劉蕾 何光志 王文佳

摘 要 目的：獲取銀杏抗菌肽（GBA）重組蛋白，并考察其體內外抗菌活性，為解決病原菌耐藥問題、規(guī)?；a(chǎn)植物源性新型抗菌劑提供實驗基礎。方法：根據(jù)Genebank中公布的GBA基因序列（FJ865399），利用基因技術構建重組質粒pET32a（+）-GBA，再以大腸桿菌原核表達獲取重組蛋白，并采用凝膠電泳和Western blotting法對所得蛋白進行純化及鑒定。采用紙片擴散法考察所獲重組蛋白對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、綠膿桿菌、鼠傷寒沙門氏菌的藥物敏感度;采用肉湯稀釋法測定重組蛋白最小抑菌濃度（MIC）和最低殺菌濃度（MBC）;考察重組蛋白對金黃色葡萄球菌感染模型小鼠的保護作用。結果：成功表達并純化獲得目標重組蛋白（大小約32 kDa）。該重組蛋白對金黃色葡萄球菌中度敏感，對其他3種細菌低度敏感;對金黃色葡萄球菌的MIC為（50.00±5.00）mg/mL、MBC為（138.33±12.58）mg/mL，MIC顯著高于其他3種細菌（P<0.05）。高劑量重組蛋白（8.0 g/kg）能顯著降低金黃色葡萄球菌導致的小鼠死亡率（P<0.05），對小鼠的保護效果與陽性藥物青霉素接近。結論：所獲重組蛋白對金黃色葡萄球菌的抑制效果明顯，對大腸桿菌和綠膿桿菌有一定的抑制作用，對鼠傷寒沙門氏菌抑制作用較弱;該蛋白高劑量給藥對金黃色葡萄球菌感染小鼠具有明顯的保護作用。

關鍵詞 銀杏;抗菌肽;載體質粒;重組蛋白;原核表達;抑菌作用;體內;體外;小鼠

ABSTRACT? ?OBJECTIVE： To obtain Ginkgo biloba antimicrobial peptide （GBA） recombinant protein， and to investigate in vivo/in vitro antimicrobial activity of the protein so as to provide experimental basis for solving bacterial resistance and large-scale production of new plant-derived antimicrobial agents. METHODS： Based on gene technology， according to GBA gene sequence? ?（FJ 865399） published by Genebank， recombinant expression vector plasmid pET32a（+）-GBA was constructed. Prokaryotic expression of recombinant protein was conducted by Escherichia coli， and then the protein was purified and identified by gel electrophoresis and Western blotting. Drug sensitivity of obtained recombinant protein to E. coli， Staphylococcus aureus， Pseudomonas aeruginosa， Salmonella typhimurium were investigated by Kirby-Bauer test. The minimum antibacterial concentration （MIC） and minimum bactericidal concentration （MBC） were determined by broth dilution method. The protective effects of recombinant protein on S. aureus infection model mice were investigated. RESULTS： Target recombinant protein was expressed successfully and purified （molecular weight of 32 kDa）. The recombinant protein was moderately sensitive to S. aureus and low sensitive to other three bacterias. MIC and MBC of the recombinant protein to S. aureus were （50.00±5.00）mg/mL and（138.33±12.58）mg/mL， and MIC was significantly higher than those to other 3 kinds of bacterias （P<0.05）. High-dose of recombinant protein （8.0 g/kg） could significantly reduce the S. aureus-induced mortality of mice （P<0.05）， and had similar protective effect as positive drug penicillin. CONCLUSIONS： Obtained recombinant protein has obvious antimicrobial effects on S. aureus， inhibits E. coli and P. aeruginosa to certain extent and shows poor inhibitive effect on S. typhimurium. High-dose of? recombinant protein shows significant protective effect for S. aureus infection model mice.

