田萍 馬開(kāi) 張薇 張迪文 劉碧碧 郭曉燕 韓德恩

摘 要 目的：建立同時(shí)測(cè)定真武湯中5-羥甲基糠醛、（+）-兒茶素、芍藥苷、苯甲酰烏頭原堿、苯甲酰次烏頭原堿、苯甲酰芍藥苷、6-姜酚、8-姜酚、白術(shù)內(nèi)酯Ⅱ、6-姜烯酚、茯苓酸含量的方法。方法：采用高效液相色譜法。色譜柱為Phenomenex Kinetex C18，流動(dòng)相為乙腈-0.2%磷酸水溶液（梯度洗脫），流速為1.0 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為285 nm（4.4～7 min，5-羥甲基糠醛）、203 nm[7～12 min，（+）-兒茶素]、233 nm（12～50 min，芍藥苷、苯甲酰烏頭原堿、苯甲酰次烏頭原堿、苯甲酰芍藥苷）、200 nm（50～62.3 min，6-姜酚、8-姜酚;62.9～90 min，6-姜烯酚、茯苓酸）、222 nm（62.3～62.9 min，白術(shù)內(nèi)酯Ⅱ），柱溫為35 ℃，進(jìn)樣量為20 μL。結(jié)果：5-羥甲基糠醛、（+）-兒茶素、芍藥苷、苯甲酰烏頭原堿、苯甲酰次烏頭原堿、苯甲酰芍藥苷、6-姜酚、8-姜酚、白術(shù)內(nèi)酯Ⅱ、6-姜烯酚、茯苓酸檢測(cè)質(zhì)量濃度線性范圍分別為0.62～12.47 μg/mL（r=0.999 6）、2.36～47.25 μg/mL（r=0.999 7）、200.80～4 016 μg/mL（r=0.999 7）、4.45～89.04 μg/mL（r=0.999 6）、4.28～85.54 μg/mL（r=0.999 5）、5.16～103.13 μg/mL（r=0.999 9）、5.53～110.66 μg/mL（r=0.999 9）、0.84～16.89 μg/mL（r=0.999 8）、0.60～12.04 μg/mL（r=0.999 9）、0.53～10.62 μg/mL（r=0.999 5）、1.04～20.78 μg/mL（r=0.999 7）;定量限分別為0.155、0.590、1.210、1.112、1.070、0.258、0.553、0.421、0.153、0.354、0.431 μg/mL，檢測(cè)限分別為0.047、0.179、0.134、0.337、0.324、0.078、0.168、0.128、0.046、0.107、0.131 μg/mL，精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性試驗(yàn)的RSD均小于3%;加樣回收率分別為96.06%～103.01%（RSD=2.64%，n=6）、95.11%～101.57%（RSD=2.58%，n=6）、97.22%～102.11%（RSD=1.93%，n=6）、96.43%～102.78%（RSD=2.35%，n=6）、96.42%～101.43%（RSD=2.15%，n=6）、96.86%～102.05%（RSD=2.10%，n=6）、95.32%～100.55%（RSD=1.87%，n=6）、97.04%～103.25%（RSD=2.22%，n=6）、96.78%～103.22%（RSD=2.62%，n=6）、97.04%～103.14%（RSD=2.28%，n=6）、97.08%～103.51%（RSD=2.94%，n=6）。結(jié)論：該方法準(zhǔn)確、專屬性好，可用于同時(shí)測(cè)定真武湯中11種活性成分的含量。

關(guān)鍵詞 真武湯;高效液相色譜法;5-羥甲基糠醛;（+）-兒茶素;芍藥苷;苯甲酰烏頭原堿;苯甲酰次烏頭原堿;苯甲酰芍藥苷;6-姜酚;8-姜酚;白術(shù)內(nèi)酯Ⅱ;6-姜烯酚;茯苓酸;含量測(cè)定

