趙謀明　鄭澤洋　劉小玲

摘要：硒是生物體內(nèi)必需的微量元素，其毒性和生物活性與化學(xué)形態(tài)相關(guān)，文章結(jié)合國(guó)內(nèi)外研究情況從食品中總硒的測(cè)定和硒化學(xué)形態(tài)分析兩個(gè)方面進(jìn)行綜述。在總硒測(cè)定方法中，采用超聲輔助提取總硒，并以原子吸收作為檢測(cè)器時(shí)，方法的靈敏度高，檢測(cè)限低;而在硒化學(xué)形態(tài)分析中，固相萃取是效率高、準(zhǔn)確性高、應(yīng)用范圍廣的提取方法，結(jié)合氣相色譜—質(zhì)譜聯(lián)用法（GC-MS）進(jìn)行測(cè)定硒化物含量時(shí)，方法的檢測(cè)限較低。由于其他形態(tài)的硒含量低或結(jié)構(gòu)復(fù)雜，難以從基質(zhì)中分離鑒定，目前主要關(guān)注5種形態(tài)的硒[Se（VI）、Se（IV）、SeMet、SeCys和Se-MeSeCys]，且存在總硒測(cè)定和硒形態(tài)分析的過程均耗時(shí)較長(zhǎng)等問題，因此今后需關(guān)注更多未知形態(tài)的硒，以便更好地利用硒，并開發(fā)綠色快速提取、分離及檢測(cè)一體化的自動(dòng)化檢測(cè)技術(shù)。

關(guān)鍵詞： 硒;含量;形態(tài)分析;預(yù)處理;檢測(cè)技術(shù)

中圖分類號(hào)： S-03;TS201.4? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號(hào)：2095-1191（2019）12-2787-10

Total content determination and chemical speciation analysis of selenium in food： A review

ZHAO Mou-ming1，2， ZHENG Ze-yang1， LIU Xiao-ling1，3*

（1College of Light Industry and Food Engineering， Guangxi University， Nanning? 530004， China; 2College of Food Science and Engineering， South China University of Technology， Guangzhou? 510640， China; 3Guangxi Buffalo Milk Engineering and Technology Center， Nanning? 530004， China）

Abstract：Selenium is an essential trace element in organisms， whose toxicity and biological activity are related to its morphology. This article reviewed the two aspects of the determination of total selenium and selenium chemical speciation analysis in food from home and abroad. In case of total selenium determination， the determination method with high sensitivity and low detection limit is consisted of ultrasound-assisted extraction as a extraction way and the atomic absorption as a detector. While in case of selenium speciation analysis， solid-phase extraction is an efficient， accurate and popular way to extraction the selenium speciation. After that， used the gas cromatography-mass spectrometry（GC-MS） as the detector would obtain the lower detection limit in all methods. Due to the low content and complex structure of selenium compounds， it is difficult to separate and identify them from the matrix. And five forms of selenium are mainly concerned now[Se（VI）， Se（IV）， SeMet， SeCys and Se-MeSeCys]. Moreover， it has spending a long time in the process of total selenium determination and selenium form analysis. To resolve these problems， firstly， the researchers should pay attention to find more unknown selenium compounds in order to make better use of them; secondly， researchers should develop an integrated detection technology of green and fast extraction， separation and detection.

Key words： selenium; content; speciation analysis; pretreatment; detection technology

0 引言

1817年一種有毒的微量元素硒（Se）被瑞典化學(xué)家Berzelius發(fā)現(xiàn)。1973年聯(lián)合國(guó)世界衛(wèi)生組織宣布硒是生物體中必需的、不可缺少的營(yíng)養(yǎng)元素之一。諸多研究已表明，在不同物種中，硒扮演著一個(gè)重要角色，參與許多生命基礎(chǔ)代謝（Donovan and Copeland，2010;Mariotti et al.，2012）。在機(jī)體中，硒通過摻入到蛋白質(zhì)中構(gòu)成硒蛋白，具有避免細(xì)胞膜過度氧化（夏弈明，2011）、抗氧化（Steinbrenner and Sies，2009）、提高免疫力（Hoffmann et al.，2010）和預(yù)防腦部疾?。ㄅ两鹕　柶澓Ｄ『桶d癇等）發(fā)生（Naziroglu，2009;Cardoso et al.，2015;Solovyev，2015）等多種生物學(xué)功能。但硒的安全攝入劑量范圍窄，攝入過量會(huì)引起硒中毒，攝入量不足則會(huì)導(dǎo)致“克山病”的發(fā)生，2013版《中國(guó)居民膳食營(yíng)養(yǎng)素參考攝入量》中推薦成人對(duì)硒的攝入量為60 μg/d（程義勇，2014），美國(guó)國(guó)家科學(xué)院醫(yī)學(xué)研究所規(guī)定成人每天對(duì)硒的最大攝入量不超過400 μg（Boyd，2011）。

