楊浩天 吳茵 宋浩靜 邱志宏 董占軍

中圖分類號 R927.2；R978.5 文獻標志碼 A 文章編號 1001-0408（2019）02-0235-05

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2019.02.19

摘 要 目的：建立測定人血漿中氟康唑濃度的方法。方法：血漿樣品經乙腈沉淀蛋白后，以同位素氟康唑-d4為內標，采用超高效液相色譜-串聯質譜法測定。色譜柱為ACQUITY UPLC BEH C18，流動相為0.1%甲酸溶液-乙腈（梯度洗脫），流速為0.3 mL/min，柱溫為40 ℃，進樣量為3 μL；采用電噴霧離子源，以多反應監(jiān)測模式進行正離子掃描，用于定量分析的離子對分別為m/z 307.1→220.0（氟康唑）和m/z 311.1→223.0（內標）。結果：氟康唑血藥濃度檢測的線性范圍為10～5 000 ng/mL（r=0.998 1），定量下限為10 ng/mL；日內、日間RSD均低于8%，準確度為95.8%～106.7%；提取回收率為97.3%～107.3%（RSD<5.0%，n=6），基質效應、稀釋效應及殘留效應均不影響待測物的定量分析。結論：該方法簡便、快速、專屬性強、準確度高，可用于氟康唑治療藥物監(jiān)測及藥動學研究。

關鍵詞 氟康唑；同位素內標；超高效液相色譜-串聯質譜法；血藥濃度；治療藥物監(jiān)測

ABSTRACT OBJECTIVE： To establish a method for determination of fluconazole concentration in human plasma. METHODS： UPLC-MS/MS method was adopted to determine plasma after precipitated with acetonitrile. Using isotope fluconazole-d4 as internal standard， the determination was performed on ACQUITY UPLC BEH C18 column with mobile phase consisted of 0.1% formic acid-acetonitrile （gradient elution） at the flow rate of 0.3 mL/min. The column temperature was 40 ℃， and the sample size was 3 μL. ESI was used for positive ion scanning by multiple reaction monitoring mode. The ion pairs for quantitative analysis were m/z 307.1→220.0 （fluconazole） and m/z 311.1→223.0 （internal standard）. RESULTS： The linear range of fluconazole was 10-5 000 ng/mL （r=0.998 1）. The limits of quantitation was 10 ng/mL. RSDs of intra-day and inter-day were less than 8%； accuracy ranged 95.8%-106.7%. The extraction recovery ranged 97.3%-107.3% （RSD<5.0%， n=6）， and matrix effect， dilution effect and residual effect didn’t influence quantitative analysis of the substance to be measured. CONCLUSIONS： The method is simple， rapid， specific and accurate， which can be used for therapeutic drug monitoring and pharmacokinetic study of fluconazole.

KEYWORDS Fluconazole； Isotope internal standard； UPLC-MS/MS； Plasma concentration； Therapeutic drug monitoring

氟康唑（Fluconazole）是通過抑制真菌麥角甾醇合成而抑制或殺滅真菌的三唑類抗真菌藥物，對深部真菌感染特別是白色念珠菌和新型隱球菌感染具有顯著療效[1]。該藥自1988年上市以來，因具有抗真菌譜廣、肝毒性小、口服吸收好、生物利用度高、組織分布廣等優(yōu)點，其臨床應用十分廣泛[2]。氟康唑用藥過量易導致患者肝腎功能異常，且與其他藥物（如氫氯噻嗪、異煙肼、利福平等）聯合使用時，也可能會導致氟康唑血藥濃度發(fā)生改變[3-4]；同時有文獻指出，在聯合使用氟康唑和部分降脂、降糖、降壓藥物（如辛伐他汀、格列吡嗪、硝苯地平等）時，累及患者肝臟、腎臟及骨骼、心血管、內分泌系統(tǒng)的不良反應的發(fā)生率將會有所增高[5]。因此對于聯合使用氟康唑及其他藥物治療的患者，有必要對其體內氟康唑的血藥濃度進行治療藥物監(jiān)測（TDM），并結合監(jiān)測結果及患者癥狀優(yōu)化個體治療方案，以保證用藥的安全、有效、合理[6]。目前文獻報道的血藥濃度檢測方法主要有高效液相色譜法（HPLC）和液質聯用法（LC-MS），所用到的內標化合物包括甲磺酸酚妥拉明、甲硝唑和非那西丁等[7-10]。液相色譜-串聯質譜技術（LC-MS/MS）在靶向定量分析領域中的應用獨具優(yōu)勢；與傳統(tǒng)的LC-MS/MS法相比，超高效液相色譜-串聯質譜技術（UPLC-MS/MS）顯著提高了復雜體系中藥物定量分析的效率，并逐漸得到了廣泛應用[11]。此外，上述內標的應用可能會受到類似聯用藥物的干擾，而同位素內標則可有效避免這種干擾，有助于實現復雜體系中某一藥物的準確定量[12]。為此，本研究建立了測定人血漿中氟康唑濃度的同位素稀釋-UPLC-MS/MS法，以期為該藥的TDM和臨床合理應用提供參考。