KEYWORDS? ?Ginkgo biloba; Antimicrobial peptide; Vector plasmid; Recombinant protein; Prokaryotic expression; Antimicrobial effect; in vivo; in vitro;Mice

近年來，由于抗生素的濫用導致許多耐藥菌株出現(xiàn)，這對人類生命健康安全構成了巨大威脅，如何解決病原菌對抗生素的耐藥問題已迫在眉睫，現(xiàn)已成為生物、醫(yī)藥領域的研究熱點?？咕模ˋntimicrobial peptides），也稱為肽類抗生素或天然抗生素，是一類由20～60個氨基酸殘基組成，對細菌、真菌等微生物及某些昆蟲和植物細胞具有抑制作用的小分子多肽[1]。從1972年瑞典科學家Boman HG等首次成功分離天蠶素（Cecropin）開始，到目前為止，已發(fā)現(xiàn)并分離獲得多種具有抗菌作用的活性多肽，并根據(jù)其來源分為哺乳動物抗菌肽、水生動物抗菌肽、兩棲類抗菌肽、昆蟲抗菌肽、植物抗菌肽和細菌抗菌肽等類別[2]。已有研究發(fā)現(xiàn)，抗菌肽對部分真菌、細菌和病毒具有明顯殺傷作用，能促進傷口愈合[3]，其在抗菌領域的應用價值受到了學者的廣泛關注，也成為了研究熱點。

我國有著豐富的藥用植物資源，其中銀杏（Ginkgo biloba Linn.）在我國種植歷史悠久、資源豐富，其藥用價值在古代中醫(yī)典籍中也早有記載。現(xiàn)代研究證實，銀杏葉提取物中的銀杏酸、銀杏酚酸等成分具有一定的抑菌活性[4-5]。但銀杏提取物的抑菌效果受原料來源、溫度條件、pH值等因素影響較大，且存在抑菌成分駁雜、分離過程繁瑣、產(chǎn)量低、質量難以控制等缺點[6]。近年來，隨著分子生物學等技術的不斷發(fā)展，深入開發(fā)利用中藥植物資源成為可能，如劉縉等[7]從銀杏種仁中分離純化出一種抗菌蛋白，命名為GNK2-1，并證實其對黃瓜鐮刀孢菌具有較強的抑制作用;又如荊貝貝[1]從銀杏種仁中分離純化得到抗菌肽，其對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌以及黃瓜鐮刀孢菌等14種真菌均有一定的抑制作用。上述研究主要是從銀杏種仁原料中分離得到具有抑菌活性的銀杏抗菌肽，但這一過程對植物原料種屬及質量等要求高，加之工藝步驟較繁瑣、工藝條件要求較高，使得純化蛋白產(chǎn)量較低?；诖?，本研究利用現(xiàn)代分子生物學技術深入開發(fā)銀杏抗菌多肽，根據(jù)Genebank（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov）中公布的一種具有抑菌活性的銀杏抗菌肽（Ginkgo biloba antimicrobial peptide，GBA）基因序列（編號：FJ865399），對該抗菌肽進行重組蛋白載體構建，再以大腸桿菌原核表達獲取重組蛋白，并考察所得重組蛋白對臨床常見致病菌的抑制活性[8-9]，旨在簡化抗菌肽的制備環(huán)節(jié)、實現(xiàn)抗菌肽重組蛋白的規(guī)?；a(chǎn)，為解決病原菌耐藥問題、進一步開發(fā)利用及規(guī)?；a(chǎn)植物源性新型抗菌劑提供實驗基礎。

1 材料

1.1 儀器

UV-900S型紫外-分光光度計（上海元析儀器有限公司）;PowerPacTM Basic型多功能電泳儀、T100 Thermal Cycle型梯度聚合酶鏈反應（PCR）儀（美國Bio-Rad公司）;TD5A-WS型低速大容量離心機（湖南湘立科學儀器有限公司）;CJ-1D型潔凈工作臺（天津市泰斯特儀器有限公司）;Micro 21R型高速離心機、ChemiDocTM XRS+型凝膠成像儀（美國Thermo Fisher Scientific公司）;EL104型電子天平[梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司]。