ABSTRACT? ?OBJECTIVE： To establish a method for simultaneous determination of eleven active constituents in Zhenwutang decoction， such as 5-hydroxymethylfurfural， （+）-cianidanol， paeoniflorin， benzoylaconitine， benzoylhypacoitine， benzoylpaeoniflorin， 6-gingerol， 8-gingerol， atractylenolide Ⅱ， 6-shogaol and pachymic acid. METHODS： HPLC method was adopted. The separation was performed on Phenomenex Kinetex C18 column with mobile phase consisted of acetonitrile-0.2 % phosphoric acid solution（gradient elution） at flow rate of 1.0 mL/min. The detection wavelength was set at 285 nm （4.4-7 min， 5-hydroxymethylfurfural）， 203 nm [7-12 min，（+）-cianidanol]， 233 nm （12-50 min，paeoniflorin， benzoylaconitine， benzoylhypacoitine， benzoylpaeoni- florin）， 200 nm （50-62.3 min， 6-gingerol， 8-gingerol; 62.9-90 min， 6-shogaol， pachymic acid） and 222 nm （62.3-62.9 min， atractylenolide Ⅱ）. The column temperature was set at 35 ℃， and the sample size was 20 μL. RESULTS： The linear ranges of 5-hydroxymethylfurfural， （+） -cianidanol， paeoniflorin， benzoylaconitine， benzoylhypacoitine， benzoylpaeoniflorin， 6-gingerol， 8-gingerol， atractylenolide Ⅱ， 6-shogaol， pachymic acid were 0.62-12.47 μg/mL （r=0.999 6），2.36-47.25 μg/mL （r=0.999 7），200.80-4 016 μg/mL （r=0.999 7），4.45-89.04 μg/mL （r=0.999 6），4.28-85.54 μg/mL （r=0.999 5），5.16-103.13 μg/mL （r=0.999 9），5.53-110.66 μg/mL （r=0.999 9），0.84-16.89 μg/mL （r=0.999 8），0.60-12.04 μg/mL （r=0.999 9），0.53-10.62 μg/mL （r=0.999 5），1.04-20.78 μg/mL （r=0.999 7）， respectively. The limits of quantitation were 0.155， 0.590， 1.210， 1.112， 1.070， 0.258， 0.553， 0.421， 0.153， 0.354， 0.431 μg/mL， respectively. The limits of detection were 0.047， 0.179， 0.134， 0.337， 0.324， 0.078， 0.168， 0.128， 0.046， 0.107， 0.131 μg/mL， respectively. RSDs of precision， stability and reproducibility tests were all lower than 3%. The average recovery rates were 96.06%-103.01%（RSD=2.64%，n=6）， 95.11%-101.57%（RSD=2.58%，n=6）， 97.22%-102.11%（RSD=1.93%，n=6）， 96.43%-102.78%（RSD=2.35%，n=6）， 96.42%-101.43%（RSD=2.15%，n=6）， 96.86%-102.05%（RSD=2.10%，n=6）， 95.32%-100.55%（RSD=1.87%，n=6）， 97.04%-103.25%（RSD=2.22%，n=6）， 96.78%-103.22%（RSD=2.62%，n=6）， 97.04%-103.14%（RSD=2.28%，n=6）， 97.08%-103.51%（RSD=2.94%，n=6）， respectively. CONCLUSIONS： The method is accurate and specific， and suitable for simultaneous determination 11 active components of Zhenwutang decoction.

