苷結(jié)構(gòu)特性等。近年來多糖的化學(xué)分子修飾尤其是硫酸化修飾引起了研究者的極大興趣，許多研究證明硫酸多糖具有顯著的抗腫瘤、抗病毒、抗氧化、抗凝血等活性，對機體免疫系統(tǒng)有一定調(diào)控作用[20]。

2.5 水解氨基酸組成分析

醋膏和醋液醇沉物的粗多肽中均檢出17種氨基酸，總量分別為30.1 g/100 g和10.8 g/100 g(表1)。醋膏和醋液醇沉物的粗多肽中必需氨基酸有7種，非必需氨基酸有10種，必需氨基酸分別占氨基酸總量的27.4%和19.5%。醋膏的谷氨酸、脯氨酸、天冬氨酸、甘氨酸相對含量最高，占氨基酸總量的50.9%。醋液醇沉物中多肽的谷氨酸、天冬氨酸和甘氨酸的相對含量豐富，三者占氨基酸總量的51.4%。

從風(fēng)味貢獻進行分類，氨基酸主要可分為鮮味，甜味和苦味三類[21]。醋膏多肽水解氨基酸中甜味氨基酸(脯氨酸、甘氨酸、丙氨酸、絲氨酸、蘇氨酸)、苦味氨基酸(精氨酸、組氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、酪氨酸、賴氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸)、鮮味氨基酸(天冬氨酸、谷氨酸)占氨基酸總量分別為31.4%、34.2%和33.5%，與醋液醇沉物的水解氨基酸相似(31.8%、29.1%和38.2%)(表1)。

亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸屬于支鏈氨基酸，可作為機體的能量來源，能通過被肝、心肌、骨骼肌、腦等攝取供能[22-23]。同時，纈氨酸是生糖氨基酸，亮氨酸是生酮氨基酸，異亮氨酸是生糖兼生酮氨基酸，它們在體內(nèi)可通過三羧酸循環(huán)相互轉(zhuǎn)化，使糖、蛋白質(zhì)、脂肪代謝三者相互聯(lián)系[24]。醋膏多肽的水解氨基酸中支鏈氨基酸占總氨基酸含量的15.9%，高于醋液醇沉物中的多肽(7.7%)(表1)。

表1 醋膏與醋液多肽的氨基酸組成 單位：g/100 g

注：*,必需氨基酸；表中數(shù)據(jù)為100 g干物質(zhì)中氨基酸的質(zhì)量;EAA/TAA,必需氨基酸占氨基酸總量的比例；EAA/NEAA，必需氨基酸與非必需氨基酸的比值；BCAA/TAA，支鏈氨基酸占總氨基酸的比例。

FAO/WHO根據(jù)氨基酸組成平衡理論，提出了必需氨基酸比值(RAA)、氨基酸比值系數(shù)(RC)及比值系數(shù)分(SRC)的分析指標(biāo)(表2)。RAA表示一定量食物中某必需氨基酸的含量相當(dāng)于模式氨基酸的多少倍。RC表示與模式氨基酸相當(dāng)量的一份食物氨基酸的比值，數(shù)值RC最低的氨基酸為該食物的第一限制氨基酸，數(shù)值RC大于或者小于1都表示偏離氨基酸模式，RC>1表示該氨基酸相對過剩，RC<1表示該氨基酸相對不足。根據(jù)分析結(jié)果，醋膏的第一限制氨基酸為甲硫氨酸(表2)。SRC主要是評價各種必需氨基酸的氨基酸分之間的接近程度，樣品的SRC越接近100，營養(yǎng)價值越高。本實驗中，醋膏多肽水解氨基酸的SRC比醋液醇沉物更接近于100，說明其營養(yǎng)價值相對更高。

表2 醋膏和醋液的氨基酸比值、氨基酸比值系數(shù)、氨基酸比值系數(shù)分Table 2 RAAs, RCAAs and SRCs of vinegar sediment and vinegar ethanol extract

3 結(jié)論

醋膏主要由多糖、多肽等物質(zhì)組成。其中，醋膏粗多糖含量為14.0%，主要由氨基葡萄糖、葡萄糖、木糖、阿拉伯糖、半乳糖甘露糖等單糖組成，以氨基葡萄糖為主，其多糖中硫酸基含量占比為2.64%。醋膏多肽占醋膏干重的53.4%，含有17種氨基酸，主要由谷氨酸、脯氨酸、天冬氨酸、甘氨酸組成，7種必需氨基酸占氨基酸總量的27.4%。根據(jù)FAO/WHO氨基酸評分模式，醋膏的多肽營養(yǎng)價值高于醋液醇沉物。目前的研究并沒有明確醋膏多糖多肽的結(jié)構(gòu)和功效，后續(xù)需對醋膏多糖多肽進行分離純化，而本研究為了解醋膏成分和后續(xù)的分離純化實驗提供了參考數(shù)據(jù)。