1.2 藥品與試劑

重組表達質粒pET32a（+）-GBA、TB培養(yǎng)基[吉爾生化（上海）有限公司];M-H培養(yǎng)基（杭州天和微生物試劑有限公司）;氨芐青霉素（Amp）、DNA Marker、考馬斯亮藍R250（北京索萊寶科技有限公司）;高純質粒小量制備試劑盒（北京百泰克生物技術有限公司，批號：00091512）;PVDF膜（美國Millipore公司）;蛋白Marker（上海碧云天生物技術有限公司）;兔源His標簽多克隆抗體（上海博耀生物科技有限公司，批號：SZB0053）;羊抗兔辣根過氧化物酶（HRP）標記IgG二抗（北京中杉金橋生物技術有限公司，批號：ZB-2301）;Ni-Agarose His標簽蛋白純化試劑盒（包涵體蛋白）（康為世紀生物技術有限公司，批號：00091512）;異丙基硫代半乳糖苷（IPTG）、PH0311細菌細胞總蛋白提取試劑盒、LB培養(yǎng)基、膠回收試劑盒及AEC底物顯色試劑盒、十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）試劑[生工生物工程（上海）股份有限公司];其余試劑均為分析純或實驗室常用規(guī)格，水為無菌蒸餾水。

1.3 動物

健康IR小鼠，雌雄各半，體質量20～22 g，購自重慶騰鑫生物技術有限公司[動物生產(chǎn)合格證號：SCXK（渝）2017-0007]。動物均在環(huán)境溫度（20±3）℃、濕度（55±5）%的條件下適應性喂養(yǎng)7 d后進行后續(xù)實驗，期間正常飲食。本實驗過程符合動物福利準則。

1.4 菌株

感受/表達態(tài)大腸桿菌由吉爾生化（上海）有限公司提供;大腸桿菌（ATCC 35218）、金黃色葡萄球菌（ATCC 25923）、綠膿桿菌（ATCC 27853）和鼠傷寒沙門氏菌（CMCC 50115）菌株均由貴州中醫(yī)藥大學形態(tài)實驗室提供。

2 方法

2.1 重組蛋白的合成與鑒定

本課題組參考相關文獻[10-13]，委托吉爾生化（上海）有限公司和生物生工（上海）股份有限公司構建重組質粒pET32a（+）-GBA及酶切鑒定，并進行重組質粒的轉化、陽性克隆篩選和重組蛋白的表達、純化及鑒定。

2.1.1 重組質粒構建與酶切鑒定 根據(jù)Genebank中公布的GBA序列（編號：FJ865399）的ORF（開放閱讀框）序列片段（405 bp），采用Primer Premier 5.0軟件設計上下游含限制性內切酶BamH I和Xho I識別位點的序列，利用PCR技術擴增，經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳回收PCR產(chǎn)物。采用BamH I和Xho I酶切PCR產(chǎn)物和表達載體pET32a（+）質粒?；厥彰盖挟a(chǎn)物，取5 μL經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳初步鑒定酶切所得基因片段大小與目標片段一致后，回收純化酶切產(chǎn)物，并通過T4 DNA連接酶將目的基因序列定向克隆至pET32a（+）質粒的BamH I和Xho I位點，獲得重組質粒。

2.1.2 重組質粒轉化及陽性克隆篩選 將“2.1.1”項下重組質粒通過冷刺激法轉化到感受態(tài)大腸桿菌BL21（DE3）菌株中;取已轉化菌株，接種至含有100 ng/mL Amp的TB培養(yǎng)基（以下簡稱“含Amp培養(yǎng)基”）中，于37 ℃條件下倒置培養(yǎng)12～16 h。對培養(yǎng)所得單菌落進行基因測序，取測序結果證實為陽性的菌株繼續(xù)培養(yǎng)，提取重組質粒，轉化到表達態(tài)大腸桿菌Rosetta gami菌株中。轉化后的表達菌株進行復蘇培養(yǎng)后，取適量，接種至含100 μg/mL Amp、15 μg/mL卡那霉素、34 μg/mL克林霉素的LB培養(yǎng)基中，于37 ℃倒置培養(yǎng)至對數(shù)生長期，挑取單菌落進行基因測序，檢測判斷是否轉化成功。