1 材料

1.1 儀器

LC-30A型UPLC系統(tǒng)，配有LC-30AD型二元高壓梯度泵、CTO-30A型柱溫箱、SIL-30AC型自動進樣器（日本Shimadzu公司）；AB Sciex Triple QuadTM 5500型三重四極桿MS儀，配有Turbo ⅤTM型離子源、AcQuRateTM型脈沖離子計數檢測器和Analyst 1.6數據采集系統(tǒng)（美國AB Sciex公司）；BP211D型分析天平（北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司）；Elmasonic S150實驗室應用型超聲波清洗器（德國Elma公司）；Sorvall ST16R型高速冷凍離心機（美國Thermo Fisher Scientific公司）；MIULAB MIX-25P型渦旋儀（杭州米歐儀器有限公司）。

1.2 藥品與試劑

氟康唑對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號：100314-201605，純度：99.7%）；氟康唑-d4對照品（內標，加拿大TLC Pharmaceutical Standards公司，批號：1132- 051A1，純度：98.7%）；脂肪乳注射液（C14～24）[20%，費森尤斯卡比華瑞制藥有限公司，批號：80LA004，規(guī)格：250 mL ∶ 50 g（大豆油） ∶ 3 g（卵磷脂）]；二甲基亞砜（DMSO）、乙腈、甲酸為色譜純，其余試劑均為分析純，水為自制超純水。

1.3 空白血漿

來自于我院體檢中心，經肝素抗凝后，分離上層血漿即得。

2 方法與結果

2.1 色譜與質譜條件

2.1.1 色譜條件 色譜柱：ACQUITY UPLC BEH C18（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）；流動相：0.1%甲酸溶液（A）-乙腈（B），梯度洗脫[0～1.2 min，20%B→50%B；1.2～1.8 min，50%B→90%B；1.8～3.1 min，90%B；每針進樣前以初始比例（20%B）平衡2 min]；自動進樣器溫度：15 ℃；流速：0.3 mL/min；柱溫：40 ℃；進樣量：3 μL。

2.1.2 質譜條件 電噴霧離子源，正離子方式檢測（ESI+）；離子源溫度：600 ℃；離子源噴射電壓：4 500 V；霧化氣（Gas 1，N2）和加熱氣（Gas 2，N2）壓力：55 psi；氣簾氣（N2）壓力：35 psi；采用多反應監(jiān)測（MRM）模式掃描。用于定量分析的離子對分別為m/z 307.1→220.0[氟康唑，去簇電壓（DP）：130 V，碰撞能量（CE）：20 eV]、m/z 311.1→223.0（內標，DP：100 V，CE：25 eV）。氟康唑和內標的化學結構式與質譜圖見圖1。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對照品貯備液 取氟康唑對照品10 mg，精密稱定，置于10 mL量瓶中，加DMSO溶解并定容，配制成質量濃度為1.0 mg/mL的對照品貯備液。

2.2.2 標準曲線和質控工作溶液 取“2.2.1”項下對照品貯備液適量，用50%乙腈稀釋，配制成質量濃度分別為0.2、0.4、1.0、3.0、10.0、30.0、80.0、100.0 μg/mL的系列溶液，作為標準曲線工作溶液。另取“2.2.1”項下對照品貯備液適量，用50%乙腈稀釋，配制成質量濃度分別為0.2、0.6、7.5、40.0、75.0、500.0 μg/mL的系列溶液，作為質控工作溶液。

