《中國心血管報告2018》指出，在我國心血管死亡率居首位，高于腫瘤等其他疾病，占我國居民疾病死亡構成的40%以上，據(jù)此推算，目前我國冠心病病人近1 100萬人[1]，造成了嚴重的醫(yī)療負擔和經(jīng)濟負擔[2]。冠心丹參滴丸由三七、丹參、降香油組成，其主要化學成分包括三七皂苷R1[3-4]、人參皂苷 Rg1[5]、人參皂苷 Rb1[6]、丹參酮ⅡA[7-8]、丹酚酸B[9]、隱丹參酮、丹酚酸Ⅰ[10-11]等。本實驗擬通過觀察缺血心肌的線粒體內(nèi)膜解偶聯(lián)蛋白2(uncoupling protein 2，UCP2)及其通路的改變以評價冠心丹參滴丸對缺血心肌UCP2的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物 3月齡普通級巴馬豬，雌雄不拘，體重18～23kg，由天津市百農(nóng)生物繁育科技有限公司提供。

1.1.2 實驗儀器和藥品 Ameroid縮窄環(huán)(美國Research Instrument SW)， 超聲儀(荷蘭 Philips EPIQ 7)， 高效液相色譜儀(美國 Waters e2695-2489)， 光學顯微鏡(日本 OLYMPUS BX43)， 透射電子顯微鏡(日本 HITACHIH-7650)， 電泳儀(美國 Bio-Rad)， 熒光定量PCR儀(美國 Applied BiosystemsABI7500)，AMPK抗體(美國 santacruz sc-25792)， pAMPK抗體(美國 CST 2535)， 冠心丹參滴丸(黑龍江中發(fā)實業(yè)集團)， 鹽酸曲美他嗪片(天津施維雅制藥)， UCP2抗體(美國santacruz sc-6525)。

1.2 實驗方法

1.2.1 缺血心肌模型豬的建立 動物禁食8 h后，地西泮0.5 mg/kg肌內(nèi)注射，丙泊酚2 mg/kg肌內(nèi)注射，心電監(jiān)護，異氟烷1%～3%吸入維持麻醉。消毒術野，開胸，游離前降支近段，第一對角支下1 cm，置入2.5 mm Ameroid縮窄環(huán)。假手術組給予開胸但不置入縮窄環(huán)。術后給予青霉素320 U 靜脈輸注，心電監(jiān)護至蘇醒，回籠，常規(guī)飼料飼養(yǎng)4周。

1.2.2 動物分組及給藥方案 4周后成活16只，其中假手術組4只，其余12只根據(jù)簡單隨機法分為模型組；冠心丹參滴丸(GXDS) 組和曲美他嗪(TMZ) 組，每組4只。模型組和假手術組給予正常飲食；TMZ組在正常飲食基礎上加鹽酸曲美他嗪40 mg/d；GXDS組在正常飲食基礎上加冠心丹參滴丸800 mg/d。給藥周期共6周。

1.2.3 心功能檢測 給藥后，麻醉方法同上，在靜息狀態(tài)下通過超聲心動圖測定各組的心臟功能指標：左室舒張末期容積(LVEDV)、左室收縮末期容積(LVESV)、射血分數(shù)(EF)、短軸縮短率(FS)、左室收縮末期內(nèi)徑(LVIDs)、左室舒張末期內(nèi)徑(LVIDd)、室壁增厚率(WT)。

1.2.4 取材 10%氯化鉀15 mL耳靜脈注射處死動物，開胸取心臟，生理鹽水沖洗干凈，取病變心肌。將1 mm3標本固定在2.5%的戊二醛中，以備透射電子顯微鏡下觀察，10%的中性甲醛中固定，蘇木精-伊紅(HE)染色。

1.2.5 三磷酸腺苷(ATP)、二磷酸腺苷(ADP)、一磷酸腺苷(AMP)含量測定 動物處死后，立刻應用線粒體分離試劑盒進行線粒體分離。ATP、ADP、AMP的含量通過高效液相色譜法(HPLC)測定。磷酸腺苷總量(TAN) 和能荷(EC) 的計算公式如下：TAN=ATP+ADP+AMP；EC=(ATP+1/2ADP)/TAN[12]。