2.1.3 重組蛋白的表達 挑取“2.1.2”項下經(jīng)基因測序證實轉化成功的菌株，接種至含Amp的LB培養(yǎng)基，置于100 mL培養(yǎng)瓶中，于37 ℃下以220 r/min搖床培養(yǎng)過夜。取培養(yǎng)完畢的菌液，按1%的體積比接種至含Amp的LB培養(yǎng)基，于37 ℃下以220 r/min搖床培養(yǎng)至對數(shù)生長期時，加入終濃度為1 mmol/L的誘導劑IPTG，在37 ℃下誘導蛋白表達3 h。將表達完畢的菌液以5 000 r/min離心5 min，收集沉淀，以磷酸鹽緩沖液（pH7.4）重懸菌液，超聲（功率：400 W，頻率：60 kHz）處理直至細胞破碎，再以12 000 r/min離心30 min，取其上清和沉淀分別進行SDS-PAGE分析后顯示，重組蛋白主要存在于沉淀中，表明所得目標蛋白以包涵體形式存在。

2.1.4 重組蛋白的復性與純化 取“2.1.3”項下包涵體沉淀，采用PH0311細菌細胞總蛋白提取試劑盒提取重組蛋白。將蛋白提取液置于透析袋中，并以復性液作用過夜。取復性完畢后的提取液，在4 ℃下以13 000 r/min離心15 min，取沉淀重新溶解于含8 mol/L尿素的Bin- ding buffer中，再次采用復性液進行作用，重復操作3次。取復性后的上清液，采用Ni-Agarose His標簽蛋白純化試劑盒過柱純化。將純化后的重組蛋白液冷凍干燥，即得。

2.1.5 純化重組蛋白分子量的測定 取“2.1.4”項下純化后重組蛋白，加無菌蒸餾水制成質量濃度為0.4 g/mL的溶液，以氫氧化鈉調節(jié)pH為7.0～7.2，采用SDS-PAGE進行純度檢測及回收。采用Western blotting法，將純化蛋白轉膜并先后加入一抗兔源His-tag抗體（1 ∶ 3 000）、羊抗兔HRP標記IgG二抗（1 ∶ 3 000）進行孵育，然后采用AEC底物顯色試劑盒進行顯色反應，按說明書方法計算重組蛋白分子量。

2.2 重組蛋白的體內外抑菌作用考察

2.2.1 重組蛋白對4種常見細菌的藥物敏感度考察 參考文獻方法[14-16]并加以改良，采用紙片擴散法進行體外藥敏試驗。取“2.1.4”項下所得純化重組蛋白，以無菌蒸餾水制成質量濃度為0.4 g/mL的溶液，將6 mm圓形定性濾紙片在該溶液中浸泡2 h，烘干，制成藥敏紙片，備用;另同法以無菌生理鹽水浸泡濾紙，制成陰性對照紙片。取大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、綠膿桿菌和鼠傷寒沙門氏菌菌株，接種于無選擇性的LB瓊脂培養(yǎng)基上，于37 ℃下孵育過夜后，挑取菌落適量，加入生理鹽水，混勻，得5×107～5×108 CFU/mL的菌懸液。取上述菌懸液，分別均勻涂于M-H培養(yǎng)基平板，每個平板貼2片重組蛋白藥敏紙片和1片陰性對照紙片，于37 ℃下培養(yǎng)16 h后，測量抑菌環(huán)直徑。按抑菌圈直徑判斷藥物敏感度：抑菌圈直徑>20 mm者為極度敏感，15～20 mm者為高度敏感，10～14 mm者為中度敏感，>0～<10 mm者為低度敏感，0 mm者為無敏感性[17]。每種菌株平行測定3次。

