周淑芬 施惠芳

摘?要：RRTZF鋅指基因在植物生長發(fā)育和脅迫反應中起著重要作用。利用TALEN基因組編輯技術定點突變水稻RRTZF基因OsTZF9，結果表明：根據(jù)日本晴基因組中的OsTZF9基因序列，設計3對TALEN靶序列，并構建相應的3個TALEN植物敲除表達載體;通過農(nóng)桿菌介導法分別將3個TALEN敲除載體導入水稻明恢86和秀水134的胚性愈傷組織中，獲得了100個轉化再生植株，PCR檢測獲得87個陽性植株;PCR擴增轉基因植株靶突變區(qū)并測序列，發(fā)現(xiàn)所有轉基因植株均未出現(xiàn)靶突變。

關鍵詞：水稻;OsTZF9基因;TALEN;定點突變

DOI： 10.13651/j.cnki.fjnykj.2019.02.004

Abstract： RRTZF zinc finger gene plays an important role in plant growth， development and stress response. Target mutation of RRTZF gene OsTZF9 in rice was carried out by TALEN genome editing technique. The results showed that three pairs of TALEN target sequences were designed according to the sequence of OsTZF9 gene in Nipponbare， and three plant knockout expression vectors were constructed and introduced into embryogenic callus of Minghui 86 and Xiushui 134 by Agrobacteriummediated transformation， obtaining 100 transformants. Among them， 87 positive plants were obtained through PCR detection. The target mutation regions of the transgenic plants were detected and sequenced， to find no target mutation.

Key words： Rice; OsTZF9 gene; TALEN; Sitedirected mutation

RRTZF鋅指基因是一類植物特有的CCCH型鋅指基因，因其編碼蛋白含有1個TZF模體及其上游50個氨基酸為富含精氨酸區(qū)（RR）而得名，該TZF模體由中間間隔16個氨基酸的2個不同CCCH結構域組成[1-2]。通過全基因組學分析，目前已在多種單雙子葉植物中鑒定了許多RRTZF成員。除了擬南芥中所有RRTZF基因的功能得到一定程度的解析，其他植物中僅有少部分TZF基因功能被研究。

OsTZF9是一個水稻胚乳中特異性表達的RRTZF基因，酵母單雜分析發(fā)現(xiàn)，OsTZF9蛋白與谷蛋白基因啟動子區(qū)結合，RNAi技術分析發(fā)現(xiàn)RNAi轉基因植株與對照表型沒有區(qū)別，但部分轉基因植株種子中的谷蛋白含量比對照低，表明OsTZF9基因具有下調谷蛋白基因表達的功能[3-5]。在擬南芥的RRTZF基因功能研究中，發(fā)現(xiàn)不同RRTZF基因過表達植株具有一因多效的作用，且存在許多相似表型[6]，暗示植物RRTZF基因具有一定程度的功能冗余。由于這類基因存在著功能冗余，許多RRTZF基因單突變體出現(xiàn)的表型很微小，難以觀察到或者根本就沒有任何表型，因此通過RNAi或反義RNA等擬敲除技術獲得的擬突變體常因抑制不徹底更難觀察到表型。

基因組編輯是一種在基因組水平上對DNA序列進行定向改造的遺傳操作技術，克服了RNAi技術抑制不徹底的缺陷。TALEN技術是2011 年發(fā)展起來的非常有效的基因組編輯技術，由黃單胞桿菌轉錄激活類效應子TALE和核酸內切酶FokⅠ的DNA切割域組成，前者能特異性識別DNA序列，后者為DNA切割域[7]。本研究構建了OsTZF9基因的TALEN敲除載體并獲得其轉基因植株，為進一步研究OsTZF9基因的功能奠定基礎。

1?材料與方法

1.1?植物材料

轉基因受體材料為秈稻明恢86和粳稻秀水134。

1.2?載體與菌株

TALEN左右臂骨架載體pTALENL20和pTALENR16、改造過的pCAMBIA1301載體、大腸桿菌D18由上海斯丹賽公司提供，大腸桿菌DH5a和根癌農(nóng)桿菌LBA4404由福建省農(nóng)業(yè)遺傳工程重點實驗室保存。

1.3?主要試劑

TALEN試劑盒（上海斯丹賽公司），PrimeSTAR HS DNA Polymerase（TaKaRa公司），Taq DNA 聚合酶、質粒提取試劑盒、DNA純化試劑盒（天根生化科技有限公司），限制性內切酶、DNA Ligation Kit（Fermentas公司），引物合成、DNA測序（上海博尚生物技術有限公司），潮霉素（Roche 公司），組織培養(yǎng)試劑（Sigma公司）。

