朱薪穎 楊苗 徐燦 彭旭 段佳毅 劉丹 王衍堂

摘 要 目的：探討苯并噁唑衍生物2-（氯苯并噁唑基-2基）-4，5，6，7-四氫-二氫-吲唑-3-醇（PO-296）對小鼠骨髓來源樹突狀細(xì)胞（DC）分化及其特異性表面分子、炎癥細(xì)胞因子等相關(guān)指標(biāo)的影響。方法：分離小鼠骨髓核細(xì)胞，以重組小鼠粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子和重組小鼠白細(xì)胞介素4刺激獲取未成熟DC（imDC）;經(jīng)低、中、高劑量（1、5、25 μmol/L）PO-296預(yù)處理后，以脂多糖誘導(dǎo)獲取DC。應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)檢測DC特異性表面分子[即Ⅱ類主要組織相容性復(fù)合物（MHC Ⅱ）、CD80、CD86和趨化因子受體7（CCR7）陽性細(xì)胞比例]的表達(dá)以及imDC吞噬能力（即葡聚糖陽性細(xì)胞比例）和DC存活情況（即存活細(xì)胞比例），采用酶聯(lián)免疫吸附測定法檢測DC培養(yǎng)液中炎癥細(xì)胞因子[白細(xì)胞介素10（IL-10）、IL-12、腫瘤壞死因子α（TNF-α）]水平。結(jié)果：與imDC組比較，空載組MHC Ⅱ、CD80、CD86陽性細(xì)胞比例均顯著升高（P<0.05）。與空載組比較，PO-296各劑量組細(xì)胞培養(yǎng)液中IL-10水平均顯著升高，陽性組以及PO-296中、高劑量組細(xì)胞MHC Ⅱ、CD80、CD86陽性細(xì)胞比例以及各給藥組細(xì)胞培養(yǎng)液中IL-12、TNF-α水平均顯著降低（P<0.05）;而各給藥組CCR7陽性細(xì)胞、葡聚糖陽性細(xì)胞和存活細(xì)胞比例與空載組比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。結(jié)論：PO-296無明顯的細(xì)胞毒性，亦不影響imDC的吞噬功能;同時(shí)，該化合物可抑制DC特異性表面分子的表達(dá)，調(diào)控其炎癥細(xì)胞因子的分泌。

關(guān)鍵詞 PO-296;樹突狀細(xì)胞;特異性表面分子;炎癥細(xì)胞因子;吞噬功能;細(xì)胞毒性

ABSTRACT? ?OBJECTIVE： To investigate the effects of benzoxazole derivative 2-（chlorobenzoxazolyl-2-yl）-4，5，6，7-tetrahydro- dihydro-indazole-3-ol （PO-296） on the differentiation of murine bone marrow-derived dendritic cells（DC） and their related indexes as specific surface molecules and inflammatory cytokines. METHODS： Bone marrow nuclear cells of mice were isolated， and immature DC （imDC） was obtained by recombinant mice granulocyte macrophage colony-stimulating factor and recombinant mice IL-4. After pretreated with low-dose， medium-dose and high-dose （1， 5， 25 μmol/L） of PO-296， DC was obtained by lipopolysaccharide induction. Flow cytometry was used to detect the expression of DC specific surface molecules [i.e. the proportion of class Ⅱ major histocompatibility complex （MHC Ⅱ）， CD80， CD86 and chemokine receptor 7 （CCR7） positive cells]， imDC phagocytosis （i.e. the proportion of dextran positive cells） and DC survival （i.e. the proportion of survival cells）. ELISA method was used to detect the levels of inflammatory cytokines （IL-10， IL-12 and TNF-α） in cell culture medium. RESULTS： Compared with imDC group， the proportion of MHC Ⅱ， CD80 and CD86 positive cells were increased significantly in non-loading group （P<0.05）. Compared with non-loading group， the levels of IL-10 in cell culture medium were increased significantly in PO-296 groups. The proportions of MHC Ⅱ， CD80 and CD86 positive cells in positive group and PO-296 medium-dose and high-dose groups as well as the levels of IL-12 and TNF-α in cell culture medium in administration groups were decreased significantly （P<0.05）. There was no statistical significance in the proportion of CCR7 positive cells， dextran positive cells and survival cells in administration groups， compared with non-loading group （P>0.05）. CONCLUSIONS： PO-296 has no obvious cytotoxicity and does not affect the phagocytic function of imDC. At the same time， the compound can inhibit the expression of DC specific surface molecules and regulate the secretion of inflammatory cytokines.