2.2.2 重組蛋白對4種常見細菌的最小抑菌濃度（MIC）和最低殺菌濃度（MBC）測定 參照文獻方法[18-20]，采用肉湯稀釋法進行測定。取“2.1.4”項下所得純化重組蛋白，在96孔板中采用M-H液體培養(yǎng)基倍比稀釋，每孔加入“2.2.1”項下4種菌懸液各0.01 mL，作為給藥組;同時設置不加菌液、只加入相應不同質量濃度的重組蛋白溶液孔作為空白對照組。各組細胞在37 ℃培養(yǎng)18 h后，采用紫外分光光度計在550 nm波長處測定吸光度。以給藥組培養(yǎng)孔未出現(xiàn)混濁變化、且吸光度值與空白對照比較無明顯差異所對應的最高藥物濃度作為該重組蛋白對上述各細菌的MIC[17]。另吸取給藥組培養(yǎng)液0.01 mL至LB培養(yǎng)基平板，于37 ℃下培養(yǎng)18 h后，以平板上無任何菌落生長對應的最低藥物濃度作為該重組蛋白對上述各細菌的MBC[18]。每種菌株平行測定3次。

2.2.3 重組蛋白對金黃色葡萄球菌感染模型小鼠的保護作用考察 根據(jù)體外抑菌考察結果，以金黃色葡萄球菌為對象，參照文獻方法[19-20]確定其對小鼠的100%致死劑量（100%MLD）。取金黃色葡萄球菌，在M-H平板上于37 ℃培養(yǎng)6 h，取菌落適量，研磨，加入生理鹽水制成濃度約為10×109、5×109、2.5×109個/mL的菌懸液，然后按每100 mL菌懸液加入酵母5 mg，混勻。取健康小鼠30只，隨機分為3組，每組10只，分別腹腔注射上述含酵母的不同濃度菌懸液（0.5 mL/只）。每日觀察小鼠死亡情況，確定金黃色葡萄球菌對小鼠的100%MLD約為10×109個/mL[21]。

參照文獻方法[19-21]考察重組蛋白對金黃色葡萄球菌感染模型小鼠的保護作用。取小鼠60只，隨機分為空白對照組、細菌對照組、陽性藥物組（青霉素，0.98 g/kg[21]）和重組蛋白低、中、高劑量組（2.0、4.0、8.0 g/kg，參照陽性藥物的臨床劑量換算制定，其中重組蛋白的高劑量與陽性藥物臨床用藥量較為接近），每組10只。各組小鼠實驗前均禁食16 h，然后灌胃相應藥液（20 mL/kg，青霉素或重組蛋白均以生理鹽水配制），空白對照組和細菌對照組小鼠灌胃等體積生理鹽水，每日1次，連續(xù)給藥7 d。在第7天給藥30 min后，除空白對照組外，其余各組小鼠腹腔注射濃度約為10×109個/mL（即100%MLD，以生理鹽水配制）的金黃色葡萄球菌菌液（0.5 mL/只），繼續(xù)給藥，每日1次，連續(xù)5 d。觀察并記錄感染5 d內的小鼠死亡情況，以死亡率來評價對金黃色葡萄球菌感染模型小鼠的保護作用[20-21]。實驗重復3次。

2.3 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 13.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。計數(shù)資料以例數(shù)或率表示，組間比較采用χ 2檢驗;計量資料以x±s表示，組間比較采用方差分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

3 結果

3.1 重組質粒的鑒定結果

對重組質粒經(jīng)BamH I和Xho I進行雙酶切后，其產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠后顯示，在250～500 bp處有明顯條帶（見圖1箭頭處），與預期插入的目的基因片段（405 bp）大小接近，表明成功獲得目標重組質粒，詳見圖1（注：重組表達質粒電泳圖最上方條帶是切下的載體片段，下方條帶是目的片段）。

