毛維興 李焰 張樹(shù)武 薛應(yīng)鈺 徐秉良

摘要 采用菌落生長(zhǎng)速率法、分生孢子玻片萌發(fā)法和離體枝條燙傷接種法測(cè)定了5種植物源藥劑對(duì)蘋(píng)果樹(shù)腐爛病室內(nèi)防治效果。結(jié)果表明，5種植物源藥劑對(duì)蘋(píng)果樹(shù)腐爛病菌菌落生長(zhǎng)和分生孢子萌發(fā)均具有顯著的抑制作用，當(dāng)0.3%丁子香酚SL、5%香芹酚AS、20%乙蒜素EC、0.5%小檗堿AS和1.3%苦參堿AS的有效成分濃度分別為3、50、100、50和14.44 μg/mL時(shí)，其對(duì)蘋(píng)果樹(shù)腐爛病菌菌落生長(zhǎng)的抑制率分別為98.63%、99.22%、99.22%、100%和79.29%，其EC50分別為0.43、8.78、11.21、13.68和8.11 μg/mL;對(duì)蘋(píng)果樹(shù)腐爛病菌分生孢子萌發(fā)的校正抑制率分別為97.92%、100%、95.83%、77.08%和96.88%，其EC50分別為0.70、8.56、20.39、28.23和8.04 μg/mL。離體枝條保護(hù)試驗(yàn)表明，20%乙蒜素EC有效成分濃度為100 μg/mL時(shí)對(duì)離體枝條保護(hù)作用最佳。本研究通過(guò)篩選明確了5種植物源藥劑中0.3%丁子香酚SL可作為抑制蘋(píng)果樹(shù)腐爛病菌菌絲生長(zhǎng)和分生孢子萌發(fā)的最佳藥劑，以及20%乙蒜素EC可作為離體枝條保護(hù)作用的最佳藥劑。

關(guān)鍵詞 蘋(píng)果樹(shù)腐爛病; 植物源農(nóng)藥; 抑菌活性; 防治效果

中圖分類(lèi)號(hào)： S 436

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼： B

DOI： 10.16688/j.zwbh.2018369

蘋(píng)果是享有“世界四大水果”之一美譽(yù)的世界性果品[1]。近20年來(lái)，中國(guó)蘋(píng)果產(chǎn)業(yè)發(fā)展迅速，2011年國(guó)內(nèi)蘋(píng)果栽種面積達(dá)到217.73萬(wàn) hm2，約占世界蘋(píng)果產(chǎn)業(yè)總面積的42%，總產(chǎn)達(dá)到3 598.5萬(wàn)t，約占世界總產(chǎn)量的54.21%，年產(chǎn)達(dá)到1 605.17億元，但年產(chǎn)量還處于世界低水平，蘋(píng)果樹(shù)腐爛病的大規(guī)模發(fā)生是限制蘋(píng)果產(chǎn)量的重要因素[2]。蘋(píng)果樹(shù)腐爛病主要危害樹(shù)體枝干、主枝、果實(shí)等部位，其發(fā)生嚴(yán)重時(shí)可導(dǎo)致果樹(shù)枝干殘缺、樹(shù)勢(shì)衰弱、產(chǎn)量下降，甚至出現(xiàn)毀園現(xiàn)象[3]。

當(dāng)前關(guān)于蘋(píng)果樹(shù)腐爛病的防治手段以使用化學(xué)農(nóng)藥為主[4]。福美胂是化學(xué)農(nóng)藥中最常用的一種藥劑，防治蘋(píng)果樹(shù)腐爛病效果較好，但長(zhǎng)期使用會(huì)使環(huán)境和果品被砷污染，且其具有中等毒性、強(qiáng)致敏性及強(qiáng)皮膚刺激性。據(jù)相關(guān)調(diào)查表明，超過(guò)30年的蘋(píng)果樹(shù)和樹(shù)盤(pán)土壤中砷的殘留量高出國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)30倍[5]。隨著化學(xué)農(nóng)藥引起的3R問(wèn)題漸漸被人們關(guān)注，近年來(lái)世界各國(guó)開(kāi)始出臺(tái)相應(yīng)的政策控制化學(xué)農(nóng)藥的使用。