硒在自然界存在的形態(tài)包括Se（VI）、Se（IV）、Se（0）和Se（-II），其中無機(jī)硒包括亞硒酸鹽（HSeO3- 和SeO32-）和硒酸鹽（SeO42-）等，而通過生物轉(zhuǎn)化與氨基酸等物質(zhì)結(jié)合而成的有機(jī)硒包括硒代氨基酸[硒代蛋氨酸（SeMet）和硒代半胱氨酸（SeCys）]、各種硒蛋白和硒多糖等。硒與人體內(nèi)的多種疾病相關(guān)（Rayman，2012），目前我國(guó)除硒中毒區(qū)（在湖北省恩施州成人硒攝入量高達(dá)4990 μg/d）以外的大部分地區(qū)成人硒攝入量均顯著低于推薦攝入量60 μg/d（袁麗君等，2016），即缺硒現(xiàn)狀較普遍?，F(xiàn)有的硒強(qiáng)化劑分為無機(jī)硒強(qiáng)化劑和有機(jī)硒強(qiáng)化劑，其中無機(jī)硒的毒性較大（Saygi et al.，2007;Tuzen et al.，2007;Rao et al.，2010;Chen et al.，2015），生物利用率低，大多發(fā)達(dá)國(guó)家已禁止使用無機(jī)硒強(qiáng)化劑，但在嚴(yán)重缺硒時(shí)無機(jī)硒可快速提高人體內(nèi)硒含量，長(zhǎng)期食用則存在較高的毒性風(fēng)險(xiǎn)（Thiry et al.，2012）;以富硒酵母和硒蛋白為代表的有機(jī)硒強(qiáng)化劑與無機(jī)硒強(qiáng)化劑相比，毒性低，生物利用率和安全性高。研究表明，硒在人體中主要以硒蛋白的形式發(fā)揮作用，特別是以SeMet形式存在的有機(jī)硒能更有效地防止硒缺乏（Thiry et al.，2012）。硒的形態(tài)直接關(guān)系到食品中硒的安全性、生物利用率等，為此，本文重點(diǎn)綜述食品中硒的總含量測(cè)定及形態(tài)分析的預(yù)處理和檢測(cè)方法，以期為食品中硒強(qiáng)化劑的開發(fā)利用提供參考。

1 總硒的測(cè)定

1. 1 預(yù)處理方法

1. 1. 1 濕法消解 濕法消解的消化液常用硝酸（HNO3）和高氯酸（HClO4）。單獨(dú)使用HNO3作消化液時(shí)結(jié)果通常偏低，其原因有兩方面：一是在消化期間由于食品高溫碳化導(dǎo)致硒損失;二是消解后硒形態(tài)不滿足測(cè)定需求的硒形態(tài)[一般為Se（IV）]。濕法消解能完全將硒轉(zhuǎn)化為無機(jī)形式，但其耗時(shí)較長(zhǎng)，通常需要過夜消解，且消解過程會(huì)使大量的酸揮發(fā)，實(shí)驗(yàn)室污染嚴(yán)重。

1. 1. 2 微波消解 微波消解中常用硝酸—過氧化氫（HNO3-H2O2）作為消化液，其中H2O2主要起到加快反應(yīng)速度及氧化脫色的作用。單獨(dú)使用HNO3消解，溶液呈黃色透明，而加入H2O2后，由于H2O2受熱分解，增大管內(nèi)壓力從而加快反應(yīng)速率，溶液最終呈無色透明。對(duì)于一些簡(jiǎn)單的樣品（水或成分較簡(jiǎn)單的飲料），可直接加入鹽酸（HCl）將Se（VI）還原為Se（IV），直接測(cè)定其總硒含量（Tuzen and Pekiner，2015）。與常規(guī)的濕法消解相比，微波消解因其控溫、密閉，具有硒損失率低、耗時(shí)短、試劑用量少及自動(dòng)化等優(yōu)點(diǎn)，常用于食品中總硒的測(cè)定。但在消解過程中不能將所有的硒轉(zhuǎn)化為Se（IV），需加入還原劑將Se（VI）還原為Se（IV），通常選用HCl作為還原劑，特別是用原子熒光光譜法（AFS）進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，其他還原劑（鹽酸羥胺和尿素）可能會(huì)形成硒的氮氧化物，而影響測(cè)定結(jié)果（Garcia et al.，2005）。