1.4?載體構建

根據(jù)TALEN靶序列設計原則，在OsTZF9基因的編碼序列區(qū)設計TALEN左右臂識別序列。根據(jù)設計的TALEN左右臂識別序列，按照上海斯丹賽生物技術有限公司提供的模塊合成方法（FastTALETMTALEN試劑盒），合成TALEN左右臂模塊并分別構建于骨架載體pTALENL20和pTALENR16中，經(jīng)酶切和測序驗證后，獲得構建正確的TALEN左臂和右臂基因表達盒。用HindⅢ和AscⅠ酶從質粒中切取TALEN左臂基因表達盒，膠回收5 kb條帶;用SacⅠ和AscⅠ酶從質粒中切取TALEN右臂基因表達盒，膠回收4 kb條帶;用HindⅢ和SacⅠ酶切改造過的pCAMBIA1301植物表達載體，膠回收8.5 kb條帶。將上述3個片段一步法連接獲得含有TALEN左右臂基因表達盒的植物雙元表達載體，并電擊轉化農(nóng)桿菌LBA 4404，于-80℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5?農(nóng)桿菌介導的水稻遺傳轉化

以日本晴的幼胚誘導愈傷組織，并用于隨后的轉化。水稻愈傷組織的誘導、繼代及與農(nóng)桿菌的共培養(yǎng)，抗性愈傷組織的篩選及再生等相關的培養(yǎng)基和具體的試驗步驟參照文獻[8]進行。

1.6?轉基因植株檢測

CTAB法[9]提取水稻植株葉片基因組DNA，在25 μL體系中分別擴增TALEN表達框內的基因片段和OsTZF9靶突變區(qū)。前者引物為FOKF（5′TGACCGAGTTCAAGTTCC 3′）和NOSR（5′TTGCGGGACTCTAATCA3′）;后者引物為77GF（5′CAAAGCACATTGCAAACACAG 3′）和77GR（5′GTAACACACCCATCTACACGAAG3′）。PCR反應條件為：94℃預變性5 min;94℃變性45 s，56℃退火45 s （溫度依據(jù)GC含量高低而定），72℃延伸45 s（時間根據(jù)擴增長度而定，1 kb·min-1），共35個循環(huán);72℃延伸10 min。取PCR擴增產(chǎn)物（5 μL）于瓊脂糖凝膠上進行電泳并用凝膠成像儀拍照分析。

2?結果與分析

2.1?設計TALEN靶序列

水稻OsTZF9基因包含1個外顯子，全長843 bp，編碼280個氨基酸，含有1個CHCH和1個TZF模體（圖1）。根據(jù)TALEN左右臂靶序列的設計原則，在CHCH和TZF模體區(qū)域共設計了3對TALEN靶序列，如表1所示。TALEN左右臂靶序列的設計原則：（1）左右臂的識別長度為12～19 bp，間隔序列長度為12～21 bp。（2）靶位點鄰5′端堿基是T，3′端以T結尾（3）靶位點盡量多含A和C，適量T，少量G。（4）盡量避開磷酸化位點，如編碼蘇氨酸、絲氨酸、賴氨酸和精氨酸的位點。

2.2?構建TALEN左右臂載體

將左右臂識別序列3′端的最后一個T去除，其余堿基按1個或2個堿基組合依次進行標記（從1標到9），根據(jù)標記好的堿基在試劑盒的模塊中選擇對應編號的模塊與TALEN左臂（pTALENL20）或右臂（pTALENR16）線性骨架載體進行9個片段同時連接，熱激轉化D18感受態(tài)細胞，挑取單克隆菌落，經(jīng)搖菌提質粒后使用Bam H Ⅰ和SpeⅠ酶切獲得重組載體，如圖2所示。進一步將上述的重組載體送公司測序，與設計的標準序列在NCBI中進行tBlastX比對。結果顯示6個重組載體均100%正確。因此，本研究成功構建了6個正確的TALEN左右臂重組載體。

圖2?TALENs左右臂質粒雙酶切鑒定電泳圖注：M為λEcoT14 Ⅰ digest Marker;1為TALENsL1左臂質粒酶切;2為TALENsL2左臂質粒酶切;3為TALENsL3左臂質粒酶切;4為TALENsR1右臂質粒酶切;5為TALENsR2右臂質粒酶切;6為TALENsR3右臂質粒酶切。

