楊偉克 劉增虎 等

摘要：【目的】探究酚氧化酶原基因（PPO1和PPO2）及酚氧化酶在家蠶眠期血淋巴中的變化規(guī)律，為深入解析家蠶眠期酚氧化酶的功能及其基因表達特征提供新線索。【方法】以家蠶四齡將眠、四齡眠（頭殼剛開裂）0 h、四齡眠6 h、四齡眠12 h、四齡眠24 h和五齡起蠶為試驗材料，采用實時熒光定量PCR檢測其血淋巴PPO1和PPO2基因的表達情況，并分析血淋巴酚氧化酶活性的變化規(guī)律?！窘Y(jié)果】家蠶血淋巴PPO1和PPO2基因在四齡將眠至五齡起蠶不同發(fā)育時期均有一定程度的表達，且兩者的變化規(guī)律一致，表現(xiàn)為四齡將眠最高、五齡起蠶最低，總體上呈先減后增再減的變化趨勢。在家蠶四齡將眠至五齡起蠶不同發(fā)育時期血淋巴酚氧化酶活性整體上也呈先降低后急劇升高再降低的變化趨勢，四齡將眠為5.99 U/mg，五齡起蠶為6.02 U/mg，與酚氧化酶原基因表達模式基本一致?！窘Y(jié)論】家蠶四齡將眠至五齡起蠶不同發(fā)育時期血淋巴酚氧化酶活性變化規(guī)律與酚氧化酶原基因（PPO1和PPO2）的轉(zhuǎn)錄表達模式基本一致，說明酚氧化酶在家蠶眠期即發(fā)揮免疫防御功能，又參與蠶體新舊表皮的更替過程。

關(guān)鍵詞： 家蠶;酚氧化酶;酚氧化酶原基因;眠期;血淋巴;變化規(guī)律

中圖分類號： S881.21? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 文獻標志碼： A 文章編號：2095-1191（2019）02-0391-06

Abstract：【Objective】In order to provide new clues for in-depth analysis on the function and gene expression characteristics of phenoloxidase in silkworm during molting， this study explored the change rules of the prophenoloxidase gene （PPO1 and PPO2） expression and phenoloxidase activities in hemolymph of silkworm during the molting stage. 【Method】The real-time fluorescent quantitative PCR was applied to analyze the expression of PPO1 and PPO2， meanwhile the activity of phenoloxidase in hemolymph were examined， using the silkworm at the point of the fourth instar molting 0 h（head capsule cracked）， 6 h， 12 h， 24 h and the newly molted fifth instar as the experimental materials. 【Result】PPO1 and PPO2 genes in silkworm hemolymph all expressed from upcoming forth instar molting to newly molted fifth instar， and the variation rules of the two genes were the same. The expression levels of PPO1 and PPO2 were the highest at the upcoming fourth instar molting and the lowest at the newly molted fifth instar. It showed a trend of descending first and then ascending. The phenoloxidase activities were basically consistent with the change of gene expression. They were 5.99 U/mg at the upcoming fourth instar molting and 6.02 U/mg at the newly molted fifth instar， which were reduced first and then increased sharply and then decreased during the different developmental stages. 【Conclusion】The change trend of phenoloxidase activity in hemolymph are basically consistent with transcription expression of prophenoloxidase genes（PPO1 and PPO2） in the different development stages from the fourth molting to the newly molted fifth instar，which suggests that the phenoloxidase may not only play the role of immune defense， but also participate in the epidermis replacement process during the molting stage of silkworm.

Key words： Bombyx mori; phenoloxidase; prophenoloxidase gene; molting stage; hemolymph; variation rule

