朱華，郭亞茜，杜曉鵬，李卓，秦川

(衛(wèi)健委人類疾病比較醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院比較醫(yī)學(xué)中心，北京 100021)

阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)是一種以記憶喪失和認(rèn)知減退為主要臨床癥狀的大腦神經(jīng)退行性疾病。特征性的病理學(xué)表現(xiàn)有：β 淀粉樣肽(β amyloid peptides，Aβ)沉積形成的老年斑和tau 蛋白過度磷酸化形成的神經(jīng)原纖維纏結(jié)[1-2]。目前有關(guān)AD的病因仍然不明確且臨床上無有效的防治措施。隨著對(duì)腦-腸-微生物菌群(brain-gut-microbiota axis，BGM)概念的提出，腸道菌群對(duì)AD的調(diào)控作用越來越受到關(guān)注[3]，但目前缺乏菌群與特定基因關(guān)系研究的動(dòng)物模型。APPswe/PS1ΔE9(PAP)雙轉(zhuǎn)基因阿爾茨海默病小鼠模型由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所比較醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建培育。該模型以 C57BL/6J小鼠為背景，含有人APPswedish 突變位點(diǎn)和人PS1ΔE9突變位點(diǎn)。其在3月齡出現(xiàn)學(xué)習(xí)和記憶缺陷，4.5月齡開始出現(xiàn)老年斑，12月齡出現(xiàn)大量老年斑，具有和 AD 患者相似的病理表型。是目前常用的AD動(dòng)物模型[4]。本研究采用剖宮產(chǎn)技術(shù)對(duì)PAP小鼠進(jìn)行無菌化，并對(duì)其病理表型進(jìn)行初步觀察，為研究腸道菌群與AD間關(guān)系提供一種新的動(dòng)物模型。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

用于繁殖的PAP陽性雄鼠和野生型C57BL/6J雌鼠購自北京華阜康生物科技股份有限公司【SCXK(京)2014-0004】。體重(20 ± 2)g，無菌帶乳ICR母鼠由本實(shí)驗(yàn)室繁育。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)在中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所隔離設(shè)施內(nèi)進(jìn)行【SYXK-(京)2018-0004】。本實(shí)驗(yàn)中動(dòng)物的使用已獲得中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用與管理委員會(huì)(IACUC)批準(zhǔn)，批準(zhǔn)號(hào)：ZH17003。

1.1.2 試劑與儀器

RIPA 裂解液購自江蘇碧云天公司；十二烷基硫酸鈉(SDS)、過硫酸胺(APS)、Tris-HCl、甘氨酸、 TEMED、 Tween-20 購自美國Sigma 公司；N,N’-亞甲基雙丙烯酰胺和丙烯酰胺購自美國Bio-Rad 公司；磷酸酶抑制劑購自美國 Thermo 公司；GAPDH、超敏二步法免疫組化檢測試劑盒及含有 DAPI的水溶性封片劑均購自北京中杉金橋公司。使用的主要儀器有：ZHJH-C1118C型超凈臺(tái)、凝膠成像系統(tǒng)(上海天能公司)、組織脫水機(jī)、石蠟包埋機(jī)、石蠟切片機(jī)(德國Leica)、IQ5PCR儀(美國Bio-Rad 公司)。

1.2 方法

1.2.1 孕鼠的準(zhǔn)備

選擇10～16周齡經(jīng)檢測為陽性的健康PAP雄性雜合子鼠10只，與經(jīng)產(chǎn)的10～16周齡C57BL/6J雌鼠野生型小鼠1∶2進(jìn)行交配，記錄交配日期。隔離器內(nèi)無菌代乳鼠提前48 h交配。每日上下午檢查一次母鼠陰道口是否有陰栓。見有陰栓作為0天，開始計(jì)算孕期。已確診受孕的母鼠與雄鼠分開單獨(dú)飼養(yǎng)。

1.2.2 剖宮產(chǎn)凈化

小鼠受孕17 d開始密切觀察動(dòng)物，當(dāng)受孕小鼠食欲突然下降，煩躁不安，有作窩行為，經(jīng)觸診其趾骨已打開5 mm左右，外陰潮紅并處于開口狀態(tài)，此時(shí)受孕小鼠已臨產(chǎn)，可進(jìn)行子宮摘除術(shù)。剖宮產(chǎn)手術(shù)在36～38℃環(huán)境中進(jìn)行：犧牲母鼠，快速分離子宮，連同止血鉗一起迅速轉(zhuǎn)入裝有2%過氧乙酸的渡槽，停留30 s，傳入隔離器內(nèi)。傳入隔離器內(nèi)的子宮用5% NaHCO3溶液中和子宮表面殘留的過氧乙酸后攤在紗布上，用帶齒鑷子將子宮及羊膜撕破，取出胎仔。迅速擦去胎仔鼻和口部的羊膜及羊水。健康的仔鼠開始張口呼吸，沒有呼吸的要輕輕觸壓胸部促其呼吸，必要時(shí)用鑷子輕夾尾根，使其發(fā)出叫聲，引發(fā)呼吸。開始呼吸的仔鼠將由紫紅色漸漸變?yōu)轷r紅色。

