李俊萍 郭盛磊 王謙博 付士朋 王振月

摘 要 目的：建立測定刺五加中多糖含量的方法，并對其進行聚類分析及超聲提取工藝優(yōu)化。方法：采用硫酸-苯酚法測定刺五加中多糖的含量。采用SPSS 23.0軟件對17個不同產(chǎn)地刺五加進行聚類分析。采用L9（34）正交試驗設(shè)計以提取溫度、料液比、提取時間為考察因素，多糖含量為考察指標(biāo)對其超聲提取工藝進行優(yōu)化并驗證。結(jié)果：葡萄糖質(zhì)量濃度線性范圍為0.007 75～0.151 mg/mL（r=0.999 1）;定量限、檢測限分別為2.854、0.856 μg/mL;精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性試驗的RSD均小于2%;加樣回收率為98.41%～101.58%（RSD=1.23%，n=6）。聚類分析結(jié)果顯示，17批藥材樣品可聚為3類，S1、S6、S10、S12、S13聚為一類，S3～S5、S7聚為一類，其余聚為一類。最優(yōu)超聲提取工藝為提取溫度55 ℃、料液比1 ∶ 10（g/mL）、提取時間35 min;3次驗證試驗結(jié)果顯示，最優(yōu)工藝所得多糖平均含量為4.36% （RSD=0.92%，n=3）。結(jié)論：所建含量測定方法操作簡便、重復(fù)性較好，可用于測定刺五加中多糖含量;優(yōu)化后的超聲提取工藝穩(wěn)定、可行。

關(guān)鍵詞 刺五加;多糖;硫酸-苯酚法;含量測定;正交試驗;超聲提取工藝;聚類分析

ABSTRACT? ?OBJECTIVE： To establish a determination method for content of polysaccharide in Acanthopanax senticosus， and to conduct cluster analysis and ultrasonic extraction technology optimization. METHODS： The content of polysaccharide in A. senticosus was determined by phenol-sulfuric acid method. Cluster analysis was conducted by using SPSS 23.0 software of the polysaccharide in A. senticosus from 17 habitats. The ultrasonic extraction technology was optimized with L9（34）orthogonal test using extraction temperature， the ratio of material to liquid， extraction time as factors， the content of polysaccharides as index， and then validated. RESULTS： The linear range of glucose ranged from 0.007 75 to 0.151 mg/mL （r=0.999 1）; the limits of quantification and detection were 2.854， 0.856 μg/mL; RSDs of precision， stability， and repeatability tests were less than 2%; recovery rates of the sample were 98.41%-101.58%（RSD=1.23%，n=6）. Cluster analysis results showed that 17 batches of samples could be clustered into three classes; S1， S6， S10， S12 and S13 were clustered into one class; S3-S5 and S7 were clustered into one class; and the rest samples were clustered into one class. The optimal ultrasonic extraction technology was extraction temperature 55 ℃， ratio of material to liquid 1 ∶ 10 （g/mL）， extraction time 35 min. Results of validation tests showed the content of the polysaccharide under the best process condition was 4.36%（RSD=0.920%，n=3）. CONCLUSIONS： Established method is simple，reproducible and suitable for determination of polysaccharide in A. senticosus; the optimized ultrasonic extraction technology is stable and feasible.

KEYWORDS? ?Acanthopanax senticosus; Polysaccharide; Phenol-sulfuric acid method; Content determination;Orthogonal test; Ultrasonic extraction technology; Cluster analysis

刺五加為五加科植物刺五加[Acanthopanax seuticosus（Rupr. et Maxim.）Harms]的干燥根、根莖或莖，具有益氣健脾、補腎安神的功效[1]，是我國東北地區(qū)珍貴的藥用植物[2]。刺五加中含有多糖、三萜皂苷類、黃酮類、木脂素類、香豆素類等多種活性成分[3-4]。現(xiàn)代研究表明，刺五加中的多糖成分具有調(diào)節(jié)免疫、抗腫瘤、抗氧化、降血糖等藥理作用，現(xiàn)已成為研究的熱點[5]。