KEYWORDS? ?PO-296; Dendritic cell; Specific surface molecules; Inflammatory cytokines; Phagocytic function; Cytotoxicity

樹突狀細(xì)胞（Dendritic cell，DC）作為機(jī)體內(nèi)功能最強(qiáng)的抗原呈遞細(xì)胞，在表型和功能上均具有較強(qiáng)的可塑性，可直接活化幼稚T細(xì)胞，在誘導(dǎo)T細(xì)胞免疫應(yīng)答或免疫耐受的過程中發(fā)揮了十分重要的作用[1-2]。有研究指出，DC表型、成熟度及功能的異質(zhì)性是免疫反應(yīng)平衡和免疫耐受的重要因素，其中成熟DC可表達(dá)高水平的共刺激分子，分泌T細(xì)胞刺激因子[如白細(xì)胞介素6（IL-6）、IL-12、IL-15、IL-18等]，選擇性激活相應(yīng)受者的T細(xì)胞，從而誘發(fā)免疫反應(yīng);而未成熟DC（imDC）則可表達(dá)低水平的共刺激分子，通過誘導(dǎo)T細(xì)胞無能、免疫偏離、T細(xì)胞凋亡或者調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Treg細(xì)胞）產(chǎn)生等途徑而形成免疫耐受[3]。藥物誘導(dǎo)的調(diào)節(jié)性樹突狀細(xì)胞（DCreg）更為穩(wěn)定，不會(huì)因脂多糖（LPS）等抗原刺激而分化成熟，其經(jīng)典表型和功能與imDC相似，可正常表達(dá)DC特征性抗原CD11c，而低水平表達(dá)共刺激分子;同時(shí)，其炎癥細(xì)胞因子IL-12、腫瘤壞死因子α（TNF-α）分泌水平降低，抗炎細(xì)胞因子IL-10分泌水平升高[4-5]。如，干擾素β（IFN-β）可干預(yù)體外培養(yǎng)的imDC分化成熟，抑制或減少其IL-12、干擾素γ（IFN-γ）的分泌，進(jìn)而對輔助性T細(xì)胞1型（Th1）的極化起到負(fù)向調(diào)控作用;同時(shí)，IFN-β可刺激Treg細(xì)胞的增殖，該作用也是其對多發(fā)性硬化癥有效的原因之一[6]。目前，國內(nèi)外研究團(tuán)隊(duì)以過繼轉(zhuǎn)移自身抗原負(fù)載的DCreg干預(yù)膠原誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎、實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎以及炎性腸病等自身免疫性疾病動(dòng)物模型為對象進(jìn)行相關(guān)研究，發(fā)現(xiàn)DCreg可明顯減輕上述模型動(dòng)物體內(nèi)炎癥細(xì)胞浸潤程度以及炎癥活動(dòng)度[7-10]。由于干預(yù)自身免疫性疾病動(dòng)物模型所需DCreg的用量較大（約為1×107個(gè)/只）[11]，因此建立獲取大量DCreg的有效方法無疑是其臨床應(yīng)用的重要前提和基礎(chǔ)。本課題組前期通過對一系列小分子化合物的高通量篩選發(fā)現(xiàn)，苯并噁唑衍生物2-（氯苯并噁唑基-2基）-4，5，6，7-四氫-二氫-吲唑-3-醇（PO-296，結(jié)構(gòu)式見圖1）可經(jīng)Janus激酶3/信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子5（Jak3/Stat5）信號通路顯著抑制活化的人T細(xì)胞增殖[12]。而近期研究發(fā)現(xiàn)，Jak3是DC成熟分化的關(guān)鍵調(diào)控因子，該因子缺陷的DC將無法在混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)中有效刺激抗原特異性T細(xì)胞的增殖[13-14]。因此，本研究擬初步探討PO-296是否可經(jīng)Jak3/Stat5信號通路調(diào)控DC成熟分化、誘導(dǎo)DCreg的產(chǎn)生;同時(shí)，建立骨髓來源的DC體外誘導(dǎo)模型，在予以不同劑量的PO-296預(yù)處理后，檢測其特異性表面分子[Ⅱ類主要組織相容性復(fù)合物（MHC Ⅱ）、CD80、CD86、趨化因子受體7（CCR7）]以及炎癥細(xì)胞因子（IL-12、IL-10、TNF-α）的表達(dá)水平，以期為后續(xù)PO-296誘導(dǎo)DCreg對自身免疫疾病動(dòng)物模型的體內(nèi)干預(yù)研究提供更為完善和可靠的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