1.2.6 AMP活化蛋白激酶(AMPK)、pAMPK、UCP2表達水平 預冷RIPA蛋白抽提試劑，1∶9比例加入裂解液，勻漿3次，4 ℃，13 000 r/min離心20 min，取上清。BCA法測定蛋白濃度，每孔上樣20 μg，濃縮膠恒壓90 V，約20 min；分離膠恒壓160 V，濕轉法轉膜后，將膜完全浸沒于3%BSA-TBST中，室溫輕搖30 min，一抗孵育，用3%BSA-TBST稀釋一抗，室溫孵育10 min，4 ℃過夜。AMPK稀釋比例1∶200，UCP2稀釋比例1∶200，次日二抗孵育，加入ECL反應，曝光。

1.2.7 AMPK和UCP2 mRNA 表達水平檢測 引物在北京Invitrogen公司合成。 AMPK上游引物：CAACAAGCCCACCTGATTCTTTTCT，AMPK下游引物：ATGCCATTTTGCTTTCCTTACACCT；UCP2上游引物：TCACCCAATGTCGCTCGTA，UCP2下游引物：GGCAGGGAAGGTCATCTGT；GAPDH上游引物：GGCTACACTGAGGACCAGGTTG，GAPDH下游引物：CCAGGAAATGAGCTTGACGAA。研磨組織，提取總RNA，進行質量檢測。采用PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser進行cDNA反轉錄。Realtime PCR反應體系配置如下：2 × Master Mix10 μL，10 μmmoL 的PCR特異引物F 0.5 μL，10 μmmoL 的PCR特異引物R 0.5 μL，加水至總體積為18 μL。將混合液加到96-PCR板對應的每個孔中，再加入對應的2 μL cDNA，按以下程序進行：95 ℃，30 s；40個PCR循環(huán)(95 ℃，5 s；60 ℃，40 s)。為了建立PCR產(chǎn)物的熔解曲線，擴增反應結束后，按 (95 ℃，10 s；60 ℃，60 s；95 ℃，15 s)，并從60 ℃緩慢加熱到99 ℃。

2 結 果

2.1 一般情況 術后可見接受Ameroid 縮窄環(huán)的動物活動減少，毛發(fā)粗糙雜亂，飲食差，搖尾次數(shù)減少，叫聲低，掙扎力度減弱。

2.2 心臟功能檢測 與假手術組比較，模型組EF和FS降低，差異有統(tǒng)計學意義，與模型組相比，TMZ組EF升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，GXDS組EF較模型組升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，TMZ組與GXDS組比較EF差異無統(tǒng)計學意義。假手術組與模型組比較，WT差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，假手術組與TMZ組、GXDS組比較差異無統(tǒng)計學意義，與模型組相比，TMZ組和GXDS組WT升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。詳見表1。

表1 各組用藥干預后超聲心動圖功能指標比較(±s)

與假手術組比較，1)P<0.05；與模型組比較，2)P<0.05

2.3 電鏡觀察 從心肌線粒體電鏡圖可以看出，假手術組心肌內(nèi)肌纖維排列緊密，線粒體形態(tài)正常，可見完整的、排列緊密的嵴；模型組心肌肌纖維排列紊亂、減少，可見非特異性細胞質，線粒體可見水腫，嵴稀疏；TMZ組和GXDS組心肌結構改變較模型組輕，可見少量非特異性細胞質，肌纖維排列尚規(guī)律，線粒體水腫較模型組輕，線粒體嵴稍有稀疏紊亂，未見明顯斷裂。詳見圖1。

a為假手術組；b為模型組；c為TMZ組；d為GXDS組圖1 各組心肌線粒體電鏡圖

2.4 HE染色 心肌組織的HE染色可見，假手術組心肌細胞著色均勻，排列有序；模型組心肌可見心肌纖維數(shù)量減少，扭曲、排列不規(guī)則伴有炎性細胞浸潤，但未見明顯壞死灶；TMZ組和GXDS組可見輕度著色不均，心肌細胞排列、形態(tài)尚正常，少見炎性細胞。詳見圖2。

a為假手術組；b為模型組；c為TMZ組；d為GXDS組圖2 各組心肌組織切片HE染色(×200)