目前，關(guān)于刺五加中多糖的研究多集中在藥理作用等方面[6-7]，而對其含量的研究較少。雖然霍文等[8]比較了產(chǎn)自本溪、穆枝、琿春刺五加中多糖的含量，但樣本量較少、結(jié)論缺乏代表性。此外，刺五加中多糖的提取常采用煎煮法和回流法，但提取時間長、操作繁瑣，提取率低[9-10]。有研究認(rèn)為，與上述提取方法相比，超聲提取法具有省時、高效、能耗低等優(yōu)點，并且可以大幅度地提高多糖的提取率[11]?；诖耍狙芯坎捎昧蛩?苯酚法測定了刺五加中多糖的含量，并對17個不同產(chǎn)地刺五加進行聚類分析;同時，采用正交試驗設(shè)計以提取溫度、料液比、提取時間為考察因素，多糖含量為考察指標(biāo)對其超聲提取工藝進行優(yōu)化，旨在為其相關(guān)產(chǎn)品的開發(fā)利用提供參考。

1 材料

1.1 儀器

H1650型臺式高速離心機（湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司）;BGZ-240型真空干燥箱（上海博迅醫(yī)療生物儀器股份有限公司）;FW100型高速萬能粉碎機（天津市泰斯特儀器有限公司）;Spectra Max M2型多功能酶標(biāo)儀[美谷分子儀器（上海）有限公司];KM-822C型超聲波清洗器（廣州市科潔盟實驗儀器有限公司）;AE240型電子天平（瑞士Mettler-Toledo公司）。

1.2 藥品與試劑

葡萄糖對照品（天津市大茂化學(xué)試劑廠，批號：20170801，純度：≥99%）;濃硫酸、苯酚均為分析純，水為蒸餾水。

1.3 藥材

刺五加藥材采自黑龍江省和吉林省的17個不同產(chǎn)地，經(jīng)黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院王振月教授鑒定為五加科植物刺五加[Acanthopanax seuticosus（Rupr. et Maxim.）Harms]的莖。將藥材樣品于45 ℃烘干至恒定質(zhì)量，粉碎后過60目篩，備用。藥材樣品來源見表1。

2 方法與結(jié)果

2.1 刺五加中多糖含量測定

采用硫酸-苯酚法測定刺五加中多糖的含量[12]。

2.1.1 供試品溶液的制備 取藥材樣品1.0 g，置于干燥錐形瓶中，稱定質(zhì)量，超聲（功率：480 W，頻率：40 kHz，下同）提取，提取溫度55 ℃，料液比1 ∶ 10（g/mL，下同），提取時間35 min后，取出放冷，再次稱定質(zhì)量，用水補足減失的質(zhì)量，混勻，取提取液2 mL，置于離心管中，以4 000 r/min離心10 min，取上清液1.0 mL，置于50 mL量瓶中，加水定容，即得供試品溶液。

2.1.2 對照品溶液的制備 精密稱取經(jīng)105 ℃干燥至恒定質(zhì)量的葡萄糖對照品7.55 mg，置于50 mL量瓶中，加水溶解并定容，制成質(zhì)量濃度為0.151 mg/mL的對照品溶液。

2.1.3 空白對照溶液 以水為空白對照溶液。

2.1.4 檢測波長的確定 精密吸取上述對照品溶液、供試品溶液各2.0 mL，分別置于10 mL具塞試管中，加苯酚1.0 mL，混勻，加濃硫酸5.0 mL，搖勻后于室溫下放置30 min，于200～800 nm波長下進行全波長掃描。另取空白對照溶液2.0 mL，于200～800 nm波長下進行全波長掃描。結(jié)果顯示，對照品溶液和供試品溶液在490 nm波長處有最大吸收，空白對照溶液在490 nm波長處沒有吸收，故選擇檢測波長為490 nm，詳見圖1。