ACEA NovoCyte型流式細(xì)胞儀[艾森生物（杭州）有限公司];PowerWave XS型全波長酶標(biāo)儀（美國BioTek公司）;371型CO2培養(yǎng)箱、Sorvall型臺式高速離心機(jī)（美國Thermo Fisher Scientific公司）;IX71型倒置顯微鏡（日本Olympus公司）;Mini MACSTM型磁珠分選系統(tǒng)（德國Miltenyi公司）;5424R型小型高速離心機(jī)（德國Eppendorf公司）。

1.2 藥品與試劑

PO-296原料藥（地奧集團(tuán)成都藥業(yè)股份有限公司，批號：1711012-296，純度：≥98%）;托法替尼對照品（陽性對照，美國Sigma公司，批號：PZ0017，純度：≥98%）;重組小鼠粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子（rmGM-CSF）、重組小鼠白細(xì)胞介素4（rmIL-4）（美國Peprotech公司，批號分別為315-03、214-14）;LPS、異硫氰酸熒光素（FITC）- 葡聚糖（美國Sigma公司，批號分別為L4516、53379）;鏈霉親和素微球（德國Miltenyi公司，批號：130-048-102）;熒光素標(biāo)記的大鼠抗小鼠流式檢測抗體Brilliant violet 421-MHCⅡ（BV 421-MHCⅡ）、FITC- CD80、藻紅蛋白（PE）-CD86、Alexa Fluor 647-CCR7以及紅細(xì)胞裂解液（美國BioLegend公司，批號分別為107632、561954、553692、560766、420301）;生物素（Biotin）-CD11c染色試劑、IL-10試劑盒、7-氨基放線菌素（7AAD）/PE-膜聯(lián)蛋白Ⅴ（Annexin Ⅴ）凋亡檢測試劑盒（美國BD Pharmingen公司，批號分別為117303、555157、559763）;IL-6、TNF-α試劑盒（美國eBioscience公司，批號分別為BMS603-2、BMS607-3）;RPMI 1640培養(yǎng)基（美國HyClone公司，批號：SH30809.01）;胎牛血清（澳大利亞Bovogen公司，批號：50615）;其余試劑均為分析純，水為雙蒸水。

1.3 動(dòng)物

SPF級C57BL/6小鼠，雄性，6～8周齡，體質(zhì)量21～23 g，由成都醫(yī)學(xué)院SPF實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物使用許可證號：SYXK（川）2015-196。

2 方法

2.1 DC分離與培養(yǎng)

取雄性C57BL/6小鼠，以脫臼法處死，分離其雙側(cè)股骨，用磷酸鹽緩沖液（PBS，pH 7.2）反復(fù)吹打，制得骨髓細(xì)胞懸液，經(jīng)200目篩網(wǎng)濾過后，以300×g離心5 min，棄去上清液，沉淀用紅細(xì)胞裂解液裂解，計(jì)數(shù)后用含10%胎牛血清、20 ng/mL rmGM-CSF、10 ng/mL rmIL-4的RPMI 1640培養(yǎng)基（以下簡稱“完全培養(yǎng)基”）重懸，調(diào)整細(xì)胞密度至1×106個(gè)/mL，接種于100 mm平皿（接種體積：10 mL）內(nèi)，置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱（下同）中培養(yǎng)。于培養(yǎng)的第3、5天使用上述完全培養(yǎng)基進(jìn)行半量換液（即吸出原培養(yǎng)基5 mL，再加入新培養(yǎng)基5 mL）。于培養(yǎng)的第7天收集細(xì)胞，加入Biotin-CD11c染色，結(jié)合鏈霉親和素微球后，借助磁珠分選系統(tǒng)篩選、純化后得到CD11c陽性imDC（CD11c+imDC）（經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測CD11c陽性細(xì)胞比例超過95%）。將上述經(jīng)純化的CD11c+imDC重懸于完全培養(yǎng)基中，以1×106個(gè)/mL的密度按1 mL/孔重新接種于24孔板中，用最終質(zhì)量濃度為0.1 μg/mL的LPS刺激24 h后，即得成熟DC（成熟DC在顯微鏡下呈現(xiàn)樹突樣特征，且經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測其MHCⅡ、CD80、CD86呈高表達(dá)）。