2.2.3 內標貯備液和內標工作溶液 取內標對照品2 mg，精密稱定，用DMSO溶解并稀釋，配制成質量濃度為1.0 mg/mL的內標貯備液。取上述內標貯備液適量，用50%乙腈稀釋，配制成質量濃度為1 000 ng/mL的內標工作溶液。

2.3 血漿樣品的制備及處理

2.3.1 標準曲線血漿樣品的制備 取空白血漿190 μL，置于1.5 mL離心管中，精密加入“2.2.2”項下標準曲線工作溶液各10 μL，配制成質量濃度分別為10、20、50、150、500、1 500、4 000、5 000 ng/mL的標準曲線血漿樣品。

2.3.2 質控血漿樣品的制備 取空白血漿190 μL，精密加入“2.2.2”項下質控工作溶液各10 μL，配制成質量濃度依次為10、30、375、2 000、3 750、25 000 ng/mL的質控血漿樣品。

2.3.3 待測血漿樣品的處理 精密吸取待測血漿樣品及內標工作溶液各30 μL，加入乙腈180 μL，以2 000 r/min渦旋5 min沉淀蛋白后，以12 000 r/min高速離心10 min，取上清液30 μL，加入50%乙腈270 μL，混勻，備測。

2.4 專屬性考察

取6個不同來源的空白血漿及質量濃度為10 ng/mL的質控血漿樣品，按“2.3.3”項下方法處理后，再按“2.1”項下色譜與質譜條件進樣分析，記錄色譜圖。結果顯示，不同來源空白血漿中的內源性物質均不影響待測物及內標的測定，兩者的保留時間約為2.0 min，詳見圖2。

2.5 標準曲線的繪制與定量下限的考察

取“2.3.1”項下氟康唑質量濃度分別為10、20、50、150、500、1 500、4 000、5 000 ng/mL的標準曲線血漿樣品各適量，按“2.3.3”項下方法處理后，再按“2.1”項下色譜與質譜條件進樣分析，記錄峰面積。以待測物質量濃度（x，ng/mL）為橫坐標、待測物與內標的峰面積比值（y）為縱坐標，采用加權最小二乘法（權重系數ω=1/x2）進行線性回歸，得回歸方程為y=5.11×10-4x+1.82×10-3（r=0.998 1）。結果表明，氟康唑血藥濃度檢測的線性范圍為10～5 000 ng/mL，定量下限為10 ng/mL。

2.6 準確度與精密度試驗

取“2.5”項下氟康唑定量下限質量濃度（10 ng/mL）血漿樣品以及“2.3.2”項下低、中、高質量濃度（30、2 000、3 750 ng/mL）質控血漿樣品各6份，按“2.3.3”項下方法處理后，再按“2.1”項下色譜與質譜條件進樣分析，考察日內精密度；連續(xù)測定3 d，考察日間精密度。將實測質量濃度與理論質量濃度進行比較，考察準確度。結果顯示，各質控血漿樣品日內、日間RSD均低于8%，準確度為95.8%～106.7%，符合生物樣品定量分析的相關要求[13]，詳見表1。

2.7 提取回收率試驗

取“2.3.2”項下氟康唑低、中、高質量濃度（30、2 000、3 750 ng/mL）質控血漿樣品各6份，按“2.3.3”項下方法處理后，進樣分析，得峰面積（A1）。取空白血漿適量，按“2.3.3”項下方法處理，制得空白基質，以該空白基質為溶劑，平行配制基質質控樣品各6份，使最終質量濃度與前者對應，進樣分析，得峰面積（A2）。提取回收率=A1/A2×100%。結果顯示，低、中、高質量濃度質控血漿樣品的提取回收率分別為（102.1±1.3）%、（99.7±2.4）%、（104.5±2.8）%（結果范圍為97.3%～107.3%），RSD分別為1.3%、2.4%、2.7%（n=6）；內標提取回收率為（96.8±4.2）%，RSD為4.3%（n=6），符合生物樣品定量分析的相關要求[13]。