用HindⅢ和AscⅠ酶切構建正確的TALEN左臂載體，用SacⅠ和AscⅠ酶切構建正確的TALEN右臂載體，前者膠回收約5 kb的條帶，后者膠回收約4 K的條帶，用于后續(xù)的載體構建實驗，圖3為膠回收后電泳檢測結果。

2.3?構建TALEN植物敲除表達載體

將上述膠回收的左臂（5 kb）、右臂（4 kb）和改造過的p1301線性載體（8.5 kb）于22℃連接3 h，轉化感受態(tài)D18。次日挑取單克隆，于37℃、250 r·min-1的搖床中培養(yǎng)16 h左右，提質粒跑電泳，比對照質粒大的質粒初步確定為連接成功的目的載體（圖4）;進一步用HindⅢ和SacⅠ雙酶切，出現(xiàn)3個條帶約為8、5和4 kb（圖5），說明酶切結果正確;最后用SacⅠ酶切鑒定正確的質粒，出現(xiàn)約4 kb和12 kb兩個條帶（圖6），其中前者為右臂，后者為左臂，分別膠回收這兩個片段送往公司測序，測序結果均正確，即完成OsTZF9基因3個靶位點的TALEN敲除載體構建，并命名為pOsTZF9TALEN1、pOsTZF9TALEN2和pOsTZF9TALEN3。同時通過電擊法將上述3個載體分別導入農(nóng)桿菌中，25%甘油保存于-80℃中。

2.4?水稻遺傳轉化及檢測

將構建好的質粒pOsTZF9TALEN1、pOsTZF9TALEN2和pOsTZF9TALEN3分別轉化到水稻明恢86和秀水134中，對獲得的轉化再生植株的葉片用浸泡潮霉素法和PCR方法檢測，結果如表2所示，在明恢86受體材料中僅有pOsTZF9TALEN1質粒獲得轉基因植株，其轉化率為5.00%;在秀水134受體材料中，雖然3個載體均能獲得轉基因再生植株，但其轉化率也不高。

PCR擴增靶突變區(qū)片段，并測序分析其靶位點突變情況，結果發(fā)現(xiàn)所有轉基因植株均未產(chǎn)生靶突變。為了排除可能由于TALEN模塊發(fā)生重組導致TALEN活性喪失問題，利用引物305（5′CTCCCCTTCAGCTGGACAC 3′）和306（5′AGCTGGGCCACGATTGAC 3′）對轉基因植物基因組DNA進行PCR擴增TALEN左右臂序列。由于左右臂大小比較接近，因此對擴增產(chǎn)物TA克隆并轉化到大腸桿菌DH5α中，然后對單菌落進行菌液PCR，選擇擴增片段2 kb左右菌液進行測序，測序結果比對均正確，說明導入水稻中的TALEN模塊未發(fā)生重組。

3?結論與討論

本研究成功構建了OsTZF9基因3個靶位點的TALEN敲除載體，通過農(nóng)桿菌介導法導入水稻明恢86和秀水134中，成功獲得87個轉基因植株。但在轉化過程中發(fā)現(xiàn)，TALEN敲除載體明顯比其他載體的轉化率低（本實驗室構建的其他基因的TALEN敲除載體也有類似現(xiàn)象），原因之一可能是TALEN植物表達載體相對于其他轉化載體大，不易轉化。

本研究檢測了所有轉基因植株，但均未檢測到靶突變體。其實，本試驗在檢測其他基因的TALEN轉基因植株靶突變情況時，也發(fā)現(xiàn)其突變率很低。其原因可能有3個：一是TALEN載體存在著高度重復，易發(fā)生同源重組， 進而影響其活性;二是TALEN表達框插入的隨機性，當插入到某些重要的基因內部， 使TALEN表達框出現(xiàn)基因沉默或者表達受到抑制;三是TALEN表達框插入到植物體中有表達，但是植物體把它當成是外源物，觸發(fā)植物體的自我免疫功能，從而降低了TALEN蛋白的活性，因此就無法識別切割目的基因，導致無法產(chǎn)生突變體。本研究檢測3個TALEN模塊的同源重組情況，均未發(fā)生同源重組，其具體原因有待進一步研究。

因此，為了能獲得靶基因突變體，建議多設計幾個靶位點;同時為了減少后期的工作量，可以先在原生質體中檢測TALEN蛋白的活性，再轉化愈傷組織。由于TALEN蛋白在受體細胞中可持續(xù)起作用，通過對抗性愈傷繼續(xù)進行繼代培養(yǎng)可產(chǎn)生新突變，增加突變的類型。

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（責任編輯：柯文輝）