2.2 DC特異性表面分子檢測

采用流式細(xì)胞術(shù)檢測。取“2.1”項(xiàng)下經(jīng)純化的CD11c+imDC適量，以1×106個(gè)/mL的密度按1 mL/孔接種于24孔板中，將細(xì)胞隨機(jī)分為imDC組、空載組、陽性組（托法替尼，1 μmol/L;劑量設(shè)置參考既往研究[14]，為最大安全、有效劑量）以及PO-296低、中、高劑量組（1、5、25 μmol/L;劑量設(shè)置參考本課題組前期預(yù)試驗(yàn)結(jié)果），每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。吸棄上清液，imDC組和空載組加入完全培養(yǎng)基1 mL，各給藥組加入含相應(yīng)藥物的完全培養(yǎng)基1 mL。培養(yǎng)6 h后，除imDC組外，其余各組均加入最終質(zhì)量濃度為0.1 μg/mL的LPS刺激24 h。收集細(xì)胞，以300×g離心5 min后，棄去上清液，沉淀用4 ℃預(yù)冷的PBS 1 mL清洗，以300×g離心5 min，沉淀分別加入BV 421-MHC Ⅱ、FITC-CD80、PE-CD86、Alexa Fluor 647-CCR7適量，于4 ℃避光孵育30 min，用4 ℃預(yù)冷的PBS 1 mL清洗，以300×g離心5 min，棄去上清液。細(xì)胞用PBS 200 μL重懸后，使用流式細(xì)胞儀檢測MHC Ⅱ、CD80、CD86和CCR7陽性細(xì)胞比例。上述試驗(yàn)重復(fù)3次，數(shù)據(jù)采用NovoExpress 1.3.0軟件分析。

2.3 imDC吞噬功能檢測

采用流式細(xì)胞術(shù)檢測。取“2.1”項(xiàng)下經(jīng)純化的CD11c+imDC適量，以1×106個(gè)/mL的密度按1 mL/孔接種于24孔板中，將細(xì)胞隨機(jī)分為空載組、陽性組以及PO-296低、中、高劑量組（劑量設(shè)置同“2.2”項(xiàng)），每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。吸棄上清液，空載組加入完全培養(yǎng)基1 mL，各給藥組加入含相應(yīng)藥物的完全培養(yǎng)基1 mL。培養(yǎng)48 h后，各組均加入FITC-葡聚糖適量（使后者最終質(zhì)量濃度為1 mg/mL），孵育60 min，經(jīng)4 ℃預(yù)冷的PBS清洗后，采用流式細(xì)胞儀檢測imDC的抗原攝取能力（即其吞噬功能，以葡聚糖陽性細(xì)胞比例表示）。上述試驗(yàn)重復(fù)3次，數(shù)據(jù)采用NovoExpress 1.3.0軟件分析。

2.4 DC存活情況檢測

采用流式細(xì)胞術(shù)檢測。取“2.1”項(xiàng)下經(jīng)純化的CD11c+imDC適量，以1×106個(gè)/mL的密度按1 mL/孔接種于24孔板中，按“2.3”項(xiàng)下方法分組、給藥，培養(yǎng)6 h后，各組均加入最終質(zhì)量濃度為0.1 μg/mL的LPS刺激48 h。收集細(xì)胞，按照7AAD/PE-Annexin Ⅴ凋亡檢測試劑盒說明書操作，采用流式細(xì)胞儀檢測存活DC細(xì)胞的比例（即7AAD/PE-Annexin Ⅴ雙陰性活細(xì)胞的比例）。上述試驗(yàn)重復(fù)3次，數(shù)據(jù)采用NovoExpress 1.3.0軟件分析。