2.5 ATP、ADP、AMP含量 HPLC法測定各組的高能磷酸化合物水平，模型組與假手術組ATP、ADP、TAN、EC水平比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，AMP水平差異無統(tǒng)計學意義；GXDS組與TMZ組在ATP水平上較模型組高，ADP水平較模型組降低，AMP、TAN水平差異無統(tǒng)計學意義，而EC水平較模型組增高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；GXDS組ATP和EC水平雖較TMZ組高，但是差異無統(tǒng)計學意義。詳見表2。

表2 各組心肌能量參數(shù)和能量參數(shù)水平(±s)

與假手術組比較，1)P<0.05；與模型組比較，2)P<0.05

2.6 AMPK、pAMPK、UCP2蛋白表達水平 與假手術組相比，模型組AMPK蛋白表達水平明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義，TMZ組和GXDS組AMPK水平較假手術組升高，差異無統(tǒng)計學意義，但較模型組降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。各組pAMPK水平差異有統(tǒng)計學意義，模型組pAMPK較假手術組明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，而TMZ組和GXDS組pAMPK水平明顯低于模型組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。模型組pAMPK/AMPK較其余3組明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義。4組UCP2差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，模型組UCP2高于假手術組、GXDS組、TMZ組。詳見圖3。

與假手術組比較，*P0.05；與模型組比較，#P0.05圖3 AMPK、pAMPK、UCP2的蛋白表達水平

2.7 AMPK、UCP2 mRNA水平表達 與假手術組相比較，模型組AMPK和UCP2的基因表達水平升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。TMZ組和GXDS組干預后，AMPK和UCP2基因水平較模型組降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。詳見圖4。

3 討 論

本實驗通過在豬的前降支置入Ameroid縮窄環(huán)，建立豬的慢性心肌缺血模型，觀察其心肌收縮功能障礙、細胞能量儲備以及線粒體內(nèi)膜UCP2的關系。本研究結果顯示，缺血導致心肌的收縮功能障礙，模型組的EF、FS、WT均較假手術組降低，GXDS組和TMZ組的EF、WT較模型組增高，模型組心肌的ATP水平降低，AMP未見明顯降低，從而導致AMP/ATP升高，EC和TAN降低。GXDS組和TMZ組ATP、EC較模型組增高，差異有統(tǒng)計學意義。模型組AMPK和UCP2的蛋白表達水平和mRNA水平均升高，AMPK的磷酸化程度增高，GXDS和TMZ可以改善缺血引起的UCP2、AMPK和pAMPK增高。

與假手術組比較，*P0.05；與模型組比較，#P0.05圖4 心肌AMPK、UCP2 mRNA表達水平

線粒體與細胞的能量生成和調節(jié)氧化應激損傷有關[13-14]，線粒體使用細胞攝取的氧氣進行氧化磷酸化，電子沿著電子傳遞鏈移動，最終與氧氣結合[15-17]，這一過程伴隨著質子由線粒體基質向線粒體膜間隙移動，使線粒體膜間隙的電位高于線粒體基質，這種質子梯度驅使質子通過ATP合成酶轉移回線粒體基質，這時將ADP磷酸化為ATP[18-19]。UCP2是一種線粒體內(nèi)膜蛋白，介導跨線粒體內(nèi)膜的質子流，又叫作“質子漏”，UCP2使通過線粒體呼吸鏈復合物進入線粒體膜間隙的質子直接進入線粒體基質，而不通過ATP合成酶，使氧化磷酸化解偶聯(lián)[20]，減少ATP的生成。其上游AMPK是細胞能量代謝的總開關[21]，缺血心肌中AMP/ATP比值的升高導致AMPK的激活[22]，進一步激活UCP2。這一系列的變化導致缺血心肌的高能磷酸化合物減少，能量儲備降低，導致心肌收縮功能的障礙，表現(xiàn)為EF和WT等參數(shù)的降低。

本研究結果顯示，冠心丹參滴丸可以改善處于缺血狀態(tài)心臟的心功能，提高射血分數(shù)和室壁增厚率，其結果符合其他以人類為研究對象的臨床研究結論[23]，其機制可能是冠心丹參滴丸可以增加心肌的高能磷酸化合物的含量，提高能荷，降低導致質子漏的UCP2和其上游AMPK的基因水平和蛋白表達，減少AMPK的磷酸化。