劉洪玉 孫子豪 李保華 王彩霞

摘要 2017年9月，在山東膠州調(diào)查蘋果病毒病時發(fā)現(xiàn)‘舞美果實表現(xiàn)出明顯的花臉癥狀，取發(fā)病樹體芽組織嫁接于健康‘富士蘋果幼樹上，采用RT-PCR技術(shù)對其是否含有蘋果銹果類病毒進(jìn)行了檢測，并利用DNAMAN、MEGA 5.1等軟件對其全序列進(jìn)行了分析。結(jié)果表明，顯癥‘舞美果實、發(fā)病樹體枝條及嫁接‘富士枝條中均可檢測出ASSVd，無癥狀‘舞美果實和相應(yīng)樹體枝條中均未檢測到ASSVd?！杳婪蛛x物基因組主流序列為333 nt （登錄號MG745387），與GenBank中已報道的ASSVd序列一致性為92%～99%。序列多重比對及系統(tǒng)進(jìn)化樹分析發(fā)現(xiàn)，該分離物的末端保守區(qū)和中央保守區(qū)與ASSVd參考序列一致，且與不同來源的ASSVd分離物親緣關(guān)系較近。這是首次在‘舞美蘋果上發(fā)現(xiàn)和鑒定出蘋果銹果類病毒。

關(guān)鍵詞 蘋果銹果類病毒; ‘舞美; RT-PCR; 序列分析

中圖分類號： S 432.1

文獻(xiàn)標(biāo)識碼： A

DOI： 10.16688/j.zwbh.2018233

蘋果銹果病在遼寧[1]、新疆[2]、山東[3]、河北[4]等蘋果主產(chǎn)區(qū)均有發(fā)生，近年來呈不斷蔓延趨勢，已成為制約我國蘋果產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展的主要限制因子。該病的病原為蘋果銹果類病毒Apple scar skin viroid （ASSVd），屬于馬鈴薯紡錘塊莖類病毒科Pospiviroidae蘋果銹果類病毒屬Apscarviroid[5]。ASSVd基因組為單鏈環(huán)狀RNA，約330個核苷酸，存在于細(xì)胞核內(nèi)，具有自我復(fù)制能力，可形成穩(wěn)定的棒狀二級結(jié)構(gòu)，具有一個中央保守區(qū)（CCR）和一個末端保守區(qū)（TCR）[6]。蘋果銹果類病毒除侵染蘋果外，還可危害梨[7]、桃[8]、杏[9]等，在果實表面產(chǎn)生銹狀斑、花臉、畸形等癥狀，導(dǎo)致果實喪失商品價值，造成嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)損失[4]。ASSVd主要通過嫁接、帶病毒苗木等傳播，尚未發(fā)現(xiàn)其昆蟲傳播介體[10]。因此，繁育和應(yīng)用無病毒苗木是生產(chǎn)中防治木本植物病毒病害的最有效措施。

目前，蘋果銹果類病毒的檢測方法主要為生物學(xué)癥狀觀察和分子生物學(xué)檢測技術(shù)[4]。ASSVd屬于非潛隱性病毒，但發(fā)病癥狀僅表現(xiàn)在果實上，且常由于環(huán)境條件、品種等因素影響，導(dǎo)致發(fā)病癥狀差異較大。由于生物學(xué)鑒定周期長，等癥狀出現(xiàn)，已經(jīng)造成無法挽回的損失[4，11]。分子生物學(xué)方法主要包括常規(guī)RT-PCR、實時定量PCR、斑點雜交等[4， 1011]，這些方法具有檢測靈敏度高、特異性強、快速等優(yōu)點，且適用于大批量樣品的檢測，在田間病害的早期診斷及無病毒種苗繁育中得到廣泛應(yīng)用。

芭蕾蘋果（ballerina apple）又稱柱型蘋果（columnar apple），是20世紀(jì)90年代從英國引進(jìn)的新優(yōu)蘋果品種，其中包括一些觀賞型品種，如‘舞美 （Maypole）[12]。該品種由威塞克自然雜交實生苗中選出，花冠為艷麗的胭脂紅色，花期長，極具觀賞價值; 果實圓形或圓錐形，單果重約35 g，大小整齊，成熟時著全面橙紅色，鮮艷美觀，而且果實可用來加工果醬、果汁和果茶等，用途非常廣泛。2017年9月份，在山東膠州果園調(diào)查蘋果病毒病時發(fā)現(xiàn)部分‘舞美果實表現(xiàn)出明顯的花臉癥狀，采集發(fā)病果實及發(fā)病樹體1～2年生枝條，取芽組織嫁接在青島農(nóng)業(yè)大學(xué)試驗田健康‘富士蘋果幼樹上，提取樣品總RNA進(jìn)行RT-PCR檢測和測序分析，均證實‘舞美被蘋果銹果類病毒所侵染，這是首次在該蘋果品種上發(fā)現(xiàn)和鑒定ASSVd。

