吳蓉蓉，晁燕，趙永麗，陳祺昌，鄭志琴,，夏明哲，祁得林*

(1.青海大學(xué)省部共建三江源生態(tài)與高原農(nóng)牧業(yè)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，西寧 810016；2. 青海大學(xué)生態(tài)環(huán)境工程學(xué)院，西寧 810016；3. 青海大學(xué)農(nóng)牧學(xué)院動(dòng)物科學(xué)系，西寧 810016)

裂腹魚亞科(Schizothoracinae)魚類屬于鯉形目(Cypriniforme)，鯉科(Cyprinidae)，是青藏高原水生魚類區(qū)系中主要類群之一，廣泛分布于上至海拔5000～6000 m雪線附近和下至海抜1000 m左右的高原邊緣的湖泊河流[1]，包含11～12屬共100多種[2]，根據(jù)形態(tài)特征將裂腹魚分為3個(gè)類群，即原始、特化和高度特化類群[3]，研究表明三個(gè)類群代表了青藏高原持續(xù)隆起過程的特定階段[4-5]。青藏高原具有高寒、低氧、強(qiáng)紫外線輻射等特征[6]，高原水體溶解氧波動(dòng)較大(4.0～7.4 mg/L)[5]，這種極端的水體環(huán)境對土著魚類的分布、生存適應(yīng)及進(jìn)化模式等產(chǎn)生了深刻的影響，同時(shí)賦予了裂腹魚亞科魚類抗缺氧、耐高寒的優(yōu)良生物學(xué)特性。目前，對裂腹魚類的研究多集中在形態(tài)分類及生物學(xué)特征等方面[7]，而在低氧適應(yīng)方面的研究仍有欠缺。

氧是機(jī)體進(jìn)行新陳代謝和維持生存的必要因素[8]，環(huán)境缺氧將嚴(yán)重影響魚類的生存、生長和繁殖[9-10]。魚類在長期進(jìn)化過程中具有獨(dú)特的適應(yīng)機(jī)制，如通過低氧誘導(dǎo)因子(hypoxia inducible factors，HIFs)信號途徑調(diào)節(jié)相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄進(jìn)行低氧應(yīng)答，增強(qiáng)低氧時(shí)的耐受性[11-12]。HIFs是一組由低氧調(diào)節(jié)的α亞基和氧不敏感的β亞基組成的異二聚體轉(zhuǎn)錄因子[13]，β亞基又稱芳香烴受體核轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。α亞基是HIF唯一的氧調(diào)節(jié)亞基，即是低氧誘導(dǎo)的，它決定HIF的活性。在脊椎動(dòng)物中發(fā)現(xiàn)HIF-α基因至少存在3種亞型：Hif-1α、Hif-2α和Hif-3α，其皆具有N端保守的bHLH結(jié)構(gòu)域，PAS和PAC結(jié)構(gòu)域，氧敏感的ODD結(jié)構(gòu)域以及C端負(fù)責(zé)轉(zhuǎn)錄激活的TAD結(jié)構(gòu)域。其中HIF-3α僅有一個(gè)N-TAD，C-TAD缺失[14]。

2001年，由Soitamo等[15]從虹蹲(Oncorhynchusmykiss)中首先克隆得到Hif-1α，在低氧時(shí)Hif-1α表達(dá)量明顯上升。Rojas等[16]從斑馬魚(Daniorerio)中克隆獲得Hif-1α和Hif-2α基因序列，發(fā)現(xiàn)與其他脊椎動(dòng)物Hif基因高度同源。Rytk?nen等[17]研究發(fā)現(xiàn)硬骨魚在早期發(fā)生的硬骨魚類特異性全基因組復(fù)制中產(chǎn)生了6個(gè)Hif-α基因：1 A/B，2 A/B和3 A/B。目前多數(shù)硬骨魚類有一個(gè)旁系同源基因發(fā)生丟失，但鯉科魚類中兩者都有保留[18]。為了深入研究青藏高原裂腹魚亞科魚類對高原低氧水體環(huán)境的適應(yīng)機(jī)制，本研究選取裂腹魚亞科魚類不同等級13個(gè)代表物種，通過RT-PCR獲得硬骨魚類特異性Hif-α基因(Hif-1αΑ/Hif-1αB和Hif-2αΑ/Hif-2αB)序列，并開展分子進(jìn)化分析。同時(shí)，選擇廣布種—花斑裸鯉，利用qRT-PCR方法檢測了低氧脅迫下Hif-α基因在主要組織中的表達(dá)調(diào)控，為進(jìn)一步探索Hif-α基因在高原魚類低氧適應(yīng)中的作用和調(diào)控機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