3.2 重組蛋白的鑒定結果

所得重組蛋白（包涵體蛋白形式）經(jīng)SDS-PAGE電泳和Western blotting法分析其表達蛋白和轉膜回收蛋白后顯示，在近35 kDa處均出現(xiàn)一條明顯的條帶（見圖2箭頭處），與預期基因序列表達蛋白分子量（14.5 kDa）和pET32a上標簽表達蛋白的分子量（17 kDa）之和（約32 kDa）接近，表明成功獲得目標重組蛋白，詳見圖2。

3.3 重組蛋白對4種常見細菌的藥物敏感度檢測結果

重組蛋白對金黃色葡萄球菌為中度敏感，對大腸桿菌、綠膿桿菌和鼠傷寒沙門氏菌均為低度敏感。重組蛋白對4種常見細菌的藥敏試驗結果見表1。

3.4 重組蛋白對4種常見細菌的MIC和MBC測定結果

重組蛋白對金黃色葡萄球菌的MIC值顯著低于其他3種細菌，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），提示其對金黃色葡萄球菌的抑制活性最明顯。重組蛋白對4種常見細菌MIC和MBC的測定結果見表2（注：“無殺菌作用”是指各劑量組的細胞孔均有細菌生長）。

3.5 重組蛋白對金黃色葡萄球菌致小鼠死亡的影響

與空白對照組比較，細菌對照組小鼠死亡率顯著升高，達到100%，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.01）;與細菌對照組比較，陽性藥物組和重組蛋白高劑量組小鼠死亡率均顯著降低，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05），且兩組組間差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）;而重組蛋白中、低劑量組小鼠死亡率與細菌對照組比較差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。各組小鼠死亡率比較見表3。

4 討論

在我國，銀杏的藥用價值早有記載。明代李時珍的《本草綱目》中載銀杏有：“熟食溫肺、益氣、定喘嗽、縮小便、止白濁;生食降痰、消毒殺蟲”之效。清代張璐璐的《本經(jīng)逢源》中載銀杏果，又稱白果，有降痰、清毒、殺蟲之功能，可治療“瘡疥疽瘤、乳癰潰爛、牙齒蟲齲、小兒腹瀉、 赤白帶下、慢性淋濁、遺精遺尿等癥”?，F(xiàn)代研究也證實，銀杏內含有的銀杏黃酮、銀杏內酯、銀杏多糖、白果酸、果仁蛋白等多種生物活性物質，具有抑菌、防治心腦血管疾病、對抗血小板活化因子、預防老年癡呆、抗炎及抗腫瘤等作用[22]。已有報道顯示，銀杏中含有抗菌肽，如荊貝貝[1]通過提取銀杏種仁的總RNA，通過建立反轉錄體系表達純化得到具有抗細菌和真菌作用的活性蛋白;高寧寧[23]將銀杏種仁抗菌肽基因Gnk2-1轉化甜瓜和西瓜的研究也提示其可增強植物的抗菌能力。