1. 1. 3 其他方法 與傳統(tǒng)的消解方法相比，一些新興總硒提取方法的試劑用量減少，條件溫和，且顯著降低提取過程中硒的損失，提高準(zhǔn)確性。Tuzen等（2007）利用氫氧化鎂與Se（IV）形成共沉淀，測(cè)定經(jīng)酸處理后水樣和飲料中的總硒含量，該方法適用于成分簡(jiǎn)單的樣品。Vale等（2007）開發(fā)了一種快速、可重復(fù)的酶探針超聲萃取方法，成功從牡蠣、貽貝和浮游生物中萃取總硒，其結(jié)果與微波消解的結(jié)果無顯著差異，提取時(shí)間極短，條件溫和（室溫，pH 7.5），有效防止硒元素?fù)p失，減少酸堿試劑使用;但該方法使用的是蛋白酶XIV，不適用于提取以碳水化合物為主的食品中的硒，且在提取過程中要穩(wěn)定酶活性。這些方法與傳統(tǒng)的消解方法相比，較少使用酸堿試劑，綠色環(huán)保，且能有效減少硒的損失，提高方法的準(zhǔn)確性。Shrivas和Patel（2011）使用超聲輔助中空纖維液相微萃取法測(cè)定蔬菜和水果中總硒含量，樣品經(jīng)酸處理后pH調(diào)至0.8～3.0，加入到中空纖維中，然后在超聲輔助下用N-辛基乙酰胺洗脫，15 min即可完成硒提取;結(jié)果發(fā)現(xiàn)提取過程幾乎不受樣品基質(zhì)的影響，能簡(jiǎn)單快速提取復(fù)雜生物體中的Se（IV），且檢測(cè)限（80 ng/L）比超聲輔助固相萃取（100 ng/L）低;其缺點(diǎn)是不能提取Se（VI），總硒的提取需加入還原劑將Se（VI）還原為Se（IV）。Ohki等（2016）在220 ℃下用亞臨界水處理14種食物樣品（包括魚、貝類、肉類和干海藻等），從中提取總硒并對(duì)其含量進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果與微波消解測(cè)量結(jié)果一致;該方法僅使用水，不使用強(qiáng)酸或酶，提取速度快，儀器成本低，操作簡(jiǎn)單。Altunay和Gürkan（2017）用酸處理多種海產(chǎn)品（鮭魚、蝦和吞拿魚等）及農(nóng)產(chǎn)品（大米、西紅柿和蘑菇等）后，使用超聲波輔助提取方法提取總硒，該方法10 min即可將Se（IV）與非離子表面活性劑形成復(fù)合物從水相轉(zhuǎn)移至表面，該過程無需熱處理，減少了硒的損失;測(cè)定結(jié)果與標(biāo)準(zhǔn)參考材料相比無顯著差異，方法回收率為95%～103%，該提取方法有望代替?zhèn)鹘y(tǒng)的消解方法。超聲輔助提取及富集純化能有效提高硒提取率，減少硒損失，有望在食品中硒提取液富集純化中廣泛應(yīng)用。

1. 2 檢測(cè)技術(shù)

根據(jù)檢測(cè)技術(shù)的不同，經(jīng)過消解的樣品可直接進(jìn)行總硒測(cè)定或?qū)⒂坞x狀態(tài)的Se預(yù)濃縮后再進(jìn)行檢測(cè)。AFS、電感耦合等離子體質(zhì)譜法（ICP-MS）和原子吸收光譜法（AAS）等方法操作簡(jiǎn)單，檢測(cè)速度快，檢出限低，適合超痕量硒的樣品檢測(cè)，但儀器價(jià)格昂貴。其中，氫化物發(fā)生—原子吸收法（HG-AAS）可快速從食品基質(zhì)中將硒分離出來，避免其他物質(zhì)的干擾，是測(cè)定硒元素最常見的方法之一（馬作江等，2011），其原理是在酸性介質(zhì)中，用硼氫化鈉將Se（VI）還原為揮發(fā)性的Se2H，通過載氣將氫化物蒸氣導(dǎo)入加熱的T形石英管中，Se2H受熱后迅速分解，將硒離解為基態(tài)原子蒸氣，從而吸收該元素的特征發(fā)射信號(hào)。與HG-AAS相比，石墨爐—原子吸收法（GF-AAS）具有相近的檢測(cè)靈敏度，但基體干擾和灰化導(dǎo)致硒損失較嚴(yán)重，因此消除基體干擾和選擇最佳條件是保證測(cè)定結(jié)果可靠性的關(guān)鍵。其中，Rybínová等（2016）利用紫外催化Se（VI）迅速轉(zhuǎn)化成揮發(fā)性硒物質(zhì)（2 min內(nèi)），然后直接進(jìn)入原子吸收光譜檢測(cè)器中進(jìn)行檢測(cè)，該方法未使用高純硼氫化鈉和HCl，能源潔凈且檢測(cè)限低（27～102 ng/L），是一種有望應(yīng)用于測(cè)定食品中總硒含量的方法。