在青藏高原范圍內(nèi)采集13個(gè)裂腹魚亞科魚類代表物種，見表1。其中，瀾滄裂腹魚(Schizothoraxlantsangensis)、巨須裂腹魚(Schizothoraxmacropogon)、光唇裂腹魚(Schizothoraxlissolabiatus)、西藏裂腹魚(Schizothoraxlabiatus)為原始類群；厚唇裸重唇魚(Gymnodiptychuspachycheilus)、雙須葉須魚(Ptychobarbusdipogon)為特化類群；高原裸裂尻魚(Schizopygopsisstoliczkae)、尖裸鯉(Oxygymnocyprisstewartii)、高原裸鯉(Gymnocypriswaddelli)、拉薩裸裂尻魚(Schizopygopsisyounghusbandi)、花斑裸鯉(Gymnocypriseckloni)、黃河裸裂尻魚(Schizopygopsispylzovi)、極邊扁咽齒魚(Platypharodonextremus)為高度特化類群。野外采樣時(shí)，用100 mg/kg的戊巴比妥鈉(C11H17N2NaO3)對魚進(jìn)行麻醉，分別現(xiàn)場采集13個(gè)物種的肌肉、腦和鰓保存于液氮中，用于HIF基因克隆。

花斑裸鯉30尾(體重約210 g)采集于青海省大通縣湟水河支流—寶庫河，活魚運(yùn)送并養(yǎng)于青海大學(xué)農(nóng)牧實(shí)驗(yàn)室塑料桶中，經(jīng)低氧處理后采集組織，檢測各基因表達(dá)情況。

表1 裂腹魚亞科魚類采樣信息Table 1 Sampling information of the schizothoracinae fishes

1.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑

戊巴比妥鈉(25 g高純級，容創(chuàng))，RNA Simple Total RNA kit(天根)，F(xiàn)astQuant RT Kit(天根)，Premix Ex Taq? Version 2.0試劑盒(Takara)，TIANgel Midi Purification Kit(天根)，pMD19-T載體(天根)，SuperReal PreMix Plus(SYBR Green)試劑盒(天根)。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)儀器

溶解氧測定儀AZ8402(衡欣，臺灣)，氧泵(賽爾，浙江)，高速冷凍離心機(jī)(Beckman Inc，美國)，梯度PCR擴(kuò)增儀(Bio-Rad，美國)，Gel Doc XR+凝膠成像系統(tǒng)(Bio-Rad，美國)，熒光定量PCR儀(Bio-Rad，美國)，SX-500 高壓滅菌鍋(Tomy，日本)。

1.2 方法

1.2.1 總RNA提取及Hif-α基因cDNA序列擴(kuò)增

分別提取13種裂腹魚亞科魚類肌肉、腦和鰓RNA，而后合成13個(gè)物種的cDNA第一鏈。以13個(gè)物種組織cDNA為模板，對Hif-1αΑ、Hif-1αB、Hif-2αΑ和Hif-2αB基因進(jìn)行克隆，引物見表2。PCR擴(kuò)增程序：94℃預(yù)變性3 min；94℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸1 min，循環(huán)36次；72℃續(xù)延伸5 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.0%的瓊脂糖凝膠電泳后，進(jìn)行回收純化，然后連接轉(zhuǎn)化以進(jìn)行測序。

1.2.2 序列分析

測序完成后，利用Lasergene 7.0軟件[19]對測序結(jié)果分別進(jìn)行分析；利用Blastn在線程序(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)進(jìn)行確認(rèn)并進(jìn)行核酸比對；利用DNAMAN 6.0(http://www.lynnon.com)分別計(jì)算其核苷酸組成，堿基變異情況及氨基酸同源性；利用Smart(http://smart.embl-heidelberg.de/)和NCBI中的CDD數(shù)據(jù)庫(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi)進(jìn)行結(jié)構(gòu)域分析。