2.5 DC培養(yǎng)液中炎癥細(xì)胞因子水平檢測

采用酶聯(lián)免疫吸附測定法（ELISA）檢測。取“2.1”項(xiàng)下經(jīng)純化的CD11c+imDC適量，以1×106個(gè)/mL的密度按1 mL/孔接種于24孔板中，按“2.3”項(xiàng)下方法分組、給藥，培養(yǎng)6 h后，各組均加入最終質(zhì)量濃度為0.1 μg/mL的LPS刺激24 h。收集細(xì)胞培養(yǎng)液，參照相關(guān)試劑盒說明書，采用ELISA法以全自動(dòng)酶標(biāo)儀檢測各組細(xì)胞培養(yǎng)液中IL-10、IL-12、TNF-α水平。上述試驗(yàn)重復(fù)3次。

2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用Graphpad Prism 6.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料均以x±s表示，組間比較采用Dunnett’s t檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 PO-296對DC特異性表面分子表達(dá)的影響

與imDC組比較，空載組MHC Ⅱ、CD80、CD86陽性細(xì)胞比例均顯著升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。與空載組比較，陽性組以及PO-296中、高劑量組MHC Ⅱ、CD80、CD86陽性細(xì)胞比例均顯著降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;而空載組CCR7陽性細(xì)胞比例與imDC組比較，PO-296低劑量組MHC Ⅱ、CD80、CD86陽性細(xì)胞比例以及各給藥組CCR7陽性細(xì)胞比例與空載組比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），詳見圖2、表1。

3.2 PO-296對imDC吞噬功能及DC存活情況的影響

各給藥組葡聚糖陽性細(xì)胞比例以及存活細(xì)胞比例與空載組比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），詳見圖3、表2。

3.3 PO-296對DC炎癥細(xì)胞因子水平的影響

與空載組比較，PO-296各劑量組細(xì)胞培養(yǎng)液中IL-10水平均顯著升高，各給藥組細(xì)胞培養(yǎng)液中IL-12、TNF-α水平均顯著降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），詳見表3。

4 討論

近年來，隨著細(xì)胞免疫治療在感染性疾病、自身免疫性疾病、腫瘤等領(lǐng)域的快速發(fā)展，DC已逐漸成為過繼轉(zhuǎn)移治療研究的熱點(diǎn)。因自身免疫性疾病相關(guān)的自身抗原尚不明確，在臨床試驗(yàn)中DCreg不能負(fù)載有效的自身抗原，從而誘導(dǎo)自身抗原特異性T細(xì)胞耐受，因此無法重復(fù)DCreg對動(dòng)物疾病模型的干預(yù)效果[4，15]。而新近發(fā)現(xiàn)和鑒定的自身抗原（如尋常性天皰瘡相關(guān)的Desmoglein-3;多發(fā)性硬化相關(guān)的B-crystallin、Anoctamin 2和KIR4.1等）為DCreg過繼轉(zhuǎn)移治療自身免疫性疾病帶來了新的希望[16-17]。繼往獲取DCreg的主要手段包括免疫抑制劑類藥物誘導(dǎo)[18]、細(xì)胞凋亡分子表達(dá)[19]、細(xì)胞因子培養(yǎng)體系建立[20]以及基因工程技術(shù)等[21]，但現(xiàn)有臨床試驗(yàn)的某些免疫抑制類誘導(dǎo)藥物（如阿司匹林、N-乙酰半胱氨酸以及環(huán)孢素A等）誘導(dǎo)的DCreg特異性較差，細(xì)胞毒性較大，且上述方法存在研究成本較高、周期較長等缺點(diǎn)，導(dǎo)致其后續(xù)深入研究受到了一定的限制[22]。因此，亟需尋找安全、高效的DCreg新型小分子誘導(dǎo)藥物。

本課題組前期對抑制T細(xì)胞增殖的小分子化合物進(jìn)行了篩選，發(fā)現(xiàn)了一系列具有抑制活性的苯并噁唑衍生物。其中，PO-296可經(jīng)Jak3/Stat5信號通路有效抑制人T細(xì)胞增殖，是一種新型的免疫抑制劑[12]。而近期國外研究發(fā)現(xiàn)，Jak3在DC的分化成熟過程中非常重要，當(dāng)胞外配體與DC膜受體結(jié)合后可激活Jak3，繼而引起Stat5的酪氨酸磷酸化，啟動(dòng)下游的一系列炎癥細(xì)胞因子（如IL-10、IL-12、TNF-α）和共刺激分子（如，即特異性表面分子MHC Ⅱ、CD80和CD86）的轉(zhuǎn)錄，從而發(fā)揮對T細(xì)胞增殖的抑制作用[13-14]。因此，本課題組推測PO-296有可能經(jīng)Jak3/Stat5信號通路調(diào)控DC的成熟分化，并誘導(dǎo)免疫耐受的發(fā)生。托法替尼由美國Pfizer公司研發(fā)，并于2012年11月獲美國FDA批準(zhǔn)上市，對Jak3/Stat5信號通路具有明顯的抑制作用，故本研究將其作為陽性對照藥物[14]。