KEYWORDS? ?Zhenwutang decoction; HPLC; 5-hydroxymethylfurfural; （+）-cianidanol; Paeoniflorin; Benzoylaconitine; Benzoylhypacoitine; Benzoylpaeoniflorin; 6-gingerol; 8-gingerol; Atractylenolide Ⅱ; 6-shogaol; Pachymic acid; Content determination

真武湯是張仲景《傷寒論》中溫陽(yáng)利水的代表方[1]，由白芍、茯苓、白術(shù)、附子、生姜等5味中藥組成，主要用于治療腎病[2]、心力衰竭[3]等癥，療效顯著。白芍中芍藥苷、苯甲酰芍藥苷具有抗炎、抗應(yīng)激、調(diào)節(jié)免疫等作用，可用于糖尿病腎病、腎病綜合征、慢性腎小球腎炎等多種腎臟疾病的治療[4];其酚類成分兒茶素具有腎保護(hù)作用[5]。茯苓酸是茯苓的主要有效活性成分之一，具有改善膿毒癥引起的急性腎損傷的作用[6]。白術(shù)中白術(shù)內(nèi)酯Ⅱ能顯著抑制炎癥介質(zhì)和炎癥細(xì)胞因子的產(chǎn)生[7];5-羥甲基糠醛對(duì)鏈脲佐菌素誘導(dǎo)的糖尿病腎病模型大鼠具有腎保護(hù)作用，但有基因和細(xì)胞毒性[8-9]。附子水煎劑可改善微小病變腎病模型大鼠的腎臟損傷[10]，苯甲酰烏頭原堿、苯甲酰次烏頭原堿等單酯型生物堿既是其有效成分，也是毒性成分[11]。生姜中6-姜酚、8-姜酚、6-姜烯酚對(duì)急性腎損傷和糖尿病腎損傷均具有保護(hù)作用[12-13]。以上成分均為真武湯中具有腎保護(hù)作用的活性成分。目前關(guān)于真武湯的研究，主要為測(cè)定方中一味或多味藥材所含的有效成分[14-16]，尚未涵蓋方中所有藥材有效成分或指標(biāo)成分含量。而中藥復(fù)方通過(guò)多成分、多靶點(diǎn)而發(fā)揮協(xié)同增效的作用，因此對(duì)其中單一或幾種成分進(jìn)行含量測(cè)定，難以全面體現(xiàn)其整體質(zhì)量。為此，本研究采用高效液相色譜法（HPLC）測(cè)定了真武湯中5-羥甲基糠醛、（+）-兒茶素、芍藥苷、苯甲酰烏頭原堿、苯甲酰次烏頭原堿、苯甲酰芍藥苷、6-姜酚、8-姜酚、白術(shù)內(nèi)酯Ⅱ、6-姜烯酚、茯苓酸等11種活性成分的含量，旨在為完善其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供參考。

1 材料

1.1 儀器

2695型HPLC儀，包括二極管陣列檢測(cè)器、Empower 2-Build 2154色譜工作站（美國(guó)Waters公司）;AE240型十萬(wàn)分之一分析天平（瑞士Mettler-Toledo公司）;LIBROR-160DPT型萬(wàn)分之一電子分析天平（日本Shimadzu公司）;ULUP- IV-10T型超純水器（四川優(yōu)普超純科技有限公司）。

1.2 藥品與試劑

芍藥苷對(duì)照品（中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：110736-201640，純度：>99.0%）;苯甲酰芍藥苷對(duì)照品（批號(hào)：wkq16122906，純度：>98%）、茯苓酸對(duì)照品（批號(hào)：wkq16071903，純度：>98%）、白術(shù)內(nèi)酯Ⅱ?qū)φ掌罚ㄅ?hào)：wkq16060503，純度：>98%）均購(gòu)自四川維克奇生物科技有限公司;（+）-兒茶素對(duì)照品（批號(hào)：MUST- 16030812，純度：>98%）、5-羥甲基糠醛對(duì)照品（批號(hào)：MUST- 15051212，純度：>98%）、苯甲酰烏頭原堿對(duì)照品（批號(hào)：MUST-17022805，純度：>98%）、苯甲酰次烏頭原堿對(duì)照品（批號(hào)：MUST-17022807，純度：>98%）均購(gòu)自成都曼斯特生物科技有限公司;6-姜酚對(duì)照品（批號(hào)：20171206）、6-姜烯酚對(duì)照品（批號(hào)：20171222）、8-姜酚對(duì)照品（批號(hào)：20180408）均由河南省中醫(yī)藥研究院馬開(kāi)實(shí)驗(yàn)室自制，采用面積歸一化法檢測(cè)純度均大于98%;乙腈為色譜純，其他試劑均為分析純，水為超純水。