表2 裂腹魚Hif-α基因RT-PCR引物及qRT-PCR引物Table 2 Primers for RT-PCR and qRT-PCR of Hif-α gene in the schizothoracine fish

1.2.3 選擇壓力分析

在遺傳學(xué)中，通過比較其非同義替換率(dN)和同義替換率(dS)之間的比率(ω)，判斷基因是否有選擇壓力作用。dN/dS>1，則為正向選擇；dN/dS=1，則為中性選擇；dN/dS<1，則為純化選擇?；?3個(gè)裂腹魚亞科魚類的物種進(jìn)化樹，使用Paml的codeml程序進(jìn)行最大似然法分析，包括位點(diǎn)模型，支模型和支位點(diǎn)混合模型，具體方法見Qi等[20]文獻(xiàn)。Bayes Empirical Bayes(BEB)用于計(jì)算模型中發(fā)現(xiàn)的正選擇位點(diǎn)的可能性。

1.2.4 低氧處理

本研究中所涉及裂腹魚亞科物種多分布在偏遠(yuǎn)地帶，因此選擇離實(shí)驗(yàn)室較近的裂腹魚亞科代表種—花斑裸鯉開展低氧實(shí)驗(yàn)?；铘~運(yùn)送至實(shí)驗(yàn)室后，暫養(yǎng)于塑料桶中的30尾花斑裸鯉，使水充分曝氣將溶解氧(dissolved oxygen，DO)保持在(8.4 ± 0.1)mg/L，水溫在10～13℃。預(yù)養(yǎng)3 d后，隨機(jī)采集3尾花斑裸鯉白肌、紅肌、心臟、腦、鰓組織作為對照組。24尾作為中度低氧組置于40 L塑料桶，1 h內(nèi)將溶解氧濃度從(8.4 ± 0.1)mg/L降低至(3.0 ± 0.1)mg/L，并保持96 h，每隔12 h采集3尾各組織。取3尾作為重度低氧組置于另一40 L塑料桶，1 h內(nèi)將溶解氧濃度降低至(0.3 ± 0.1)mg/L，并保持4 h，采集組織。低氧處理時(shí)，塑料桶頂部覆蓋塑料膜，水體充氮除氧獲得預(yù)期溶解氧濃度。維持低氧期間，利用溶解氧測定儀定期監(jiān)控水體溶解氧濃度，氧含量若降低使用氧泵增氧至目的濃度。

1.2.5 qRT-PCR檢測低氧誘導(dǎo)下Hif-α基因的表達(dá)

將花斑裸鯉各低氧條件處理下的白肌、紅肌、心、腦和鰓組織分別提取總RNA，平衡各起始濃度合成cDNA第一鏈，然后進(jìn)行熒光定量PCR分析。反應(yīng)體系25 μL: 2× SuperReal PreMix Plus 12.5 μL、上下游引物(10 μmol/L)各1 μL、cDNA模板1 μL、ddH2O 9.5 μL。每個(gè)樣品重復(fù)3次，結(jié)果采用2-ΔΔCT法分析[21]。qRT-PCR測定時(shí)β-actin基因表達(dá)量作為內(nèi)標(biāo)，引物見表2。由于所測熒光定量原始數(shù)據(jù)量過多，在本研究中不再以表格形式展示。