2.1.5 線性關(guān)系考察 分別精密量取“2.1.2”項下對照品溶液0.1、0.2、0.6、1.0、1.4、2.0 mL，置于2 mL具塞試管中，加水稀釋至2 mL，得到質(zhì)量濃度分別為0.007 75、0.015 1、0.045 3、0.075 5、0.105 7、0.151 mg/mL的系列線性關(guān)系工作溶液，按“2.1.4”項下方法顯色后，于490 nm波長處測定吸光度。以葡萄糖質(zhì)量濃度（x，mg/mL）為橫坐標(biāo)、吸光度（y）為縱坐標(biāo)進行線性回歸，得多糖回歸方程為y=8.730 4x+0.026 2（r=0.999 1），表明葡萄糖質(zhì)量濃度在0.007 75～0.151 mg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.1.6 定量限與檢測限考察 取“2.1.2”項下對照品溶液適量，按“2.1.4”項下方法顯色后，于490 nm波長處測定吸光度并計算標(biāo)準(zhǔn)偏差。以標(biāo)準(zhǔn)偏差與標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率之比的10倍對應(yīng)的質(zhì)量濃度作為定量限，以標(biāo)準(zhǔn)偏差與標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率之比的3倍對應(yīng)的質(zhì)量濃度作為檢測限。結(jié)果，定量限為2.854 μg/mL，檢測限為0.856 μg/mL。

2.1.7 精密度試驗 精密量取“2.1.2”項下對照品溶液2.0 mL，按“2.1.4”項下方法顯色后，于 490 nm波長處連續(xù)測定6次吸光度。結(jié)果，吸光度的RSD為0.047%（n=6），表明儀器精密度良好。

2.1.8 穩(wěn)定性試驗 精密量取“2.1.1”項下供試品溶液（編號：S1）2.0 mL，按“2.1.4”項下方法顯色后，分別在室溫下放置2、4、6、8、12、24 h時于490 nm波長處測定吸光度。結(jié)果，吸光度的RSD為0.126%（n=6），表明供試品溶液在室溫下放置24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.1.9 重復(fù)性試驗 取藥材樣品（編號：S1）1.0 g，共6份，按“2.1.1”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1.4”項下方法顯色后，于490 nm波長處測定吸光度并按標(biāo)準(zhǔn)曲線法計算樣品中多糖的含量。結(jié)果，多糖的平均含量為4.36%，含量的RSD為1.36%（n=6），表明本方法重復(fù)性良好。

2.1.10 加樣回收率試驗 取已知含量的藥材樣品（編號：S1），共6份，每份約1.0 g，精密加入葡萄糖對照品44.0 mg，按“2.1.1”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1.4”項下方法顯色后，于490 nm波長處測定吸光度并計算加樣回收率，結(jié)果見表2。

2.1.11 樣品含量測定 取17批藥材樣品適量，按“2.1.1”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1.4”項下方法顯色后，于490 nm波長處測定吸光度并按標(biāo)準(zhǔn)曲線法計算多糖含量，各樣品平行操作3次，結(jié)果見表3。

2.2 聚類分析

以多糖含量為變量，采用SPSS 23.0軟件對數(shù)據(jù)進行標(biāo)準(zhǔn)化處理，以平方歐氏距離為測度進行聚類分析，結(jié)果見圖2。由圖2可知，17批藥材樣品可聚為3類，S1、S6、S10、S12、S13聚為一類，刺五加中多糖平均含量為 4.26%～4.79%;S3～S5、S7聚為一類，刺五加中多糖平均含量為6.44%～7.91%;其余聚為一類，刺五加中多糖平均含量為5.11%～5.79%。

2.3 單因素試驗

2.3.1 提取溫度對刺五加中多糖含量的影響 取藥材樣品（編號：S1）1.0 g，置于干燥錐形瓶中，在超聲提取30 min，料液比1 ∶ 20條件下，考察不同提取溫度（25、35、45、55 ℃）對刺五加中多糖含量的影響，各水平重復(fù)操作3次（下同），結(jié)果見圖3A。由圖3A可知，當(dāng)提取溫度為55 ℃時，刺五加中多糖含量最高，故選擇提取溫度范圍為45～65 ℃。