2.8 基質效應

2.8.1 正?；|效應 取6個不同來源的空白血漿適量，按“2.3.3”項下方法處理，制得空白基質，以該空白基質為溶劑，平行配制氟康唑低、高質量濃度（30、3 750 ng/mL）的基質質控樣品各3份，進樣分析，得峰面積（B1）。以乙腈為溶劑配制相應質量濃度（30、3 750 ng/mL）的氟康唑對照品溶液，進樣分析，得峰面積（B2）。正?；|效應=B1/B2×100%。結果顯示，氟康唑的正?；|效應為92.7%～100.4%，內標的正?；|效應為（96.2±4.6）%，RSD均小于5%（n=3），提示正常血漿的基質效應不影響待測物的測定，詳見表2。

2.8.2 溶血基質效應 取凍存全血樣品適量，加至空白血漿中，混勻，得5%（V/V）溶血血漿，按“2.3.3”項下方法處理，制得溶血基質，以該溶血基質為溶劑，平行配制氟康唑低、高質量濃度（30、3 750 ng/mL）的溶血基質質控樣品各3份，進樣分析，得峰面積（B3）。以乙腈為溶劑配制相應質量濃度（30、3 750 ng/mL）的氟康唑對照品溶液，進樣分析，得峰面積（B2）。溶血基質效應=B3/B2×100%。結果顯示，氟康唑的溶血基質效應為93.9%～103.8%，內標的溶血基質效應為（101.7±3.9）%，RSD均小于5%（n=3），提示5%溶血血漿的基質效應不影響待測物的測定，詳見表2。

2.8.3 高脂基質效應 取20%脂肪乳注射液各適量，分別加至空白血漿中，混勻，得5%、10%、15%（V/V）高脂血漿，按“2.3.3”項下方法處理，制得高脂基質，以該高脂基質為溶劑，平行配制氟康唑低、高質量濃度（30、3 750 ng/mL）的高脂基質質控樣品各3份，進樣分析，得峰面積（B4）。以乙腈為溶劑配制相應質量濃度（30、3 750 ng/mL）的氟康唑對照品溶液，進樣分析，得峰面積（B2）。高脂基質效應=B4/B2×100%。結果顯示，氟康唑在5%、10%、15%高脂血漿中的基質效應分別為90.8%～99.4%、86.3%～95.7%、83.6%～93.8%，內標的高脂基質效應分別為（92.9±3.5）%、（90.5±3.1）%、（85.8±6.3）%，RSD均小于5%（n=9），提示高脂血漿的基質效應不影響待測物的測定，詳見表2。

2.9 穩(wěn)定性試驗

取“2.3.2”項下氟康唑低、高質量濃度（30、3 750 ng/mL）質控血漿樣品各6份，按“2.3.2”項下方法處理后，再按“2.1”項下色譜與質譜條件進樣分析，分別考察其凍融3次（-80 ℃～25 ℃）、-80 ℃凍存7 d、-20 ℃凍存7 d、室溫放置8 h的穩(wěn)定性。結果顯示，各樣品實測質量濃度與理論質量濃度的偏差均在±15%范圍內，提示其在上述條件下穩(wěn)定性良好。另按“2.2.2”“2.2.3”項下方法分別配制質量濃度均為1.0 μg/mL的氟康唑對照品溶液和內標工作液，進樣分析，得峰面積（C1），在-4 ℃貯存7 d以及室溫放置8 h后進樣分析，得峰面積（C2）。結果，上述樣品峰面積的偏差[（C2-C1）/C1]均在±5%范圍內，提示其在上述條件下穩(wěn)定性良好。

2.10 稀釋效應考察

取“2.3.2”項下氟康唑質量濃度為25 000 ng/mL的質控血漿樣品適量，用空白血漿稀釋10倍，平行配制6份，按“2.3.3”項下方法處理后，再按“2.1”項下色譜與質譜條件進樣分析，以隨行標準曲線計算各樣品的精密度與準確度。結果顯示，經稀釋后血漿樣品的日內、日間RSD及準確度分別為6.5%、7.7%、96.1%，符合生物樣品定量分析的相關要求[13]，提示稀釋效應不會影響待測物的測定。