在食品中硒含量的測(cè)定中，GB 5009.93—2017《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中硒的測(cè)定》在舊國(guó)標(biāo)的基礎(chǔ)上增加了ICP-MS為第三法，與兩種分光光度法和電感耦合等離子體發(fā)射光譜法（ICP-OES）相比，具有更快速、靈敏、試劑毒性低等優(yōu)點(diǎn)。其原理是在酸性環(huán)境下將樣品以水溶液的氣溶膠形式引入氬氣流中，然后進(jìn)入氬等離子體中心區(qū)，等離子體的高溫使得樣品去溶劑化、汽化、解離和電離，通過質(zhì)譜儀分離及檢測(cè)質(zhì)分析樣品中的硒。王瑩等（2009）在測(cè)定富硒蛹蟲草菌絲體中硒含量時(shí)，對(duì)比了ICP-MS、高效液相色譜—熒光法和3，3-二氨基聯(lián)苯胺分光光度法3種方法，測(cè)定結(jié)果相似，檢測(cè)線分別為0.18、0.26和10.49 μg/L，其中高效液相色譜—熒光法和ICP-MS的靈敏度較高，但I(xiàn)CP-MS具有更廣的線性范圍（1.0～500.0 μg/L），適用范圍廣。ICP-MS已發(fā)展成為現(xiàn)今最普遍的總硒檢測(cè)方法之一，但具體的檢測(cè)方法可根據(jù)試驗(yàn)條件及樣品的硒含量進(jìn)行選擇。

可見分光光度法與熒光分光光度法測(cè)定總硒時(shí)，需將游離態(tài)的硒與帶有生色基團(tuán)的物質(zhì)反應(yīng)，常用顯色劑分別為3，3-二氨基聯(lián)苯胺（DAB）和2，3-二氨基萘（DAN），在特定波長(zhǎng)下測(cè)定生成物吸光值或熒光強(qiáng)度（鄒濤等，2011;Dadfarnia et al.，2014）。這兩種方法檢測(cè)的線性范圍廣，重現(xiàn)性好，儀器價(jià)格便宜，已得到廣泛應(yīng)用，但前處理操作過程復(fù)雜，需用到有毒試劑，空白干擾較大，需除去試劑中的熒光物質(zhì)，且檢測(cè)靈敏度低，不適用于痕量硒的檢測(cè)（王瑩等，2009;賈姍姍等，2012）。近年來，中子活化分析（Zembrzuska et al.，2014）、能量色散X射線分子熒光色譜（Li and Yu，2016）和尺寸排阻色譜—電感耦合等離子體質(zhì)譜法（Ohki et al.，2016）等方法在食品中總硒含量的測(cè)定中也得到應(yīng)用。結(jié)合樣品預(yù)處理方法和檢測(cè)技術(shù)方法，預(yù)處理時(shí)使用超聲輔助提取食品中總硒能有效提高方法的檢測(cè)限，尤其是以原子吸收作為檢測(cè)器時(shí)，與ICP-MS相比，具有更低的檢出限，在3.5～80.0 ng/L范圍內(nèi)，可用于檢測(cè)食品中痕量的硒元素。表1總結(jié)了食品中總硒含量測(cè)定的預(yù)處理方法及檢測(cè)技術(shù)。

2 硒化學(xué)形態(tài)分析

2. 1 樣品的預(yù)處理

樣品預(yù)處理是硒形態(tài)分析中的關(guān)鍵步驟，樣品經(jīng)預(yù)處理后，必須保證硒形態(tài)不發(fā)生改變，且要防止硒的損失，以保證實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性。樣品的預(yù)處理過程包括對(duì)樣品中硒化物的提取、濃縮及衍生等。對(duì)于含硒量極少的樣品（水和飲料等），在測(cè)硒之前還需進(jìn)行分離富集。在硒的形態(tài)分析中，不同食品的預(yù)處理方法如表2所示。

食品中常用于提取硒的方法包括液相萃取、液相微萃取和固相微萃取等（Dadfarnia et al.，2014;Min et al.，2017;Wang et al.，2017）。在提取過程中，不同形態(tài)的硒很容易受到提取溶液或介質(zhì)的影響而發(fā)生形態(tài)轉(zhuǎn)變或損失，故準(zhǔn)確獲得食品中硒的形態(tài)及其含量的關(guān)鍵在于提取前后硒的形態(tài)不發(fā)生任何改變，同時(shí)要降低硒的損失率。從食品基質(zhì)中提取不同形態(tài)的硒通常需要一步或多步萃取，一步萃取相對(duì)較簡(jiǎn)單，形態(tài)發(fā)生變化較小，但提取效率較低;而多步萃取可根據(jù)各種硒的形態(tài)特點(diǎn)采取不同的萃取方法，能顯著提高樣品的提取效率，但經(jīng)過多步萃取后，很難保持樣品中硒形態(tài)的完整性。