將呼吸正常的剖宮產(chǎn)仔鼠，放入代乳母鼠的原盒內(nèi)。用代乳母鼠親仔的糞便連同墊料涂抹代乳仔鼠，使失去原氣味。此時(shí)留一部分親仔共同哺乳，待母鼠接受代乳后，可除去親仔。代乳仔鼠20～25 d離乳。

1.2.3 無菌狀態(tài)維持及檢測

離乳的小鼠轉(zhuǎn)移至其他隔離器飼養(yǎng)。每個(gè)月取隔離器內(nèi)飼料、墊料、飲水、小鼠糞便送衛(wèi)健委實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量檢測中心進(jìn)行無菌狀態(tài)檢測并出具正式報(bào)告。

1.2.4 轉(zhuǎn)基因陽性動(dòng)物的鑒定

子代小鼠出生9～14 d內(nèi)剪趾法標(biāo)記，收集剪下的組織按照文獻(xiàn)[4]的方法進(jìn)行基因型鑒定。

1.2.5 腦內(nèi)斑塊染色

小鼠脫頸椎處死后取左半腦固定于福爾馬林溶液中24 h、梯度乙醇脫水、二甲苯透明、浸蠟、石蠟包埋，制作厚度為5 μm橫斷面石蠟切片，隔3取1。切片貼到經(jīng)多聚賴氨酸處理過的玻片上，按照文獻(xiàn)[4]的方法對(duì)9月齡無菌PAP轉(zhuǎn)基因陽性小鼠及同月齡SPF級(jí)小鼠海馬和皮層內(nèi)斑塊進(jìn)行免疫組化染色，觀察斑塊數(shù)量變化。切片光鏡下觀察后用 Aperio 切片掃描系統(tǒng)對(duì)切片進(jìn)行掃描，隨機(jī)截取5個(gè)高倍視野(400×)，采用 Image-Pro PLUS 圖像分析系統(tǒng)對(duì)陽性細(xì)胞數(shù)和光密度值(IOD)進(jìn)行分析。每只動(dòng)物計(jì)數(shù)3張切片，取平均值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 剖宮產(chǎn)手術(shù)及代乳情況

用來交配的 20只母鼠中，13只觀察到有陰栓，其中一例母鼠在18.5 d自然分娩，其余12例實(shí)施剖宮產(chǎn)手術(shù)，剖得仔鼠66只(表1)。其中有3只為死胎ICR無菌母鼠不予代乳，其余63只用母鼠成功代乳至離乳。到離乳時(shí)存活60只，剖宮產(chǎn)存活率和例如存活率分別為95.45%和95.24%。

表 1 PAP 小鼠剖腹宮手術(shù)及代乳情況Table 1 Caesarean section and fostering results of the PAP mice

2.2 轉(zhuǎn)基因陽性動(dòng)物的鑒定

部分無菌PAP小鼠基因鑒定結(jié)果見圖1，攜帶APPswe/PS1 基因的陽性鼠可見清晰 PCR 擴(kuò)增條帶，與目的片段大小相符，陰性鼠無條帶(圖1)。剖出的陽性鼠在9月齡、12月齡安樂時(shí)可見盲腸巨大，符合無菌動(dòng)物的生物學(xué)特性(圖2)。

2.3 無菌狀態(tài)維持及檢測

按照GB/T14926.41、43-2001，GB14922.2-2011進(jìn)行無菌狀態(tài)檢測。檢測結(jié)果合格(圖3)。

2.4 腦內(nèi)斑塊檢測

9月齡無菌化PAP小鼠(圖4A)及SPF級(jí)(圖4B)腦內(nèi)斑塊含量免疫組化結(jié)果。無菌PAP小鼠海馬內(nèi)斑塊減少，皮層內(nèi)斑塊數(shù)量未見顯著性差異(表2)。

圖1 部分PAP小鼠PCR鑒定凝膠電泳圖Figure 1 PCR identification of a part of PAP mice by gel electrophoresis

圖2 無菌PAP小鼠的盲腸Figure 2 Cecum of the germ-free PAP mice

圖3 PAP小鼠剖宮產(chǎn)凈化后無菌檢測結(jié)果Figure 3 Pathogen test results after caesarian section in the PAP mice

組別Groups海馬Hippocampus皮層Cortex陽性細(xì)胞數(shù)Number of positive cells光密度值IOD陽性細(xì)胞數(shù)Number of positive cells光密度值IOD無菌PAP小鼠Germ-free PAP mice11.32 ± 3.73*1987.64 ± 79.62*8.57 ± 2.881431.62 ± 132.113SPF級(jí)PAP小鼠SPF PAP mice17.46 ± 3.782864.37 ± 198.459.24 ± 2.621716.71 ± 159.71

注：與SPF級(jí)PAP小鼠相比，*P< 0.05。

Note. Compared with the SPF PAP mice，*P< 0.05.