本研究以骨髓來源的DC體外誘導(dǎo)模型為對象，初步探討了經(jīng)PO-296預(yù)處理后DC特異性表面分子MHC Ⅱ、CD80、CD86、CCR7以及炎癥細(xì)胞因子IL-10、IL-12、TNF-α的表達(dá)情況。其中，MHC Ⅱ是DC向輔助T細(xì)胞呈遞自身抗原肽的關(guān)鍵分子，CD80、CD86則是DC活化自反應(yīng)性T細(xì)胞的重要共刺激分子，三者的表達(dá)水平在DC成熟分化后均明顯升高，是DC成熟分化的重要標(biāo)志物[4]。CCR7是成熟DC和imDC重要的趨化因子受體，與DC的歸巢以及其向非淋巴組織的遷移密切相關(guān)[3]。此外，成熟DC通過分泌IL-12、TNF-α等炎癥細(xì)胞因子來調(diào)控Th1的分化以及自身免疫性炎癥反應(yīng)的發(fā)生[6]。而IL-10則是重要的免疫負(fù)調(diào)控因子，可抑制單核巨噬細(xì)胞炎癥細(xì)胞因子的分泌以及自身免疫性T細(xì)胞的增殖活化[23]。本研究結(jié)果顯示，空載組MHC Ⅱ、CD80、CD86陽性細(xì)胞比例均較imDC顯著升高;經(jīng)藥物預(yù)處理后，PO-296各劑量組細(xì)胞培養(yǎng)液中IL-10水平均較空載組顯著升高，陽性組以及PO-296中、高劑量組細(xì)胞MHC Ⅱ、CD80、CD86陽性細(xì)胞比例以及各給藥組細(xì)胞培養(yǎng)液中IL-12、TNF-α均較空載組顯著降低;而各給藥組CCR7陽性細(xì)胞比例均未見顯著差異。這提示該化合物誘導(dǎo)的DC呈現(xiàn)出經(jīng)典的DCreg表型[4-5]，且所得DCreg在抗原呈遞及共刺激作用明顯增強(qiáng)的同時(shí)，其趨化因子受體的表達(dá)并未受到明顯影響，該DCreg可正常趨化轉(zhuǎn)移至炎癥組織以發(fā)揮免疫調(diào)控作用[3]。

本研究還考察了PO-296對imDC吞噬功能（imDC表達(dá)低水平的共刺激因子，刺激T細(xì)胞免疫應(yīng)答的能力較低，但具有極強(qiáng)的抗原吞噬能力，因此吞噬功能的考察主要以imDC為主[3]）及DC存活情況的影響。結(jié)果顯示，經(jīng)不同劑量PO-296預(yù)處理后，DC葡聚糖陽性細(xì)胞比例以及存活細(xì)胞比例與空載組比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。這提示不同劑量的PO-296不會(huì)影響imDC的吞噬功能，且無明顯細(xì)胞毒性，證實(shí)PO-296對DC成熟分化的干預(yù)作用與藥物影響DC抗原攝取和細(xì)胞毒性無關(guān)。

綜上所述，苯并噁唑衍生物PO-296無明顯的細(xì)胞毒性，亦不影響imDC的吞噬功能，同時(shí)其可抑制特異性表面分子的表達(dá)，調(diào)控炎癥細(xì)胞因子的分泌，繼而誘導(dǎo)DCreg的形成。這一發(fā)現(xiàn)為PO-296誘導(dǎo)的DCreg在負(fù)載自身抗原后對自身免疫性疾病動(dòng)物模型的干預(yù)研究提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。未來本課題組將深入探討PO-296誘導(dǎo)的DCreg干預(yù)自身免疫性疾病發(fā)生發(fā)展的過程，以及其免疫調(diào)控作用的具體機(jī)制，為其在免疫耐受以及自身免疫性疾病治療中的應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

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?（收稿日期：2019-01-07 修回日期：2019-06-14）

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