2. 1. 1 液相萃取 液相萃取主要包括水提、酸提、醇提和酶解提取等，單獨(dú)使用液相萃取法萃取不同形態(tài)硒，提取率與效率通常較低，與一些輔助方法結(jié)合使用可提高提取效率，如微波消解技術(shù)、紫外光和超聲波等。水提法是一種較簡(jiǎn)單的提取方法，用去離子水作為溶劑，為提高提取效率，da Silva等（2013）用超聲輔助水提法從巴西堅(jiān)果中提取SeMet和硒代胱氨酸（SeCys2）。酸提法是氨基酸分析中最常用的方法，但含硒氨基酸極不穩(wěn)定，需通過溫和條件進(jìn)行提取，例如在50 ℃下使用4 mol/L HCl浸提50 h，經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（BCR-414）驗(yàn)證，該提取方法的加標(biāo)回收率為91%（da Silva et al.，2013），但提取時(shí)間較長(zhǎng)。醇提常用于有機(jī)硒的測(cè)定，Rao等（2010）用75%乙醇提取啤酒酵母中游離的硒化物（特別是硒醇類物質(zhì)）。酶解提取條件溫和，不改變硒原本的形態(tài)，但其提取時(shí)間長(zhǎng)，提取率不高，不能使不同形態(tài)的硒完全提取出來，還可能存在硒的形態(tài)轉(zhuǎn)化。Bryszewska和Mage（2015）在磷酸緩沖液中使用蛋白酶XIV提取不同水產(chǎn)品中6種形態(tài)的硒[Se（IV）、Se（VI）、SeMet、硒甲基硒代半胱氨酸（Se-MeSeCys）、SeCys2和氧化硒代蛋氨酸（SeOMet）]，與在37 ℃下用微波輔助蛋白酶XIV提取SeMet、Se-MeSeCys、Se（VI）和Se（IV）（Grijalba et al.，2017）相比，加標(biāo)回收率相近（90%～108%）。還有采用超聲輔助熱水提取和蛋白酶XIV分步提取6種營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充劑中6種形態(tài)的硒，將經(jīng)熱水提取后的殘?jiān)龠M(jìn)行酶解，A產(chǎn)品的SeMet含量是單一提取法的10倍，說明分步順序提取可有效提高硒的提取率（Zembrzuska et al.，2014）。

2. 1. 2 液相微萃?。↙PME） 液相微萃取是一種微型液相萃取方法，包括直接液相微萃取、頂空液相微萃取和分散液—液相微萃取等，特別適用于痕量的微量元素測(cè)定。Tuzen和Pekiner（2015）使用超聲輔助離子液體—分散液—液相微萃取法測(cè)定了啤酒、牛奶、復(fù)合果汁、蜂蜜等10種食品中Se（IV）的含量，由于不涉及水與萃取劑相的界面，傳質(zhì)過程迅速，是一種快速、成本低、富集因子高、提取率高的萃取方法，而且離子液體還能改善色譜峰形和分辨率。懸浮液滴固化微萃取法是一種簡(jiǎn)單、快速、低成本、有機(jī)溶劑用量少和濃縮因子高的萃取方法，已被廣泛用于微量元素分析。Chen等（2015）采用懸浮液滴固化微萃取法研究富硒茶葉中硒的種類[包括總硒、懸浮態(tài)、可溶態(tài)、有機(jī)態(tài)、Se（IV）及Se（VI）]和分布規(guī)律，該方法的富集因子為500，對(duì)硒具有很強(qiáng)的富集能力。濁點(diǎn)提取（CPE）是利用非離子表面活性劑在加熱條件下形成膠束，與金屬離子形成螯合物，進(jìn)而從各種物質(zhì)中提取痕量的金屬離子。由于該提取方法簡(jiǎn)單，價(jià)格低廉，富集因子高，能保持萃取物質(zhì)的原有結(jié)構(gòu)，且溶劑對(duì)環(huán)境毒性較小，已成為常規(guī)溶劑萃取的替代品（Pytlakowska et al.，2013）。Wang等（2017）開發(fā)了雙濁點(diǎn)萃取法程序?qū)?2種海產(chǎn)品中痕量水平的硒進(jìn)行提取，與傳統(tǒng)CPE相比，可消除表面活性劑在氫化物生成過程中的影響，并將Se（IV）-APDC轉(zhuǎn)化為游離Se（IV），以增強(qiáng)熒光信號(hào)。