1.3 藥材

白術(shù)飲片（批號(hào)：170605CP0175，產(chǎn)地：浙江）、白芍飲片（批號(hào)：171102，產(chǎn)地：安徽）、附子飲片（黑順片，批號(hào)：17050202，產(chǎn)地：四川）、茯苓飲片（批號(hào)：170602，產(chǎn)地：安徽）均購(gòu)自河南本草國(guó)藥館;生姜購(gòu)自鄭州市家輝超市，經(jīng)河南省中醫(yī)藥研究院劉杰研究員鑒定分別為菊科植物白術(shù)（Atractylodes macrocephala Koidz.）的干燥根莖、毛茛科植物芍藥（Paeonia lactiflora Pall.）的干燥根、毛茛科植物烏頭（Aconitum carmichaelii Debx.）的子根加工品、多孔菌科真菌茯苓[Poria cocos（Schw.）Wolf]的干燥菌核、姜科植物姜（Zingiber officinale Rosc.）的新鮮根莖。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Phenomenex Kinetex C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）;流動(dòng)相：乙腈（A）-0.2%磷酸水溶液（B），梯度洗脫（0～25 min，8%A→17%A;25～70 min，17%A→ 65%A;70～75 min，65%A;75～76 min，65%A→ 90%A;76～90 min，90%A;90～95 min，90%A→ 8%A）;流速：1.0 mL/min;檢測(cè)波長(zhǎng)：285 nm（4.4～7 min，5-羥甲基糠醛）、203 nm[7～12 min，（+）-兒茶素]、233 nm（12～50 min，芍藥苷、苯甲酰烏頭原堿、苯甲酰次烏頭原堿、苯甲酰芍藥苷）;200 nm（50～62.3 min，6-姜酚、8-姜酚;62.9～90 min，6-姜烯酚、茯苓酸）、222 nm（62.3～62.9 min，白術(shù)內(nèi)酯Ⅱ）;柱溫：35 ℃;進(jìn)樣量：20 μL。

2.2 真武湯的制備

按《傷寒論》和《方劑學(xué)》（7版）中真武湯的處方量[1，17]，精密稱取白芍9 g、茯苓9 g、白術(shù) 6 g、生姜 9 g、附子（黑順片）5 g，置于同一2 000 mL 圓底燒瓶中，加水800 mL，浸泡 30 min，回流提取 2 次，每次30 min，趁熱紗布濾過(guò)，合并濾液，減壓濃縮至約40 mL，放置室溫，加水定容至50 mL，搖勻，即得。共制備3批真武湯樣品（編號(hào)：S1、S2、S3）。

2.3 溶液的制備

2.3.1 混合對(duì)照品溶液 取5-羥甲基糠醛、（+）-兒茶素、苯甲酰烏頭原堿、苯甲酰次烏頭原堿、苯甲酰芍藥苷、6-姜酚、8-姜酚、白術(shù)內(nèi)酯Ⅱ、6-姜烯酚、茯苓酸對(duì)照品適量，分別置于10 mL量瓶中，加甲醇溶解并定容，搖勻，得5-羥甲基糠醛、（+）-兒茶素、苯甲酰烏頭原堿、苯甲酰次烏頭原堿、苯甲酰芍藥苷、6-姜酚、8-姜酚、白術(shù)內(nèi)酯Ⅱ、6-姜烯酚、茯苓酸質(zhì)量濃度分別為270.25、1 179.5、1 066.25、1 127.75、1 335.75、1 416.50、343.75、216.00、115.50、469.50 μg/mL的單一對(duì)照品貯備液。另取芍藥苷對(duì)照品適量，置于5 mL量瓶中，分別加入上述各單一對(duì)照品貯備液適量，加甲醇定容，搖勻，得含5-羥甲基糠醛、（+）-兒茶素、芍藥苷、苯甲酰烏頭原堿、苯甲酰次烏頭原堿、苯甲酰芍藥苷、6-姜酚、8-姜酚、白術(shù)內(nèi)酯Ⅱ、6-姜烯酚、茯苓酸質(zhì)量濃度分別為12.47、47.25、4 016、89.04、85.54、103.13、110.66、16.89、12.04、10.62、20.78 μg/mL的混合對(duì)照品溶液。