2.11 殘留效應考察

在測定最高質量濃度（5 000 ng/mL）標準曲線血漿樣品后，同法測定空白血漿樣品以考察方法的殘留效應。結果顯示，在待測物及內標對應的保留時間處，空白血漿樣品相應色譜峰峰面積與定量下限質量濃度（10 ng/mL）血漿樣品相應色譜峰峰面積的比值小于1%，視為基線平齊[13]，表明殘留效應不影響后續(xù)血漿樣品的測定。

3 討論

3.1 內標的選擇

本研究采用氟康唑的氘代同位素氟康唑-d4作為內標，其與氟康唑具有相同的色譜保留時間、相似的提取回收率和離子化效率，與其他內標相比，能最大程度地避免或減少其他物質及基質效應的干擾[12]，有助于提高分析方法的準確度與精密度。

3.2 前處理方法及色譜、質譜條件優(yōu)化

本法進樣量少（3 μL），且分析時間短（3.1 min），優(yōu)于現有文獻報道[7-10]，能滿足臨床大樣本同時檢測的需求。與液-液萃取法或固相萃取法比較，本法所采用的乙腈沉淀蛋白前處理方法具有簡便易行、操作快速的特點，可顯著提高分析效率[14]。

在色譜條件優(yōu)化方面，本課題組前期考察了乙腈、0.1%甲酸溶液-甲醇、水-乙腈等流動相體系的分離效果。有研究指出，在ESI+檢測模式下，在水相中加入酸性溶劑，可有助于增強化合物的離子化效率，提高檢測靈敏度，并有助于改善色譜峰峰形[15-16]。前期預試驗結果也顯示，以0.1%甲酸溶液-乙腈為流動相進行梯度洗脫時，可獲得良好的峰形及較快的分析速度，故最終以此作為色譜流動相。

在質譜條件優(yōu)化方面，本課題組前期分別考察了氟康唑m/z 307.1→220.0、m/z 307.1→238.1以及內標m/z 311.1→223.0、m/z 311.1→242.1等不同離子對在質譜系統(tǒng)中的響應，并對其DP、CE進行了調諧。結果顯示，氟康唑-d4的[M+H]+ m/z 311.1比氟康唑的[M+H]+ m/z 307.1多4（4個氘原子），而前者子離子m/z 223.0僅比后者子離子m/z 220.0多3（3個氘原子）。由此推斷，另1個氘原子的取代位置在中性丟失碎片上，子離子m/z 223.0 及m/z 220.0的結構一致，可用于定量分析。故本研究結合調諧情況最終以m/z 307.1→220.0（氟康唑；DP：130 V，CE：20 eV）、m/z 311.1→223.0（內標；DP：100 V，CE：25 eV）為定量離子對。

3.3 溶血、高脂血漿基質對生物分析的影響

溶血現象在血漿樣本的收集、儲存和運送過程中時有發(fā)生。有研究表明，溶血基質不僅會導致離子抑制或離子增強等效應的發(fā)生，還會誘導紅細胞中血紅蛋白及各種酶的釋放，嚴重影響待測物的回收率和穩(wěn)定性[17-18]。高脂血漿中引起基質效應的主要內源性成分包括磷脂、膽固醇和三酰甘油[19]，這些成分常因以下原因產生變化：（1）一些肥胖患者的血樣有可能含有比正常血樣更多的脂類；（2）因患者代謝功能差異等原因，很有可能造成采集到的血漿樣品中血脂含量偏高；（3）藥動學及生物等效性試驗中，需進行餐后給藥試驗，餐后血脂含量升高。在樣品處理過程中，血漿樣品中的脂質成分亦有可能對待測物的提取回收率及色譜分離產生影響[19]。因此，為保證不同血液樣品中氟康唑濃度的準確測定，本研究對溶血血漿及高脂血漿的基質效應進行了考察。結果顯示，上述血漿的基質效應均不會影響待測物的測定。

綜上所述，本研究建立的測定人血漿中氟康唑濃度的同位素稀釋-UPLC-MS/MS法具有簡便、快速、專屬性強、準確度高等特點，適用于氟康唑臨床TDM及藥動學研究。

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（收稿日期：2018-05-28 修回日期：2018-11-01）

（編輯：張元媛）