0 引言

【研究意義】酚氧化酶（Phenoloxidase）又名酪氨酸酶，廣泛分布于動植物體內(nèi)（白霜等，2008;陳曉宇等，2015），在昆蟲血淋巴中一般以無活性的酚氧化酶原（Prophenoloxidase，PPO）形式存在（Kan et al.，2008;Lu et al.，2014）。當機體受外源異物侵染時，酚氧化酶原通過絲氨酸蛋白酶及其抑制劑的共同作用，被轉(zhuǎn)化為具有活性的酚氧化酶，活化酚氧化酶進一步催化酪氨酸形成醌類物質(zhì)，調(diào)控細胞的吞噬及黑化等免疫防御過程（劉麗萍等，2013;王俊秀和李亞紅，2015）。酚氧化酶的活性及含量常作為評價昆蟲及無脊椎動物免疫能力的指標（李國榮等，2003;蔣經(jīng)偉等，2015），因此探究家蠶眠期血淋巴酚氧化酶活性及其基因的表達變化規(guī)律，可為進一步揭示酚氧化酶在家蠶眠期的生理功能提供理論依據(jù)。【前人研究進展】昆蟲缺乏哺乳類動物復雜的免疫球蛋白，主要通過體液免疫和細胞免疫抵御外源病原微生物侵染（張永紅等，2017）。其中，昆蟲體液免疫是通過Toll和IMD途徑誘導產(chǎn)生抗菌肽，分泌到血淋巴中以抵御外源病原微生物的入侵;細胞免疫則是通過血細胞對外源病原微生物的吞噬和包被及黑化等作用所完成（Kingsolver et al.，2013）。關(guān)于黑化作用研究較多的是酚氧化酶原激活系統(tǒng)，包括多酚氧化酶原、多酚氧化酶、絲氨酸蛋白酶及其抑制劑、相關(guān)識別因子和外源異物等（Clark and Strand，2013;苑勝壘等，2016）。家蠶是鱗翅目模式昆蟲的代表，也是一種具有極高經(jīng)濟價值的吐絲昆蟲。早在1971年Ashida等就分離純化了家蠶酚氧化酶并對其酶學基本性質(zhì)進行研究，1999年Satoh等克隆獲得家蠶酚氧化酶原基因（張永亮，2008;劉麗萍等，2013）。陳文柱等（2005）通過測定三齡眠后20 d的家蠶血淋巴酚氧化酶活力，發(fā)現(xiàn)家蠶酚氧化酶活力在各齡初期和末期較低，而在各齡中期相對較高，與家蠶各齡期的抗性規(guī)律一致，即酚氧化酶與家蠶抗性存在一定關(guān)聯(lián)。張永亮和朱勇（2009）對家蠶的2個酚氧化酶原基因（PPO1和PPO2）進行轉(zhuǎn)錄表達分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)PPO1和PPO2基因表達具有明顯的組織和時空特異性。Wang等（2013）研究表明，酚氧化酶與蛻皮激素協(xié)同調(diào)控家蠶蛻皮，且酚氧化酶原基因受蛻皮激素調(diào)控，干涉PPO1基因會導致家蠶不能正?；?。唐芬芬等（2016）研究證實，喂食家蠶核型多角體病毒（BmNPV）能誘導家蠶血淋巴酚氧化酶原基因（PPO1和PPO2）上調(diào)表達，且酚氧化酶活性顯著增加，提示酚氧化酶在家蠶抗病毒免疫防御過程中發(fā)揮一定作用。毛鈺霞等（2017）研究也發(fā)現(xiàn)，五齡家蠶幼蟲酚氧化酶活性變化具有明顯的發(fā)育時期和組織特異性，且不同品系間的酶活性存在差異?！颈狙芯壳腥朦c】家蠶一般有4個眠期，進入眠期后主要表現(xiàn)為不吃不動，此時自身的能量代謝變慢，在一定程度上會影響相應(yīng)的免疫防御能力。酚氧化酶作為一類重要的免疫蛋白，在昆蟲免疫防御、表皮鞣化、黑化和傷口愈合等過程中發(fā)揮重要作用（劉麗萍等，2013;王俊秀和李亞紅，2015），但至今有關(guān)家蠶眠期酚氧化酶活性及其基因表達規(guī)律的研究鮮見報道?！緮M解決的關(guān)鍵問題】以四齡將眠至五齡起蠶不同發(fā)育階段的家蠶血淋巴為試驗材料，檢測分析酚氧化酶原基因的表達及其活性變化，旨在明確家蠶眠期血淋巴PPO1和PPO2基因及酚氧化酶的變化規(guī)律，為深入解析家蠶眠期酚氧化酶的功能及基因表達特征提供新線索。

1 材料與方法

1. 1 試驗材料

家蠶品系大造（Dazao）人工孵化，在25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中桑葉飼養(yǎng)。主要試劑：高純總RNA快速提取試劑盒（北京百泰克生物技術(shù)有限公司，貨號RP1202）、反轉(zhuǎn)錄試劑盒（TaKaRa公司，貨號RR047A）、熒光定量試劑（Bio-Rad公司，貨號1725121）。主要儀器設(shè)備：PCR擴增儀、瓊脂糖凝膠電泳儀、凝膠成像系統(tǒng)、低溫高速離心機和CFX-96實時熒光定量PCR檢測儀等。

1. 2 試驗方法

1. 2. 1 樣品采集 分別收集家蠶四齡將眠（停食）、四齡眠（頭殼剛開裂）0 h、四齡眠6 h、四齡眠12 h、四齡眠24 h和五齡起蠶的血淋巴，每6頭蠶的血淋巴為一份樣品（收集于同一預(yù)冷離心管中），每次取樣均設(shè)5個重復;每份血淋巴又分為兩份，一份用于抽總提RNA，一份用于制備酶液。取樣過程均在冰上操作，樣品收集后-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1. 2. 2 RNA提取及反轉(zhuǎn)錄 按照高純總RNA快速提取試劑盒說明抽提家蠶血淋巴總RNA。在核酸蛋白分析儀上測定OD260/OD280，計算RNA樣品濃度，并反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。