1 材料與方法

1.1 材料

供試材料：2017年9月，在山東膠州商業(yè)蘋果園中采集表現(xiàn)花臉癥狀的‘舞美果實和發(fā)病樹體的1～2年生枝條，取芽組織嫁接在青島農(nóng)業(yè)大學(xué)試驗田健康‘富士蘋果（無毒苗栽植，且嫁接前進(jìn)行了ASSVd檢測）幼樹上。RT-PCR所用陰性對照為健康組培苗，陽性對照為本實驗室嫁接保存的帶毒‘富士幼樹。

菌株與試劑：植物柱式總RNA抽提純化試劑盒和氨芐青霉素購自生工生物工程（上海）股份有限公司; Prime ScriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser反轉(zhuǎn)錄試劑盒、Prime STAR Max DNA Polymerase、pMD 18-T克隆載體購自TaKaRa（大連）有限公司; DNA凝膠回收試劑盒、DNA Marker購自擎科梓熙（青島）生物公司; 大腸桿菌菌株DH5α由本實驗室保存。

1.2 試驗方法

1.2.1 總RNA提取及cDNA第一鏈合成

取0.2 g果皮和枝條皮層組織，用液氮研磨后參照植物柱式總RNA抽提純化試劑盒說明書提取總RNA，其濃度和質(zhì)量通過P330超微量分光光度計（德國Implen公司）檢測后保存于-80℃?zhèn)溆谩DNA第一鏈的合成參照Prime ScriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書，以1 μg總RNA為模板，Oligo （dT）18為引物，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，保存于-20℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 RT-PCR檢測

參照趙英和牛建新[3]的報道合成ASSVd的檢測引物，ASSVd-dete-F： 5′-CAGCACCACAGGAA-CCTCACGG-3′; ASSVd-dete-R： 5′-CTCGTCGT-CGACGAAGG-3′。以合成的cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。25 μL擴(kuò)增體系包括： 12.5 μL 2×Prime STAR Max DNA Polymerase，正向和反向引物各0.5 μL，模板cDNA 1.0 μL，ddH2O 10.5 μL。反應(yīng)程序為： 95℃預(yù)變性3 min; 95℃變性10 s，58℃退火15 s，72℃延伸4 s，35個循環(huán); 72℃延伸5 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測。

1.2.3 ASSVd的全長克隆

根據(jù)朱慧[13]的報道合成ASSVd的全長引物，ASSVd-full-F：5′-GACGAAGGCCGGTGAGAAAG-3′;ASSVd-full-R：5′-GACGACGACAGGTGAGTTCC-3′。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，利用DNA凝膠回收試劑盒進(jìn)行目的片段的回收純化，并與載體pMD 18-T連接，熱擊轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，篩選陽性克隆提取質(zhì)粒，送交青島擎科梓熙生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測序。

1.2.4 序列分析及系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建

將ASSVd全長序列通過NCBI數(shù)據(jù)庫（http：∥blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）中的BLAST進(jìn)行同源性比對，選擇具有代表性序列利用DNAMAN進(jìn)行多重比對分析。運用MEGA 5.1軟件的鄰接法（neighbor-joining，NJ），重復(fù)次數(shù)為1 000，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 ASSVd的RT-PCR檢測

以表現(xiàn)花臉癥狀‘舞美果實（圖1a）和其他樣品cDNA為模板，利用ASSVd檢測引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。圖1b結(jié)果顯示，顯癥‘舞美果實和發(fā)病樹體枝條中均可擴(kuò)增到約300 bp的特異性條帶，與ASSVd陽性對照樣品的目標(biāo)條帶大小一致; 無癥狀‘舞美果實和相應(yīng)樹體枝條及健康組培苗中均未擴(kuò)增到該條帶。將發(fā)病樹體芽組織嫁接于健康‘富士幼樹，2018年4月份進(jìn)行RT-PCR檢測，均可擴(kuò)增到上述特異性條帶（圖略），表明顯癥‘舞美蘋果確實被ASSVd侵染。

2.2 ASSVd序列測定與多重比對分析

利用全長ASSVd引物進(jìn)行擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物純化后克隆到pMD18-T載體，對6個單克隆進(jìn)行測序。結(jié)果表明，所得序列全長為331～333 bp，與GenBank中已報道的ASSVd基因組核苷酸序列一致性為92%～99%。所測序的6條ASSVd序列中，有4條序列完全一致，作為侵染‘舞美蘋果的主流序列提交GenBank（序列號MG745387），另外兩條序列缺少1～2個堿基。