2.3.2 供試品溶液 精密量取“2.2”項(xiàng)下樣品3 mL，置于5 mL量瓶中，加甲醇定容，搖勻，室溫放置12 h，再搖勻，經(jīng)0.22 μm微孔濾膜濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

2.3.3 陰性樣品溶液 按“2.2”項(xiàng)下方法分別制備缺白芍、茯苓、白術(shù)、附子（黑順片）、生姜的陰性樣品，再按“2.3.2”項(xiàng)下方法分別制備各陰性樣品溶液。

2.4 系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

精密量取“2.3”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液、供試品溶液和陰性樣品溶液各適量，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖，詳見(jiàn)圖 1。由圖1可知，在該色譜條件下，各成分均能達(dá)到基線分離，分離度均大于1.5，理論板數(shù)以6-姜酚峰計(jì)均不低于5 000，陰性樣品對(duì)測(cè)定無(wú)干擾。

2.5 線性關(guān)系考察

精密量取“2.3.1”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液0.25、0.50、1.0、2.0、4.0、5.0 mL，分別置于5 mL量瓶中，加甲醇定容，搖勻，得系列線性關(guān)系工作溶液。精密量取上述系列線性關(guān)系工作溶液各20 μL，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。以各待測(cè)成分質(zhì)量濃度（x，μg/mL）為橫坐標(biāo)、峰面積（y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，結(jié)果見(jiàn)表1。

2.6 定量限與檢測(cè)限考察

取“2.3.1”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液適量，加甲醇倍比稀釋，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，以信噪比10 ∶ 1、3 ∶ 1分別計(jì)算定量限、檢測(cè)限。結(jié)果，5-羥甲基糠醛、（+）-兒茶素、芍藥苷、苯甲酰烏頭原堿、苯甲酰次烏頭原堿、苯甲酰芍藥苷、6-姜酚、8-姜酚、白術(shù)內(nèi)酯Ⅱ、6-姜烯酚、茯苓酸的定量限分別為0.155、0.590、1.210、1.112、1.070、0.258、0.553、0.421、0.153、0.354、0.431 μg/mL，檢測(cè)限分別為0.047、0.179、0.134、0.337、0.324、0.078、0.168、0.128、0.046、0.107、0.131 μg/mL。

2.7 精密度試驗(yàn)

取“2.3.1”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液適量，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣測(cè)定6 次，記錄峰面積。結(jié)果，5-羥甲基糠醛、（+）-兒茶素、芍藥苷、苯甲酰烏頭原堿、苯甲酰次烏頭原堿、苯甲酰芍藥苷、6-姜酚、8-姜酚、白術(shù)內(nèi)酯Ⅱ、6-姜烯酚、茯苓酸峰面積的RSD分別為2.11%、1.78%、1.96%、2.30%、1.56%、2.28%、1.77%、1.33%、1.57%、1.96%、2.36%（n=6），表明儀器精密度良好。