植物源農(nóng)藥是來(lái)源于大自然的天然農(nóng)藥，不會(huì)造成藥害殘留，對(duì)人畜安全，是代替化學(xué)農(nóng)藥的首選生物農(nóng)藥之一[6]。目前，關(guān)于植物源農(nóng)藥作為殺菌劑的研究還較少[7]。據(jù)趙常安[8]研究表明，0.3%丁子香酚可溶液劑（SL）不僅對(duì)馬鈴薯晚疫病起到防治作用，而且具有一定的增產(chǎn)作用。目前有關(guān)植物源農(nóng)藥應(yīng)用于蘋(píng)果樹(shù)腐爛病防治的研究較少，尤其有關(guān)其作用機(jī)理方面尚未報(bào)道。

基于此，本研究選取了5種植物源農(nóng)藥，采用菌絲生長(zhǎng)速率法、離體枝條燙傷接種法和分生孢子萌發(fā)法測(cè)定了5種植物源藥劑對(duì)蘋(píng)果樹(shù)腐爛病菌菌落生長(zhǎng)的抑制作用和在離體枝條上的保護(hù)作用，以便進(jìn)一步為生產(chǎn)中防治蘋(píng)果樹(shù)腐爛病提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 供試菌株

蘋(píng)果樹(shù)腐爛病菌Valsa mail由甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院植物病原學(xué)實(shí)驗(yàn)室分離保存。

1.1.2 離體枝條

采集于甘肅省蘭州市西固區(qū)蘋(píng)果園‘新紅星健康枝條，樹(shù)齡為20年。

1.1.3 供試藥劑

20%乙蒜素乳油（EC），河南省南陽(yáng)臥龍農(nóng)藥廠;0.3%丁子香酚可溶液劑（SL），南通神雨綠色藥業(yè)有限公司;5%香芹酚水劑（AS），蘭州世創(chuàng)生物科技有限公司;1.3%苦參堿水劑（AS）， 恒源偉業(yè)生物科技有限公司;0.5%小檗堿水劑（AS），濰坊奧豐作物病害防治有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 含藥培養(yǎng)基的制備

將供試藥劑經(jīng)無(wú)菌水按半倍稀釋法[9]配制成如表1所示濃度的藥液，將不同濃度藥劑加入滅菌后冷卻至50℃的PDA培養(yǎng)基，充分振蕩混合均勻后倒入培養(yǎng)皿，以加無(wú)菌水的培養(yǎng)基作為空白對(duì)照，待培養(yǎng)基凝固后接種蘋(píng)果樹(shù)腐爛病病原菌，進(jìn)行預(yù)試驗(yàn)，篩選出較好的藥劑設(shè)定濃度進(jìn)行毒力測(cè)定（表2）。

1.2.2 不同植物源藥劑對(duì)蘋(píng)果樹(shù)腐爛病菌菌落生長(zhǎng)的抑制作用

用打孔器（d=5 mm）從培養(yǎng)7 d 的蘋(píng)果樹(shù)腐爛病菌菌落邊緣打取菌餅，接種到含藥和空白對(duì)照平板中央。以加無(wú)菌水的培養(yǎng)基作為空白對(duì)照，置于25℃恒溫培養(yǎng)箱黑暗培養(yǎng)5 d后采用十字交叉法測(cè)量菌落直徑，計(jì)算生長(zhǎng)抑制率。

生長(zhǎng)抑制率=[（對(duì)照菌落直徑-處理菌落直徑）/（對(duì)照菌落直徑-0.5）]×100%。

1.2.3 不同植物源藥劑對(duì)蘋(píng)果樹(shù)腐爛病菌孢子活性的影響

在超凈工作臺(tái)上，將5種農(nóng)藥稀釋成不同濃度，制成含藥培養(yǎng)基。待培養(yǎng)基冷卻后，滴入50 μL腐爛病菌孢子懸浮液，用無(wú)菌玻璃涂布器將孢子懸浮液涂抹均勻。每個(gè)處理設(shè)置3個(gè)重復(fù)，以加入等量無(wú)菌水的PDA為空白對(duì)照。將涂抹均勻的PDA培養(yǎng)基置于25℃黑暗條件下倒置培養(yǎng)24 h后切取1 cm2大小的正方形培養(yǎng)基放于載玻片上，在顯微鏡下觀察孢子的萌發(fā)狀況。每個(gè)重復(fù)選擇100個(gè)孢子檢查萌發(fā)率。計(jì)算孢子萌發(fā)率和抑制率。