2. 1. 3 固相微萃?。⊿PME） 固相微萃取是一種無溶劑的萃取技術(shù)，基于待測(cè)樣品在不同的萃取涂層中達(dá)到固—?dú)饣蚬獭合辔交蛭掌胶?，從而將待測(cè)物質(zhì)從基質(zhì)中分離。按固定相吸附和富集樣品中的待測(cè)物質(zhì)，一般分為浸入式固相微萃取和頂空固相微萃取兩種類型。浸入式固相微萃取適用于分析氣體和液體樣品中的非揮發(fā)性有機(jī)化合物，而頂空固相微萃取主要用于分析復(fù)雜基質(zhì)中的揮發(fā)性和半揮發(fā)性有機(jī)化合物（張綠茵等，2012），如二甲基硒（DMSe）和二甲基二硒醚（DMDSe）。然而，大多數(shù)水溶性硒物種不能直接使用固相微萃取，需利用衍生劑將其轉(zhuǎn)化成揮發(fā)性硒化物進(jìn)行萃取。Gionfriddo等（2012）用氯甲酸烷基酯作衍生劑，測(cè)定了富硒馬鈴薯提取液中的SeMet和Se-MeSeCys含量;該衍生反應(yīng)是在室溫水溶液中進(jìn)行，效率高、操作簡(jiǎn)便，這兩種硒化物的回收率為82.3%～116.3%。攪拌棒吸附萃取是一種新型的固相微萃取技術(shù)，具有固定相體積大，萃取容量高，無需外加攪拌子，可避免競(jìng)爭(zhēng)性吸附，能自身攪拌的同時(shí)實(shí)現(xiàn)萃取富集等優(yōu)點(diǎn)（許志剛等，2011），該技術(shù)已廣泛用于食品樣品分析的預(yù)處理。

2. 2 硒化學(xué)形態(tài)分析的檢測(cè)方法

通過不同的預(yù)處理方法，可從食品中獲取不同形態(tài)的硒化物，通常多種形態(tài)的硒會(huì)同時(shí)存在，在檢測(cè)前需對(duì)其進(jìn)行分離。常用的分離方法有高效液相色譜（HPLC）、陰離子交換色譜、離子色譜（IC）、毛細(xì)管電泳色譜（CE）和氣相色譜（GC）等，常與ICP-MS、AFS和AAS等檢測(cè)方法聯(lián)用。質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)可直接提供硒的形態(tài)信息，且靈敏度高、分析速度快，是未來形態(tài)分析的發(fā)展方向。表2總結(jié)了不同食品樣品中硒的形態(tài)分析方法。

2. 2. 1 高效液相色譜—電感耦合離子體質(zhì)譜聯(lián)用法（HPLC-ICP-MS） HPLC是硒形態(tài)分析中最常用的分離方法，常與ICP-MS和MS檢測(cè)器聯(lián)用，而HPLC-ICP-MS聯(lián)用技術(shù)與HPLC-MS相比，具有更低的檢出限，更高的靈敏度（Zembrzuska et al.，2014），但由于硒的第一電離能較高（I1=9.75 eV），使得離子化效率相對(duì)較低;且存在多種多原子離子的干擾，如40Ar36Ar+對(duì)76Se、40A38Ar+對(duì)78Se、40Ar37Ar+對(duì)77Se、

37Cl37Cl+對(duì)74Se及81Br1H82Se等（邱建華等，2006），降低了ICP-MS的靈敏度與準(zhǔn)確性。陰離子交換色譜是HPLC常用的分離模式，根據(jù)不同待測(cè)離子對(duì)固定相親和力的差異實(shí)現(xiàn)分離，用于分離食品中的無機(jī)硒（熊珺等，2017）和硒代氨基酸（姚真真等，2018），分離時(shí)間短，檢出限在0.6～1.0 μg/L。Bryszewska和Mage（2015）使用反向離子色譜（色譜柱XBridge C18）與電感耦合等離子體質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（RPIC-ICP-MS）分離出6種形態(tài)的硒，6種硒化物在23 min內(nèi)即完成分離，且分離度高，檢出限為0.30～0.72 μg/L。與陰離子交換色譜相比，RPIC-ICP-MS柱效高，檢出限低，能同時(shí)分離多種形態(tài)的硒，廣泛用于極性元素的形態(tài)分離，對(duì)硒代氨基酸分離效果較佳。對(duì)于食品中硒形態(tài)的檢測(cè)，GB 1903.28—2018《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品營(yíng)養(yǎng)強(qiáng)化劑 硒蛋白》中已建立了SeMet的檢測(cè)方法，提取方法采用酶解提取，并使用HPLC-ICP-MS聯(lián)用技術(shù)進(jìn)行檢測(cè)，填補(bǔ)了硒形態(tài)分析標(biāo)準(zhǔn)方法的空白。