將測序的主流序列（MG745387）與北京分離物（HQ840722.1）和山東分離物（MH013320）及標(biāo)準(zhǔn)ASSVd（NC_001340.1）序列進(jìn)行多重比對分析，結(jié)果（圖2）顯示，4個ASSVd序列一致性達(dá)96%，在蘋果銹果類病毒屬的末端保守區(qū)（TCR）及中央保守區(qū)（CCR）內(nèi)，僅北京分離物在第17個核苷酸位點有T-C突變。變異位點主要集中在第38位—第50位的左末端區(qū)（TLR）交界處，及第251位—第279位的致病區(qū)（P區(qū)）。侵染‘舞美的ASSVd序列在第49位、第253和254位，分別特異性插入T、A和G堿基。

2.3 ASSVd系統(tǒng)進(jìn)化樹分析

利用NCBI的BLASTn進(jìn)行同源性搜索，選取10個來自不同國家和地區(qū)的ASSVd序列，采用MEGA 5.1軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，1 000次循環(huán)計算系統(tǒng)發(fā)育樹中節(jié)點的自舉置信水平。由圖3可知，侵染‘舞美分離物ASSVd序列與新疆分離物（KC110860.1）聚在一個分支，說明其親緣關(guān)系較近，且與ASSVd標(biāo)準(zhǔn)菌株聚在一個大分支中。與北京分離物（HQ840722.1）和山東分離物（MH013320）聚在不同的分支，說明其親緣關(guān)系相對較遠(yuǎn)。

3 討論

近年來，蘋果銹果類病毒病在我國的發(fā)生率逐年提高，已成為蘋果產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展的限制性因子，引起了有關(guān)研究者的高度重視[1011， 1415]。課題組對山東蘋果產(chǎn)區(qū)病毒病發(fā)生情況進(jìn)行調(diào)查時發(fā)現(xiàn)，膠州新建幼樹園中的部分‘舞美果實表現(xiàn)出典型的花臉癥狀。本研究利用RT-PCR技術(shù)對‘舞美果實和枝條進(jìn)行了ASSVd檢測，研究發(fā)現(xiàn)，顯癥‘舞美果實和相應(yīng)發(fā)病樹體枝條中均可檢測到ASSVd，而未顯癥果實和相應(yīng)樹體枝條中沒有ASSVd特異性條帶，表明RT-PCR檢測結(jié)果與發(fā)病表型癥狀相一致。9月份將ASSVd檢測陽性的枝條，芽接于健康‘富士幼樹，第二年4月份，在嫩梢中可檢測到ASSVd，進(jìn)一步證實‘舞美受到ASSVd的侵染。這是首次在‘舞美蘋果上發(fā)現(xiàn)并檢測到ASSVd。

通過對‘舞美分離物進(jìn)行克隆和序列分析發(fā)現(xiàn)，其基因組主流序列由333個核苷酸組成，具有蘋果銹果類病毒屬中央保守結(jié)構(gòu)序列和末端保守區(qū)。該分離物序列與新疆分離物（KC110860.1）一致性最高達(dá)99%，而與北京分離物（HQ840722.1）和山東分離物（MH013320）一致性不足95%; 系統(tǒng)進(jìn)化樹分析結(jié)果顯示，‘舞美與新疆分離物（KC110860.1）聚在一個分支，說明其親緣關(guān)系較近，而與北京分離物（HQ840722.1）和山東分離物（MH013320）聚在不同的分支，表明其親緣關(guān)系相對較遠(yuǎn)。

芭蕾蘋果‘舞美具有重要的觀賞價值，且果實能夠深加工，近年來推廣種植面積不斷增加[12]。ASSVd侵染‘舞美后引起果實表面著色不均，產(chǎn)生明顯的花臉癥狀，嚴(yán)重降低了其觀賞性和經(jīng)濟(jì)價值，并且可能成為類病毒的傳播源頭，給其他栽培品種造成無法挽回的經(jīng)濟(jì)損失。課題組將進(jìn)一步調(diào)查ASSVd在山東及我國其他蘋果產(chǎn)區(qū)的發(fā)生情況，為及時采取措施有效控制蘋果銹果病的發(fā)生與危害提供科學(xué)依據(jù)。

參考文獻(xiàn)

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[3] 趙英，牛建新.蘋果銹果類病毒新疆分離物的克隆和序列分析[J].果樹學(xué)報，2006，23（6）：896898.