已有研究證實，抗菌肽與微生物的相互作用機制是通過抗菌肽所帶正電荷殘基與微生物細胞膜表面負電荷靜電相互吸引結合后，與細胞膜發(fā)生相互作用而破壞細胞膜完整性[24]，而原核細胞和真核細胞膜間的電荷區(qū)別正是抗菌肽能選擇性作用于微生物，而對真核細胞幾乎無毒性或低毒性、不易造成耐藥的重要原因之一。抗菌肽的抗菌譜廣、起效快速、不易產(chǎn)生蓄積中毒，因此可用于食品防腐、農業(yè)生產(chǎn)、愈合劑等，并有望成為新一代的抗菌、抗病毒藥物，有廣泛的開發(fā)應用前景[25]。然而，天然抗菌肽的來源少、分離提取成本高，無法滿足基礎研究及臨床使用需求，而利用DNA重組技術開發(fā)穩(wěn)定性更高、殺菌活性更強、殺菌譜更廣、毒副作用更小的抗菌肽逐漸成為關注熱點[26]。本研究通過人工合成GBA基因序列，將其插入pET32a（+）表達載體后再以大腸桿菌進行誘導表達，獲得了重組蛋白（分子量約32 kDa）。對該重組蛋白進行體外藥敏試驗和MIC/MBC的測定后顯示，其對金黃色葡萄球菌的抑制效果明顯，對大腸桿菌和綠膿桿菌有一定的抑制作用，對鼠傷寒沙門氏菌抑制作用較弱;在小鼠體內實驗結果顯示，該重組蛋白高劑量給藥能顯著降低金黃色葡萄球菌感染導致的小鼠死亡率，且與抗生素青霉素的效果比較差異無統(tǒng)計學意義;而中、低劑量重組蛋白給藥對小鼠的保護作用不明顯?？紤]到抗菌肽抑菌機制主要是通過與細胞膜結合引起膜破損而發(fā)揮作用，故細胞膜的不同組成對抗菌肽的活性和選擇性毒性有很大影響，且抗菌肽在細胞膜上形成孔的能力主要與抗菌肽的濃度和環(huán)境pH值有關[27-30]，因此筆者認為這也是本研究所測得重組蛋白對不同菌種的體外抑菌效果有所不同、高劑量給藥對金黃色葡萄球菌感染小鼠的保護作用更強的原因所在。

本研究由于受試菌種較少，故尚未充分明確其對革蘭氏陰性或陽性菌抑制作用的抗菌譜。同時，由于抗菌肽的抗菌活性與肽分子的空間結構密切相關，體外合成的抗菌肽與天然抗菌肽雖然一級結構一致，但空間結構卻不盡相同，因此活性可能存在差異;此外，還存在可引起宿主細胞發(fā)生“自殺”而導致抗菌肽產(chǎn)量低的現(xiàn)象[31]。后續(xù)研究中，本課題組擬對GBA基因采用真核表達獲取蛋白，與大腸桿菌原核表達所獲重組蛋白以及銀杏中天然抗菌蛋白的活性進行比較;同時，采用更多表達載體進行考察，探尋更合適的載體用于后續(xù)重組蛋白的規(guī)?；a(chǎn)，為新型抗菌劑的開發(fā)奠定基礎。

參考文獻

[ 1 ] 荊貝貝.銀杏種仁抗菌肽的分離純化、性質鑒定及其總RNA提取[D].楊凌：西北農林科技大學，2006.

[ 2 ] 鄭加蘭.抗菌肽的研究與應用[J].江西飼料，2010（1）：14-18.

[ 3 ] HOFFMANN JA，HETRU C. Insect defensive：inducible antibacterial peptide [J]. Immunol Today，1992，13（10）：411-415.

[ 4 ] 楊小明，葉允榮，王萍，等.銀杏葉提取物和銀杏酸的抗菌活性研究[J].食品科學，2004，25（4）：68-71.

[ 5 ] 曾獻，龔玉子，王煥嬌.銀杏葉的藥理作用[J].湖南林業(yè)科技，2008，35（1）：6-8.

[ 6 ] 曲曉華，辛玉峰.銀杏提取物抑菌效果的研究[J].黑龍江農業(yè)科學，2008，31（1）：25-26.

[ 7 ] 劉縉，王亞紅，王強，等.銀杏果仁抗菌蛋白的分離純化及其基因克隆和原核表達初步研究[J].農業(yè)生物技術學報，2010，18（2）：246-253.

[ 8 ] 謝坤，譚玉婷，王靖，等.家蠶抗菌肽基因BmCecropinD的克隆及重組蛋白的自誘導表達[J].動物醫(yī)學進展，2018，39（5）：13-17.

[ 9 ] GAVIT P，BETTER M. Production of antitungal recombinant peptides in Escherichia coli[J]. J? ?Biotechnol，2000，79（2）：127-136.

[10] APIWATTANAKUL N，THOMAS PG，KUHN RE，et al. Helminth infections predispose mice to pneumococcal pneumonia but not to other pneumonic pathogens[J]. Med Microbiol Immunol，2014，203（5）：357-364.