2. 2. 2 高效液相色譜—?dú)浠锇l(fā)生—原子熒光聯(lián)用法（HPLC-HG-AFS） 氫化物發(fā)生—原子熒光光譜法（HG-AFS）是硒測(cè)定的主要方法，在鹽酸介質(zhì)中，硼氫化鈉將Se（IV）還原為硒化氫，以氬氣作載體將硒化氫從母液中分離，并導(dǎo)入氫化物發(fā)生器中原子化，硒原子在激發(fā)光源下發(fā)出熒光，在一定范圍內(nèi)，其熒光強(qiáng)度與硒含量呈正比關(guān)系。由于HG-AFS具有較大線性范圍，與HPLC聯(lián)用后可用于檢測(cè)不同形態(tài)的硒。王金榮等（2013）利用HPLC-HG-AFS成功檢驗(yàn)了飼料和富硒酵母中Se（IV）、Se（VI）、SeCys及SeMet，方法平均回收率為70.0%～86.5%。將離子液體（ILs）添加到HPLC的流動(dòng)相中，能有效改善有機(jī)硒和無機(jī)硒的分離效果，但考慮到ILs對(duì)硒化物在HG-AFS測(cè)定時(shí)的影響，Grijalba等（2017）使用C8柱在pH 6.0下以含有0.1%（v/v）氯化1-己基-3-甲基咪唑離子液體為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫，12 min內(nèi)完成無機(jī)硒和有機(jī)硒的分離，隨后優(yōu)化了HG-AFS測(cè)定條件，即使體系中存在ILs，也能極大提高硒化物在HG-AFS的靈敏度;該方法成功應(yīng)用于啤酒、酵母和大蒜等食品的硒形態(tài)分析，檢出限為0.86～1.41 μg/L，明顯高于HPLC-ICP-MS的檢測(cè)限0.30～0.72 μg/L。進(jìn)一步說明在硒化學(xué)形態(tài)分析中，HPLC-ICP-MS聯(lián)用技術(shù)的檢測(cè)靈敏度比HPLC-HG-AFS高。

2. 2. 3 氣相色譜—質(zhì)譜聯(lián)用法（GC-MS） 氣相色譜除了能分離易揮發(fā)的硒化物（二甲基硒和二甲基二硒）外，還能利用衍生劑對(duì)非揮發(fā)性的硒化物和無機(jī)硒進(jìn)行衍生化，使之具有揮發(fā)性，隨后對(duì)其進(jìn)行分離。Gionfriddo等（2012）用SPME-GC-MS對(duì)富硒馬鈴薯提取液中的SeMet和Se-MeSeCys進(jìn)行定量檢測(cè)，其中衍生劑為氯甲酸異丁酯，能同時(shí)將氨基和羧酸基團(tuán)衍生化，且該衍生反應(yīng)是在室溫水溶液中進(jìn)行，效率高、操作簡(jiǎn)便;兩種硒化物的回收率為82.3%～116.3%，檢出限分別為0.143和0.210 μg/kg。Giráldez等（2015）分別用氯甲酸異丁酯和4-氯-1，2-苯二胺對(duì)SeMet、Se-MeSeCys及Se（IV）進(jìn)行衍生化，用雙攪拌棒吸附萃取對(duì)衍生物進(jìn)行預(yù)濃縮，使用GC-MS檢測(cè)其含量，Se（IV）、SeMet和Se-MeSeCys的檢測(cè)限分別為0.008、0.180和0.070 ng。Vriens等（2015）采用全自動(dòng)直接浸入式固相微萃取技術(shù)同時(shí)提取復(fù)雜水溶液中10種揮發(fā)性烷基化硒和硫化合物，并用毛細(xì)管氣相色譜—質(zhì)譜聯(lián)用進(jìn)行定量測(cè)定，DMSe和DMDSe的檢出限分別為24和27 ng/L，回收率為83%～103%?？梢?，與高效液相色譜—電噴霧離子源質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（Zembrzuska et al.，2014）、反向高效液相色譜—?dú)浠锇l(fā)生—原子吸收聯(lián)用技術(shù)（Grijalba et al.，2017）和HPLC-ICP-MS（熊珺等，2017）等方法相比，用氯甲酸異丁酯作為非揮發(fā)性硒化物的衍生劑，結(jié)合采用GC-MS對(duì)硒化物進(jìn)行分析時(shí)，具有更低的檢測(cè)限。

2. 3 其他方法

毛細(xì)管電泳法也是常用于硒化物形態(tài)的分離方法，但在復(fù)雜的食品基質(zhì)中靈敏度不高，應(yīng)用范圍受到限制。其原理是通過待分析組分在載流中電泳淌度的差別而實(shí)現(xiàn)，毛細(xì)管中待分離組分的表觀淌度是其固有電泳淌度和電滲流淌度的矢量和。Deng等（2009）采用毛細(xì)管電泳與電化學(xué)發(fā)光檢測(cè)器在線聯(lián)用技術(shù)，在最佳條件下，測(cè)定硒富集酵母中的SeMet線性濃度范圍為0.001～0.8 μg/L，相關(guān)系數(shù)為0.9996，檢測(cè)限為0.39 μg/L，回收率為98.6%。

近年來，液相色譜—電噴霧—質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)廣泛應(yīng)用于研究食品中硒蛋白和硒肽的分布（Jaya-singhe and Caruso，2011）及其各肽段的鑒定（Bryan et al.，2017），該方法能同時(shí)測(cè)定多種不同形態(tài)硒。Zembrzuska等（2014）采用液相色譜—電噴霧—質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)對(duì)6種補(bǔ)硒產(chǎn)品中的6種形態(tài)硒[SeCys、SeMet、Se-MeSeCys、甲基硒酸（MSA）、Se（IV）和Se（VI）]進(jìn)行測(cè)定，除Se（IV）外，其他5種形態(tài)的硒均有較低的檢測(cè)限（0.1～1.0 μg/L）。