1. 2. 3 引物設(shè)計 以真核翻譯起始因子4A基因（家蠶芯片探針I(yè)D：SW22934）為熒光定量內(nèi)參基因，酚氧化酶原基因PPO1（GenBank登錄號BAA08368）和PPO2（GenBank登錄號BAA08369）為靶標基因，家蠶管家基因Actin3（GenBank登錄號X04507）用于檢測cDNA模板質(zhì)量。利用Primer Premier 5.0設(shè)計引物（表1）。

1. 2. 4 cDNA模板和靶標基因引物檢測 利用表1中家蠶管家基因Actin3引物、酚氧化酶原基因PPO1和PPO2引物，以家蠶血淋巴cDNA為模板進行PCR擴增，擴增程序：94 ℃預(yù)變性4 min;94 ℃ 30 s，58 ℃ 45 s，72 ℃ 30 s，進行35個循環(huán);最后72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測。

1. 2. 5 實時熒光定量PCR檢測 參照實時熒光定量PCR試劑盒說明進行操作，擴增程序：95 ℃預(yù)變性30 s;95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，進行40個循環(huán);65 ℃ 5 s（每次增加0.5 ℃，直到95 ℃）。CFX-96實時熒光定量PCR檢測儀記錄試驗數(shù)據(jù)，以2?△△Ct法計算目的基因相對表達量（Livak and Schmittgen，2001），并利用Excel 2016進行數(shù)據(jù)處理及制圖。

1. 2. 6 酶活性測定 取1.5 mL家蠶血淋巴，加入0.5 mL二甲胂酸鈉（CAC）緩沖液，4 ℃下7500 r/min離心15 min，上清液即為待測酶液。參照唐芬芬等（2016）的方法測定酶活性：取50 μL待測酶液，加入40 μL的0.1 mol/L氯代十六烷基吡啶（CPC），30 ℃孵育10 min，再加入50 μL的0.02 mol/L L-3，4-二羥基苯丙氨酸（L-DOPA）繼續(xù)孵育1 min，最后以CAC緩沖液補足至3.0 mL。在490 nm處測定1 min內(nèi)吸光值的增加值，重復5次。以每毫克蛋白吸光值增加0.001為一個酶單位（U），計算酶活性。

2 結(jié)果與分析

2. 1 PCR檢測結(jié)果

為保證實時熒光定量PCR檢測結(jié)果的準確性，不僅需要高質(zhì)量的cDNA模板，還要求設(shè)計的引物必須具有特異性，不能產(chǎn)生明顯的引物二聚體。為此，本研究以反轉(zhuǎn)錄獲得的cDNA為模板，用家蠶管家基因Actin3引物進行模板質(zhì)量PCR檢測。結(jié)果如圖1所示，所有cDNA模板均能擴增出亮度均一的目的基因條帶，說明反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA模板質(zhì)量較高，可用于后續(xù)的實時熒光定量PCR檢測。同時對PPO1和PPO2基因定量引物進行PCR檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在不同cDNA模板中均可擴增出單一的PPO1和PPO2基因條帶，且無明顯的引物二聚體條帶產(chǎn)生（圖2），表明設(shè)計的定量引物特異性較好，能滿足實時熒光定量PCR檢測要求。

2. 2 家蠶PPO1和PPO2基因的表達情況

利用實時熒光定量PCR對家蠶四齡將眠至五齡起蠶不同發(fā)育時期血淋巴PPO1和PPO2基因進行檢測分析，結(jié)果如圖3所示。在家蠶四齡將眠至五齡起蠶的不同發(fā)育時期，其血淋巴PPO1和PPO2基因的相對表達量均以四齡將眠最高、五齡起蠶最低。在整個四齡眠期，家蠶血淋巴PPO1和PPO2基因的相對表達量均呈先減少后增加的變化趨勢，且PPO2基因的相對表達量整體上略高于PPO1基因。在整個試驗觀察期內(nèi)，家蠶血淋巴中兩個酚氧化酶原基因的轉(zhuǎn)錄表達規(guī)律相似。

2. 3 不同發(fā)育時期家蠶血淋巴酚氧化酶活性變化規(guī)律

如圖4所示，家蠶血淋巴酚氧化酶活性在四齡將眠為5.99 U/mg，五齡起蠶為6.02 U/mg。在整個四齡眠期，家蠶血淋巴酚氧化酶活性呈先降低后急劇升高的變化趨勢，以四齡眠12 h最低（3.37 U/mg），隨后急劇升高，至四齡眠24 h酶活性達最高值（8.47 U/mg）。綜合家蠶PPO1和PPO2基因的表達情況發(fā)現(xiàn)，酚氧化酶活性變化趨勢與酚氧化酶原基因表達模式基本一致。