2.8 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取“2.3.2”項(xiàng)下供試品溶液（編號(hào)：S2）適量，分別于室溫下放置0、2、4、8、12、24 h時(shí)按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。結(jié)果，5-羥甲基糠醛、（+）-兒茶素、芍藥苷、苯甲酰烏頭原堿、苯甲酰次烏頭原堿、苯甲酰芍藥苷、6-姜酚、8-姜酚、白術(shù)內(nèi)酯Ⅱ、6-姜烯酚、茯苓酸峰面積的RSD分別為1.31%、0.58%、1.76%、1.64%、1.46%、1.18%、1.57%、1.38%、1.77%、1.86%、1.94%（n=6），表明供試品溶液于室溫下放置24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.9 重復(fù)性試驗(yàn)

取樣品（編號(hào)：S2）適量，共6份，按“2.3.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積并按標(biāo)準(zhǔn)曲線法計(jì)算樣品中11種成分的含量。結(jié)果，5-羥甲基糠醛、（+）-兒茶素、芍藥苷、苯甲酰烏頭原堿、苯甲酰次烏頭原堿、苯甲酰芍藥苷、6-姜酚、8-姜酚、白術(shù)內(nèi)酯Ⅱ、6-姜烯酚、茯苓酸的平均含量分別為9.31、40.19、3 500.65、72.60、70.53、79.99、86.89、12.95、5.06、3.34、14.80 μg/mL，RSD分別為2.78%、2.18%、2.76%、2.04%、2.67%、1.87%、2.57%、2.08%、2.17%、2.96%、2.99%（n=6），表明本方法重復(fù)性良好。

2.10 加樣回收率試驗(yàn)

取已知含量的“2.2”項(xiàng)下樣品（編號(hào)：S2），共6份，每份約1.5 mL，分別加入混合對(duì)照品溶液[含5-羥甲基糠醛6.98 μg/mL、（+）-兒茶素30.24 μg/mL、芍藥苷2 626.04 μg/mL、苯甲酰烏頭原堿55.31 μg/mL、苯甲酰次烏頭原堿53.27 μg/mL、苯甲酰芍藥苷60.47 μg/mL、6-姜酚65.15 μg/mL、8-姜酚10.46 μg/mL、白術(shù)內(nèi)酯Ⅱ3.88? μg/mL、6-姜烯酚2.87 μg/mL、茯苓酸11.12 μg/mL] 2 mL，按“2.3.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積并計(jì)算加樣回收率，結(jié)果見(jiàn)表2。

2.11 耐用性試驗(yàn)

取“2.2”項(xiàng)下樣品（編號(hào)：S2）適量，按“2.3.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件[分別以不同流動(dòng)相（B）體積比例（0.15%、0.20%、0.25%磷酸水溶液）、流速（0.9、1.0、1.1 mL/min）、柱溫（30、35、40 ℃）]進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積并按標(biāo)準(zhǔn)曲線法計(jì)算樣品中11種成分的含量，結(jié)果見(jiàn)表3。結(jié)果表明，本方法可滿足試驗(yàn)要求，提示耐用性良好。

2.12 樣品含量測(cè)定

取“2.2”項(xiàng)下3批樣品適量，按“2.3.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，平行操作3次，記錄峰面積并按標(biāo)準(zhǔn)曲線法計(jì)算樣品中11種成分的含量，結(jié)果見(jiàn)表4。

3 討論

有研究認(rèn)為，同時(shí)測(cè)定中藥復(fù)方中多個(gè)成分時(shí)，因各成分的紫外最大吸收波長(zhǎng)不同，因此需要采用波長(zhǎng)切換法測(cè)定各成分的含量[18]。筆者參考相關(guān)文獻(xiàn)[14-16，18-20]，在190～400 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)對(duì)11種待測(cè)成分進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在233 nm波長(zhǎng)處芍藥苷、苯甲酰烏頭原堿、苯甲酰次烏頭原堿、苯甲酰芍藥苷有較大吸收，222 nm波長(zhǎng)處白術(shù)內(nèi)酯Ⅱ有最大吸收，285 nm波長(zhǎng)處5-羥甲基糠醛有最大吸收，200 nm波長(zhǎng)處茯苓酸有較大吸收，200、227、280 nm波長(zhǎng)處6-姜酚、6-姜烯酚、8-姜酚有吸收峰，203、279 nm波長(zhǎng)處（+）-兒茶素有吸收峰;考慮到部分成分含量較低，因此在保證各待測(cè)成分檢測(cè)靈敏度及基線分離的情況下，本研究采用“2.1”項(xiàng)下波長(zhǎng)作為檢測(cè)波長(zhǎng)[21]。