孢子萌發(fā)率=（萌發(fā)的孢子數(shù)/孢子總數(shù)）×100%;

萌發(fā)抑制率=[（對(duì)照孢子萌發(fā)率-處理孢子萌發(fā)率）/對(duì)照孢子萌發(fā)率]×100%。

1.2.4 不同植物源藥劑對(duì)接種病原菌的離體枝條保護(hù)作用

參照翟慧者[10]和臧睿等[11]離體枝條接種方法，截取10 cm長(zhǎng)的離體枝條，先用自來(lái)水沖洗干凈，再用無(wú)菌水沖洗，接著用脫脂棉蘸取酒精對(duì)枝條表面進(jìn)行消毒，最后置于超凈工作臺(tái)晾干后燙傷，再次噴無(wú)菌水晾干，將已配制好的不同濃度藥劑涂抹于傷口，待晾干后接種培養(yǎng)5 d的蘋(píng)果樹(shù)腐爛病菌菌餅，以先涂抹無(wú)菌水后接種病原菌為對(duì)照。試驗(yàn)每個(gè)處理和對(duì)照接種3個(gè)枝條，每個(gè)枝條2個(gè)接種點(diǎn)，每處理共計(jì)6個(gè)接種點(diǎn)（即為6次重復(fù)）。保濕培養(yǎng)7～10 d后采用“十字交叉法”測(cè)量病疤長(zhǎng)度和短徑，并計(jì)算病疤面積。

病疤面積（cm2）=1/4×π×長(zhǎng)徑×短徑。

1.3 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)采用Excel 2007軟件計(jì)算平均值和標(biāo)準(zhǔn)誤，并采用SPSS 19.0軟件和Duncan氏新復(fù)極差法進(jìn)行方差分析（P<0.05）。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同植物源藥劑對(duì)蘋(píng)果樹(shù)腐爛病菌菌絲生長(zhǎng)的抑制作用

通過(guò)含藥培養(yǎng)基法測(cè)定植物源農(nóng)藥對(duì)蘋(píng)果樹(shù)腐爛病菌菌絲生長(zhǎng)的影響，試驗(yàn)結(jié)果表明，5種植物源農(nóng)藥對(duì)蘋(píng)果樹(shù)腐爛病菌菌絲生長(zhǎng)均具有一定的抑制作用。通過(guò)菌絲生長(zhǎng)抑制率計(jì)算5種藥劑EC50，得出0.3%丁子香酚SL EC50 最低，僅為0.43 μg/mL;而0.5%小檗堿AS EC50最高，為13.68 μg/mL。因此，0.3%丁子香酚SL對(duì)蘋(píng)果樹(shù)腐爛病菌菌絲生長(zhǎng)抑制作用最為顯著（表3）。

2.2 不同植物源藥劑對(duì)蘋(píng)果樹(shù)腐爛病菌分生孢子萌發(fā)的抑制作用

不同植物源藥劑對(duì)蘋(píng)果樹(shù)腐爛病菌分生孢子萌發(fā)均有一定的抑制效果，通過(guò)不同藥劑EC50得出： 丁子香酚對(duì)蘋(píng)果樹(shù)腐爛病菌分生孢子萌發(fā)的抑制作用最強(qiáng)，EC50為0. 70 μg/mL;苦參堿和香芹酚次之，EC50分別為8.04 μg/mL、8.56 μg/mL;乙蒜素的抑制作用較差，EC50為20.39 μg/mL;小檗堿對(duì)蘋(píng)果樹(shù)腐爛病菌分生孢子萌發(fā)的抑制作用最差，EC50為28.23 μg/mL（表4）。