單獨(dú)使用ICP-MS也可對(duì)硒形態(tài)進(jìn)行分析檢測(cè)，Duan和Hu（2009）開發(fā)了填料為Cu（II）-Al2O3納米復(fù)合物的微量柱，其在pH 9.0和pH 4.0下可分別吸附富硒酵母水提液中的SeMet和SeCys2，用1.0 mol/L HNO3洗脫后直接進(jìn)入ICP-MS進(jìn)行定量檢測(cè)，但該方法的檢測(cè)限相對(duì)較高，SeMet和SeCys2檢測(cè)限分別為24和21 μg/L，僅適用于含硒較高的食品。

3 展望

硒的形態(tài)與其毒性及生物活性密切相關(guān)，因此有必要深入研究分析硒形態(tài)的新方法，對(duì)于進(jìn)一步促進(jìn)我國(guó)硒營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充劑及監(jiān)督管理其相關(guān)產(chǎn)品質(zhì)量均具有重要意義。目前，對(duì)于硒形態(tài)分析的研究還存在許多問題和難點(diǎn)：（1）有機(jī)硒的測(cè)定通常是通過差減法計(jì)算得到，從食品基質(zhì)中除去有機(jī)硒的過程相當(dāng)復(fù)雜，一般需要超聲、醇溶和離心等過程，且不能完全將有機(jī)硒與無機(jī)硒分離，準(zhǔn)確性較差;（2）總硒含量測(cè)定常用微波消解作為預(yù)處理方法，該方法能有效降低硒的損失率，加快反應(yīng)速率，減少酸試劑用量，但其密閉、高壓的反應(yīng)環(huán)境存在一定危險(xiǎn)性;（3）從食品基質(zhì)中提取不同形態(tài)的硒常用酸提法、酶解提取法和離子液體微萃取法等，提取方法越溫和，越能保持硒原有的形態(tài)，但提取效率較低，耗時(shí)長(zhǎng);（4）目前對(duì)硒形態(tài)分析主要關(guān)注5種形態(tài)的硒[Se（IV）、Se（VI）、SeMet、SeCys和Se-MeSeCys]，由于其他形態(tài)的硒含量低或結(jié)構(gòu)復(fù)雜，難以從基質(zhì)中分離鑒定;（5）不論是總硒測(cè)定還是硒形態(tài)分析的過程耗時(shí)均較長(zhǎng)，主要體現(xiàn)在硒的提取與分離。

因此，今后硒形態(tài)分析的研究重點(diǎn)首先應(yīng)注重硒的提取方面，不論是總硒測(cè)定還是硒形態(tài)分析，將硒從食品基質(zhì)中分離是檢測(cè)的前提，綠色、快速的提取是今后發(fā)展方向;其次是關(guān)注更多未知形態(tài)的硒，包括其功能與測(cè)定方法，以便更好地發(fā)展和利用;第三是發(fā)展快速檢測(cè)技術(shù)，開發(fā)提取、分離及檢測(cè)一體化的自動(dòng)化檢測(cè)技術(shù)，加強(qiáng)對(duì)市場(chǎng)中富硒產(chǎn)品及硒營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充劑的監(jiān)控。一種紅色納米硒是近年來的熱門研究對(duì)象，其屬于零價(jià)硒，是至今發(fā)現(xiàn)毒性最低、生物活性最好的硒，其有效形式含量的測(cè)定，或許也將成為今后的研究熱點(diǎn)。氨基酸分析儀常用于分析生物體中常見的氨基酸，而人體中不可缺少的第21種氨基酸——SeCys的測(cè)定，有望通過該方法同時(shí)與其他20種必需氨基酸進(jìn)行分析，且能滿足再現(xiàn)性好、精確度高、檢出限較高、方法操作簡(jiǎn)便。隨著液相色譜—電噴霧質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)的快速發(fā)展，探索食品中更多形態(tài)的硒已成為可能，加強(qiáng)對(duì)不同形態(tài)硒生物活性的研究，有望開發(fā)出更安全、更有效的功能性硒產(chǎn)品。我國(guó)大多地區(qū)都處于缺硒狀態(tài)，食品中硒形態(tài)分析的最終目的是為了更好地分析食品中的硒形態(tài)組成，利用功能性硒含量豐富的食物，開發(fā)健康安全的補(bǔ)硒產(chǎn)品，解決普遍缺硒的問題，從而減少因缺硒導(dǎo)致的多種疾病發(fā)生。

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（責(zé)任編輯 羅 麗）