[11] PENG L，XU Z，F(xiàn)ANG X，et al. High-level expression of soluble human defensin-2 in Escherichia coli[J]. Process Biochem，2004，39（12）：2199-2205.

[12] RAO X，HU J，LI S，et al. Design and expression of peptide antibiotic hPAB-β as tandem muhimers in Escherchia coli[J]. Peptides，2005，26（5）：721-729.

[13] MOON JY，HENZLER-WILDMAN KA，RAMAMOORTHY A. Expression and purification of a recombinant LL- 37 from Escherichia coli[J]. Biochim Biophys Acta，2006，1758（9）：1351-1358.

[14] 李珍，李從榮.細菌快速藥敏試驗方法研究進展[J].檢驗醫(yī)學與臨床，2016，13（8）：1142-1144.

[15] 譚瑤，趙清，舒為群，等.K-B紙片擴散法藥敏試驗[J].檢驗醫(yī)學與臨床，2010，7（20）：2290-2291.

[16] 王輝，徐英春，陳民鈞.簡要介紹美國NCCLS藥敏試驗紙片擴散法法規(guī)（1993年12月版）[J].中華醫(yī)學檢驗雜志，1995，18（1）：60-62.

[17] 李國旺，苗志國，趙恒章.大黃的體外抑菌實驗[J].光譜實驗室，2011，28（1）：67-68.

[18] 李漢浠，任賽賽，李勇，等.楓楊萘醌對常見菌的抗菌譜、最低抑菌濃度和最低殺菌濃度研究[J].時珍國醫(yī)國藥，2012，23（6）：1422-1424.

[19] 劉富來，馮翠蘭. 1株產(chǎn)腸毒素金黃色葡萄球菌致死小鼠的初步研究[J].中國動物檢疫，2010，27（4）：50-51.

[20] 秦文艷，趙金明，齊越，等.射干提取物體內體外抑菌作用的研究[J].中國實驗方劑學雜志，2011，17（4）：147-150.

[21] 林海，龔又明，鄧廣海.黃柏及其炮制品水提物體內、外抑菌作用研究[J].中國藥房，2012，23（31）：2900-2902.

[22] 吳黎，歐紫，劉蕾.銀杏抗菌作用研究進展[J].健康之路，2018，17（10）：22.

[23] 高寧寧.銀杏抗菌肽基因Gnk2-1轉化甜瓜和西瓜的研究[D].楊凌：西北農林科技大學，2011.

[24] 單安山，馬得瑩，馮興軍，等.抗菌肽的功能/研發(fā)與應用[J].中國農業(yè)科學，2012，45（11）：2249-2259.

[25] 趙娟，張東玲，武果桃，等.抗菌肽藥物的研究進展及應用前景[J].養(yǎng)豬，2015，8（1）：20-210.

[26] 申吉泓，楊宇如，唐孝達.抗菌肽作用機制研究現(xiàn)狀[J].國外醫(yī)學腫瘤學分冊，2003，30（5）：347-350.

[27] 張宇，姜寧，張愛忠.抗菌肽抑菌機理及其研究方法[J].現(xiàn)代畜牧獸醫(yī)，2018，47（1）：52-57.

[28] 彭冉，毛文超，趙立嶺，等.抗菌肽與細胞膜相互作用機制的分子動力學模擬研究[J].德州學院學報，2014，30（6）：14-20.

[29] 楊濤，楊曉喻，劉長虹.抗菌肽抗菌機制及研究方法的研究進展[J].口腔頜面修復雜志，2015，16（2）：111-115.

[30] 黃現(xiàn)青，高曉平，趙改名，等.抗菌肽抑菌機制研究進展[J].生物學雜志，2010，27（2）：62-66.

[31] 韋巖.抗菌肽的研究進展和臨床應用[J].菏澤醫(yī)學?？茖W校學報，2007，19（1）：76-78.

（收稿日期：2019-04-10 修回日期：2019-07-28）

（編輯：段思怡）