本研究將樣品濾過(guò)后直接進(jìn)樣與經(jīng)甲醇處理后進(jìn)樣的色譜圖進(jìn)行比較。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，經(jīng)甲醇處理后，各成分分離度好，噪聲小，故本研究將樣品用甲醇進(jìn)行處理后再進(jìn)樣分析。與此同時(shí)，本研究又比較了樣品與不同體積比甲醇（1 ∶ 4、2 ∶ 3、1 ∶ 1、3 ∶ 2、4 ∶ 1）混勻后的色譜情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，不同體積比的色譜圖中峰數(shù)未有明顯變化，但當(dāng)樣品與甲醇體積比為3 ∶ 2時(shí)待測(cè)成分峰面積最大，且基線較平穩(wěn)，故筆者將樣品與甲醇按體積比3 ∶ 2混勻后，分別放置2、4、6、8、10、12、14、16 h后過(guò)濾進(jìn)樣，發(fā)現(xiàn)混勻后的樣品在放置12 h后過(guò)濾，其濾液不會(huì)產(chǎn)生白色的粉狀沉淀，且各成分含量變化不大。因此本研究采用“2.3.2”項(xiàng)下方法處理樣品。

此外，筆者比較了甲醇-水、乙腈-水等流動(dòng)相系統(tǒng)。結(jié)果顯示，乙腈的洗脫能力優(yōu)于甲醇，色譜峰分離度較好，但略有拖尾，在加入磷酸溶液后峰形和分離度均有所改善，故選擇乙腈-磷酸水溶液為流動(dòng)相。同時(shí)，本研究還比較了乙腈-磷酸水溶液中磷酸不同體積分?jǐn)?shù)（0.2%、0.3%、0.4%）對(duì)各成分與雜質(zhì)峰分離度的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當(dāng)磷酸溶液體積分?jǐn)?shù)大于0.2%時(shí)，分離度并沒(méi)有隨磷酸體積分?jǐn)?shù)的增加得到明顯的改善，因此選擇乙腈-0.2%磷酸水溶液為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫，此時(shí)各成分與雜質(zhì)峰可達(dá)到完全分離，滿足相關(guān)要求[22]。

耐用性試驗(yàn)結(jié)果顯示，當(dāng)流速為0.9～1.1 mL/min、磷酸溶液體積分?jǐn)?shù)為0.15%～0.25%、柱溫為30～40 ℃時(shí)，雖然各成分保留時(shí)間偏差在（±0.16） min內(nèi)，但樣品含量的RSD均小于3%，表明其耐用性良好，能滿足試驗(yàn)要求[22]。樣品含量測(cè)定結(jié)果顯示，（+）-兒茶素、芍藥苷、苯甲酰烏頭原堿、苯甲酰次烏頭原堿、苯甲酰芍藥苷、6-姜酚含量較高;5-羥甲基糠醛、白術(shù)內(nèi)酯Ⅱ、8-姜酚、6-姜烯酚、茯苓酸含量較低，但因其分別為方中白術(shù)、茯苓、生姜的主要活性成分[6-7，12-13， 20]，故仍將這5種成分作為真武湯質(zhì)量控制的指標(biāo)性成分。

綜上所述，本研究所建含量測(cè)定方法準(zhǔn)確、專屬性好，可用于同時(shí)測(cè)定真武湯中11種活性成分的含量。

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（收稿日期：2019-03-25 修回日期：2019-06-19）

（編輯：陳 宏）