2.3 不同植物源藥劑對(duì)接種病原菌的離體枝條保護(hù)作用

結(jié)果表明，供試的5種植物源藥劑對(duì)接種蘋(píng)果樹(shù)腐爛病菌的離體枝條均有不同的保護(hù)效果。20%乙蒜素EC對(duì)接種病原菌的離體枝條的保護(hù)作用顯著高于其他藥劑，病疤面積最小，為160.21 mm2，與對(duì)照相比差異顯著;5%香芹酚AS、0.3%丁子香酚SL和1.3%苦參堿AS次之，病疤面積分別為236.03、266.42和484.95 mm2;0.5%小檗堿AS在接菌后對(duì)離體枝條的保護(hù)作用最弱，病疤面積最大，為597.09 mm2，而對(duì)照的病疤面積為1 309.64 mm2（圖1和表5）。

3 結(jié)論與討論

3.1 植物源農(nóng)藥對(duì)蘋(píng)果樹(shù)腐爛病菌菌落及孢子萌發(fā)的影響

本試驗(yàn)供試的5種植物源農(nóng)藥對(duì)蘋(píng)果樹(shù)腐爛病菌的菌落生長(zhǎng)和孢子萌發(fā)均有一定的抑制作用。隨著不同藥劑濃度的增加，其抑制效果顯著增強(qiáng)，其中0.3%丁子香酚SL對(duì)蘋(píng)果樹(shù)腐爛病菌菌落生長(zhǎng)和孢子萌發(fā)的抑制率最高，其EC50分別為0.43 μg/mL和0.70 μg/mL;其次為1.3%苦參堿AS，抑制菌落生長(zhǎng)和孢子萌發(fā)的EC50分別為8.11 μg/mL和8.04 μg/mL。楊勇等[12]的研究發(fā)現(xiàn)20%丁子香酚AS對(duì)葡萄灰霉病有較好的抑菌效果，濃度為50 μg/mL時(shí)抑制率達(dá)到93.47%，且與另一植物源農(nóng)藥5%苦參堿混配后，對(duì)葡萄灰霉病菌的抑菌活性顯著增強(qiáng)。同時(shí)，安永學(xué)等[13]的研究表明5%的香芹酚AS 500倍液對(duì)辣椒白粉病的防效可達(dá)89.93%，且可使辣椒增產(chǎn)18.08%;郭成瑾等[14]的研究表明在大田試驗(yàn)中使用0.3%丁子香酚SL防治馬鈴薯晚疫病，在發(fā)病初期噴施2～3次，防病效果可達(dá)72.17%。本試驗(yàn)表明，丁子香酚對(duì)蘋(píng)果樹(shù)腐爛病具有較好的防治效果。

3.2 植物源農(nóng)藥對(duì)蘋(píng)果離體枝條的保護(hù)作用

離體枝條試驗(yàn)結(jié)果表明20%乙蒜素EC對(duì)蘋(píng)果離體枝條的保護(hù)作用最強(qiáng)，接種蘋(píng)果樹(shù)腐爛病菌7 d后，病疤面積最小，為160.21 mm2。據(jù)報(bào)道，葉面噴施乙蒜素不僅能夠促進(jìn)作物生長(zhǎng)，還對(duì)作物的枯萎病和蔓枯病具有較好的防效[15]。楊淑貞等[16]的研究表明，80%乙蒜素EC可用于防治山核桃干腐病，乙蒜素可以抑制山核桃干腐病病原菌菌絲生長(zhǎng)，同時(shí)對(duì)山核桃木質(zhì)部具有良好的保護(hù)作用，本試驗(yàn)結(jié)果與前人研究結(jié)果基本一致。

利用植物源制劑防治植物病害是目前植物病害生物防治的一個(gè)新領(lǐng)域，是實(shí)現(xiàn)農(nóng)藥無(wú)毒、無(wú)殘留、無(wú)污染的一個(gè)有效途徑，也是實(shí)現(xiàn)農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的一個(gè)重要環(huán)節(jié)。本研究經(jīng)過(guò)室內(nèi)試驗(yàn)表明，0.3%丁子香酚SL為供試5種藥劑中抑制蘋(píng)果樹(shù)腐爛病菌菌絲生長(zhǎng)和分生孢子萌發(fā)的最佳藥劑，20%乙蒜素EC為離體枝條保護(hù)作用的最佳藥劑，但是其在實(shí)際生產(chǎn)中對(duì)蘋(píng)果樹(shù)腐爛病的防治作用還有待大田試驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。

參考文獻(xiàn)

[1] 侯寶宏，徐秉良，郇町，等.抗蘋(píng)果樹(shù)腐爛病解淀粉芽孢桿菌TS-1203的抑菌活性物質(zhì)穩(wěn)定性及抑菌譜測(cè)定[J].甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2017，52（1）：8086.