圖4 PAP小鼠腦內(nèi)斑塊檢測結(jié)果Figure 4 IHC staining of senile plaques in brain tissues of the PAP mice

3 討論

無菌動(dòng)物是指通過無菌剖宮產(chǎn)手術(shù)或無菌胚胎移植進(jìn)行無菌化獲得的動(dòng)物，利用無菌飼養(yǎng)方法維持于無菌隔離器，利用現(xiàn)有方法檢測不到活的微生物和寄生蟲的動(dòng)物[5]。作為微生物背景最清晰的動(dòng)物，可對(duì)菌群、基因及飲食等環(huán)境因素進(jìn)行有效控制，是研究腸道菌群(gut microbiota，GM)對(duì)人類疾病及健康影響的最有效動(dòng)物模型之一[6-7]。遺傳工程動(dòng)物是研究是研究特定基因功能的重要工具，將無菌動(dòng)物技術(shù)與遺傳工程動(dòng)物結(jié)合建立無菌化小鼠人類疾病動(dòng)物模型，可揭示某種特定基因引起的表型變化與腸道菌群之間的關(guān)系，為研究腸道菌群與疾病關(guān)系提供了更多的模型選擇。

無菌動(dòng)物有自己的生物學(xué)特點(diǎn)：發(fā)育和體重增長緩慢，每窩產(chǎn)仔數(shù)減少[8]。PAP雙轉(zhuǎn)小鼠作為基因工程動(dòng)物，由于基因組經(jīng)過人工改造，繁殖力和免疫力都受到影響。因此與其他常規(guī)品系小鼠剖腹凈化及動(dòng)物相比，剖宮產(chǎn)及動(dòng)物繁育過程中有更多需要注意的操作細(xì)節(jié)：①微生物質(zhì)量控制：剖宮產(chǎn)凈化的一個(gè)缺點(diǎn)是不能去除可通過胎盤垂直傳播的病原體，因此在選擇用來交配的轉(zhuǎn)基因和野生型小鼠時(shí)就要進(jìn)行嚴(yán)格的微生物質(zhì)量控制：選用符合SPF級(jí)動(dòng)物標(biāo)準(zhǔn)的PAP雄鼠和野生型雌鼠；孕鼠的交配在SPF級(jí)設(shè)施內(nèi)進(jìn)行；盡量避免由動(dòng)物本身帶來的污染。②嚴(yán)格無菌操作：剖宮產(chǎn)手術(shù)在超凈臺(tái)內(nèi)完成，手術(shù)中嚴(yán)格執(zhí)行無菌操作：超凈臺(tái)除紫外燈照射消毒外，還要用酒精擦拭臺(tái)面。高壓滅菌的手術(shù)器械在超凈臺(tái)內(nèi)才能打開，保證每只孕鼠一套手術(shù)器械，連續(xù)手術(shù)時(shí)兩個(gè)手術(shù)之間也要對(duì)臺(tái)面進(jìn)行消毒。因超凈臺(tái)內(nèi)有氣流，剖宮產(chǎn)手術(shù)在電熱毯上進(jìn)行以保證適宜溫度。③剖宮產(chǎn)時(shí)機(jī)的選擇：經(jīng)產(chǎn)鼠的孕期較初產(chǎn)鼠的準(zhǔn)確，但仍不宜以見栓后天數(shù)為主要剖宮產(chǎn)指征，必需結(jié)合動(dòng)物的表現(xiàn)進(jìn)行判斷。實(shí)施剖宮產(chǎn)手術(shù)12只動(dòng)物的孕期從17.5 d到21 d不等，差異很大。我們的經(jīng)驗(yàn)是在17 d左右開始仔細(xì)觀察動(dòng)物，當(dāng)受孕小鼠食欲突然下降，煩躁不安，有作窩行為，外陰潮紅并處于開口狀態(tài)，結(jié)合觸診經(jīng)判斷趾骨已打開5 mm左右時(shí)為最佳剖宮產(chǎn)時(shí)機(jī)。

本研究中由于技術(shù)人員剖宮產(chǎn)技術(shù)操作熟練、注重操作細(xì)節(jié)及無菌動(dòng)物每窩產(chǎn)仔數(shù)少但成活率高生物學(xué)特性等原因，剖宮產(chǎn)存活率(95.45%)與離乳存活率(95.24%)均較高，但孕鼠每胎產(chǎn)仔數(shù)低于封閉群及單轉(zhuǎn)基因小鼠剖宮產(chǎn)凈化相關(guān)文獻(xiàn)[9-11]，可能與雙轉(zhuǎn)基因動(dòng)物繁殖能力降低有關(guān)。無菌動(dòng)物的體重增長較緩慢，為模型小鼠后期的正常發(fā)育，我們延長了小鼠離乳的時(shí)間。經(jīng)剖宮產(chǎn)凈化的PAP小鼠腦內(nèi)斑塊含量發(fā)生改變，提示腸道菌群可能與斑塊形成有關(guān)，相關(guān)研究正在進(jìn)行中。

本研究將無菌技術(shù)應(yīng)用于研究阿爾茨海默癥常用的APPswe/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠，建立了無菌化PAP小鼠模型，為研究腸道菌群與阿爾茨海默癥之間的關(guān)系提供一種新的動(dòng)物模型。