2.3.2 料液比對刺五加中多糖含量的影響 取藥材樣品（編號：S1）1.0 g，置于干燥錐形瓶中，在超聲提取30 min，提取溫度55 ℃條件下，考察不同料液比為（1 ∶ 10、1 ∶ 20、1 ∶ 30、1 ∶ 40、1 ∶ 50）對刺五加中多糖含量的影響，結(jié)果見圖3B。由圖3B可知，當(dāng)料液比為1 ∶ 20時，刺五加中多糖含量最高，故選擇料液比范圍為1 ∶ 10～1 ∶ 30。

2.3.3 提取時間對刺五加中多糖含量的影響 取藥材樣品（編號：S1）1.0 g，置于干燥錐形瓶中，在提取溫度55 ℃，料液比為1 ∶ 20條件下，考察不同提取時間（15、25、35、45、55 min）對刺五加中多糖含量的影響，結(jié)果見圖3C。由圖3C可知，當(dāng)提取時間為45 min時，刺五加中多糖含量最高，故選擇提取時間范圍為35～55 min。

2.4 刺五加多糖提取工藝優(yōu)化

2.4.1 正交試驗設(shè)計 在單因素試驗基礎(chǔ)上，以提取溫度（A）、料液比（B）、提取時間（C）為考察因素，多糖含量為考察指標(biāo)，采用L9（34）正交試驗設(shè)計優(yōu)化工藝，因素與水平見表4，正交試驗設(shè)計方案與結(jié)果見表5，方差分析結(jié)果見表6。

由表4可知，各因素對刺五加中多糖含量的影響順序依次為B>A>C，其中A2>A1>A3、B1>B2>B3、C3>C1>C2。進一步方差分析可知，提取溫度和料液比對刺五加中多糖含量影響顯著（P<0.05）。因此，從省時降耗及生產(chǎn)實際出發(fā)，在保證提取充分的前提下，綜合分析各因素的影響，得最優(yōu)提取工藝為A2B1C1，即提取溫度55 ℃、料液比1 ∶ 10、提取時間35 min。

2.4.2 驗證試驗 在此最優(yōu)提取工藝條件下，平行操作3次。結(jié)果，刺五加中多糖的平均含量為4.36%（RSD=0.92%，n=3），提示該提取工藝穩(wěn)定、可行。

3 討論

含量測定結(jié)果顯示，17個不同產(chǎn)地刺五加中多糖含量存在差異，其中S7（勃利福興林場）刺五加中多糖的平均含量最高，為7.91%，S12（饒河大頂子山）刺五加中多糖的平均含量最低，4.26%。其原因可能與中藥品質(zhì)的形成除受到植物遺傳作用外，還與土壤、海拔、水分、日照和地形等環(huán)境因素有關(guān)[13-15]。聚類分析結(jié)果顯示，17批藥材樣品可聚為3類，S1、S6、S10、S12、S13聚為一類，S3～S5、S7聚為一類，其余聚為一類。這可能與藥材生長的地理位置、生態(tài)環(huán)境有關(guān)[15]。

與傳統(tǒng)煎煮工藝相比，超聲波產(chǎn)生的強烈振動、超快速度、空化效應(yīng)及攪拌作用等因素均可加速藥材中的有效成分的溶出，具有提取效率高、提取時間短、溶劑用量少等優(yōu)點[16-18]，故本研究參考上述相關(guān)文獻，采用超聲提取法進行提取。

本研究得到的最優(yōu)提取工藝為提取溫度55 ℃、料液比1 ∶ 10、提取時間35 min。在此條件下，刺五加中多糖的平均含量為4.36%，提示工藝穩(wěn)定、可行。

綜上所述，本研究所建含量測定方法操作簡便、重復(fù)性較好，可用于測定刺五加中多糖含量;優(yōu)化后的提取工藝穩(wěn)定、可行。

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（收稿日期：2019-04-08 修回日期：2019-06-18）

（編輯：陳 宏）