[2] 李向東，李國(guó)梁.甘肅省蘋(píng)果產(chǎn)業(yè)發(fā)展現(xiàn)狀與建議[J].中國(guó)果樹(shù)，2017（1）：9195.

[3] 曹克強(qiáng)，國(guó)立耘，李保華，等.中國(guó)蘋(píng)果樹(shù)腐爛病發(fā)生和防治情況調(diào)查[J].植物保護(hù)，2009，35（2）：114117.

[4] 薛應(yīng)鈺，范萬(wàn)澤，張樹(shù)武，等.蘋(píng)果樹(shù)腐爛病菌拮抗放線菌的篩選、鑒定及防效[J].應(yīng)用生態(tài)學(xué)報(bào)，2016，27（10）：33793386.

[5] 趙政陽(yáng)，張翠花，梁俊，等.施用農(nóng)藥福美胂對(duì)蘋(píng)果果園砷污染的研究[J].園藝學(xué)報(bào)，2007（5）：11171122.

[6] 馮俊濤，石勇強(qiáng)，張興.56種植物抑菌活性篩選試驗(yàn)[J].西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2001（2）：6568.

[7] 閻世江，張繼寧，劉潔.我國(guó)植物源農(nóng)藥的應(yīng)用現(xiàn)狀及前景展望[J].農(nóng)藥市場(chǎng)息，2016（10）：69.

[8] 趙常安.植物源農(nóng)藥丁子香酚對(duì)馬鈴薯晚疫病的防治效果[C]∥中國(guó)作物學(xué)會(huì)馬鈴薯專(zhuān)業(yè)委員會(huì).馬鈴薯產(chǎn)業(yè)與現(xiàn)代可持續(xù)農(nóng)業(yè).哈爾濱：哈爾濱地圖出版社，2015.

[9] 姜玉娟.蘋(píng)果樹(shù)腐爛病防治的研究進(jìn)展[C]∥成卓敏.糧食安全與植?？萍紕?chuàng)新.北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)技術(shù)出版社，2009.

[10]翟慧者.防治蘋(píng)果樹(shù)腐爛病藥劑的篩選及評(píng)價(jià)研究[D].保定：河北農(nóng)業(yè)大學(xué)，2011.

[11]臧睿，黃麗麗，康振生，等.陜西蘋(píng)果樹(shù)腐爛病菌（Cytospora spp.）不同分離株的生物學(xué)特性與致病性研究[J].植物病理學(xué)報(bào)，2007，37（4）：343351.

[12]楊勇，王建華，吉沐祥，等.植物源農(nóng)藥丁子香酚與苦參堿及其混配對(duì)葡萄灰霉病的毒力測(cè)定及田間防效[J].江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2016，44（12）：160163.

[13]安永學(xué)，董芳.5%香芹酚對(duì)辣椒白粉病的防治效果[J].蘭州交通大學(xué)學(xué)報(bào)，2016，35（4）：162164.

[14]郭成瑾，張麗榮，沈瑞清，等.防治馬鈴薯晚疫病藥劑篩選試驗(yàn)[J].農(nóng)藥，2012，51（2）：151152.

[15]張博，馬立國(guó)，張悅麗，等.幾種生物制劑對(duì)致病疫霉的毒力測(cè)定[J].農(nóng)藥，2017，56（2）：138140.

[16]楊淑貞，丁立忠，樓君芳，等.山核桃干腐病發(fā)生發(fā)展規(guī)律及防治技術(shù)[J].浙江林學(xué)院學(xué)報(bào)，2009，26（2）：228232.

（責(zé)任編輯：楊明麗）