3 討論

休眠蛻皮是家蠶的重要生理特征之一，幼蟲的蛻皮包括真皮細胞活性增強、表皮分離、蛻皮液分泌、新表皮形成和舊表皮蛻去等一系列連續(xù)過程（馮麗春和沈衛(wèi)德，2015）。新形成的外表皮是在家蠶眠后期由內(nèi)表皮轉(zhuǎn)化而來，在這一轉(zhuǎn)化過程中需經(jīng)孔道運送酚氧化酶至上表皮，使酪氨酸氧化生成二羥苯丙氨酸及相應(yīng)的醌類物質(zhì)，醌類物質(zhì)與外層內(nèi)表皮中的節(jié)肢蛋白結(jié)合，鞣化生成堅硬而不溶的骨蛋白，使內(nèi)表皮的外層硬化成外表皮。在形成新表皮的同時伴隨著黑色素形成，而在黑色素的形成過程中Yellow蛋白和酚氧化酶發(fā)揮著極其重要的作用（Wittkopp et al.，2002，2003）。在昆蟲蛻皮過程中，蛻皮激素和保幼激素共同決定了新表皮層的生成和發(fā)育。蛻皮激素20E還能顯著上調(diào)南瓜實蠅和家蠶PPO1基因的表達，干涉幼蟲化蛹（Wang et al.，2013;Zhang et al.，2018），暗示蛻皮激素與酚氧化酶協(xié)同調(diào)控昆蟲的蛻皮變態(tài)。

昆蟲進入眠期發(fā)育時處于停食的相對饑餓狀態(tài)和對病原抵抗力的相對薄弱環(huán)節(jié)，但此時昆蟲會發(fā)生某種免疫機制，提高細胞或體液中的相關(guān)效應(yīng)因子，主動激活自身機體的防御能力（Tsuzuki et al.，2012;Guo et al.，2014;邵榆嵐等，2017）。酚氧化酶不僅參與昆蟲的體液免疫或細胞免疫防御過程，還在新表皮的鞣化、硬化和表皮著色過程中發(fā)揮重要作用（Theopold et al.，2004）。本研究的實時熒光定量PCR檢測結(jié)果顯示，家蠶血淋巴PPO1和PPO2基因在四齡將眠至五齡起蠶不同發(fā)育時期均有一定程度的表達，且兩者的變化規(guī)律一致，表現(xiàn)為四齡將眠最高、五齡起蠶最低，總體上呈先減后增再減的變化趨勢。家蠶血淋巴酚氧化酶活性測定結(jié)果顯示，在家蠶四齡將眠至五齡起蠶不同發(fā)育時期血淋巴酚氧化酶活性整體上也呈先降低后急劇升高再降低的變化趨勢，四齡將眠為5.99 U/mg、五齡起蠶為6.02 U/mg，與酚氧化酶原基因表達模式基本一致。

酚氧化酶原基因的表達模式及酶活變化規(guī)律與蠶體發(fā)育進程密切相關(guān)。家蠶從四齡將眠至四齡眠6 h，機體的代謝變慢，酚氧化酶及其他免疫蛋白也隨之減少，因此酚氧化酶原基因表達下降，其酶活性減弱。在家蠶四齡眠12和24 h，機體免疫防御相對薄弱，但酚氧化酶原基因表達逐漸增加，對應(yīng)的酶活性從眠24 h開始急劇上升至最高值，推測此時基因表達量和酶活性的增強是家蠶機體通過其他方式主動提高自身免疫能力。Asano和Ashida（2001）研究發(fā)現(xiàn)，家蠶表皮中酚氧化酶不能轉(zhuǎn)運至血淋巴，但血淋巴中的酚氧化酶經(jīng)修飾后可轉(zhuǎn)運至表皮。家蠶眠期一個重要的生理進程就是蛻去舊表皮合成新表皮（馮麗春和沈衛(wèi)德，2015）。四齡眠12和24 h是蠶體合成新表皮的關(guān)鍵時期之一，表皮的鞣化、硬化及色素的沉積都需要酚氧化酶參與，此時血淋巴酚氧化酶原基因表達量增加及酶活性增強很有可能是為了轉(zhuǎn)運酚氧化酶至表皮而參與新表皮的形成。這也提示血淋巴酚氧化酶及PPO1和PPO2基因在家蠶新表皮形成中發(fā)揮著重要作用。

4 結(jié)論

家蠶四齡將眠至五齡起蠶不同發(fā)育時期血淋巴酚氧化酶活性變化規(guī)律與酚氧化酶原基因PPO1和PPO2的轉(zhuǎn)錄表達模式基本一致，說明酚氧化酶在家蠶眠期即發(fā)揮免疫防御功能，又參與蠶體新舊表皮的更替過程。

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（責任編輯 蘭宗寶）