2 結(jié)果

2.1 13個(gè)裂腹魚亞科魚類Hif-α基因序列分析

13個(gè)物種的Hif-1αΑ、Hif-1αB、Hif-2αΑ和Hif-2αB基因編碼區(qū)核苷酸序列分別為2196、2325、2544和2511 bp，分別編碼731、774、847、836個(gè)氨基酸，見表3。13個(gè)物種間各HIF-α基因的同源性為93.6%～99.4%、92.7%～99.9%、92.6%～99.8%、93.5%～99.8%，各類群代表物種間同源性大于95%。同一物種的HIF-1αΑ與HIF-1αB的相似性為50%～53%，HIF-2αΑ與HIF-2αB的相似性為54%～58%。裂腹魚亞科魚類HIF-α具有bHLH結(jié)構(gòu)域、PAS和PAC結(jié)構(gòu)域、ODD結(jié)構(gòu)域以及TAD結(jié)構(gòu)域。在高度特化等級、特化等級和原始等級類群中分別選取高原裸鯉、厚唇裸重唇魚和巨須裂腹魚作為代表種，將三個(gè)物種的HIF-α蛋白序列進(jìn)行多序列比對，結(jié)果見圖1。HIF-α N端的bHLH-PAS結(jié)構(gòu)域是高度保守的，但ODD區(qū)域保守性較低，特別是在氧依賴性脯氨酸羥基化位點(diǎn)附近。在13個(gè)物種的HIF-α序列中檢測到兩個(gè)保守的脯氨酸羥基化序列LxxLAP，但13個(gè)物種在HIF-1αΑ的NODD中檢測到特異性缺失，并且特化及高度特化類群的HIF-1αB的CODD結(jié)構(gòu)域中脯氨酸羥基化序列突變?yōu)镻xxLAP。

表3 基因編碼區(qū)序列信息表Table 3 Sequence information of the gene coding region

2.2 HIF-α分子進(jìn)化分析

為了探索HIF-1αΑ、HIF-1αB、HIF-2αΑ和HIF-2αB在裂腹魚亞科魚類不同類群中是否發(fā)生選擇作用，本文以13個(gè)裂腹魚亞科魚類的物種進(jìn)化樹作為輸入樹(圖2)，運(yùn)用PAML 4.6中CODEML程序的三個(gè)模型進(jìn)行檢測。位點(diǎn)模型中分析發(fā)現(xiàn)HIF-1αΑ、HIF-1αB、HIF-2αΑ和HIF-2αB存在正向選擇作用(ω > 1)，BEB分析顯示HIF-1α和HIF-2α中皆存在后驗(yàn)概率大于0.95的潛在選擇位點(diǎn)(表4)。支-位點(diǎn)混合模型中，以高度特化裂腹魚亞科魚類的7個(gè)代表物種作為前景支，其他物種作為背景支進(jìn)行分子進(jìn)化分析，結(jié)果顯示HIF-1αΑ、HIF-1αB和HIF-2αB中均未檢測到正向選擇位點(diǎn)(ω=1)，在HIF-2αA中檢測到一個(gè)正向選擇位點(diǎn)(516 N)，但后驗(yàn)概率小于0.95。

為了進(jìn)一步的檢驗(yàn)HIF-1α和HIF-2α所有支系是否發(fā)生正向選擇作用，本研究進(jìn)行了支模型分析，結(jié)果表明HIF-1αΑ中拉薩裸裂尻魚及其祖先支(支2、支14和支18，圖2)、厚唇裸重唇魚支(支9)和瀾滄裂腹魚及其祖先支(支12和支22)受到正向選擇作用，HIF-1αB中極邊扁咽齒魚支(支6)受到選擇作用，支15和支16也具有明顯不同的進(jìn)化速率，但具體的進(jìn)化物種分支并未檢測到。HIF-2αΑ中尖裸鯉支(支7)、雙須葉須魚支(支8)和西藏裂腹魚支(支10)受到正向選擇作用，且支14和支16也具有明顯不同的進(jìn)化速率。HIF-2αB中花斑裸鯉支(支5)受到選擇作用，支16和支22也具有明顯不同的進(jìn)化速率，但具體的進(jìn)化物種分支并未檢測到。

2.3 低氧誘導(dǎo)下Hif-α基因的表達(dá)

在重度低氧處理4 h后，Hif-1αA基因在花斑裸鯉白肌組織中的表達(dá)量顯著上升(P< 0.01)，是常氧組的9.8倍；而在心臟中的表達(dá)量顯著降低(P< 0.01)；在腦、鰓和紅肌組織中的表達(dá)量基本保持不變(P> 0.05)。Hif-1αB基因在白肌、紅肌、心臟和腦組織中顯著降低(P< 0.01)；在鰓組織中表達(dá)量上調(diào)(P< 0.05)。Hif-2αA基因在心臟(P< 0.01)和紅肌(P< 0.05)組織中表達(dá)量上升，且心臟組織中的表達(dá)量為常氧組的38倍；在腦組織中的表達(dá)量顯著降低(P< 0.01)。Hif-2αB基因在白肌組織中的表達(dá)量上調(diào)(P< 0.01)；在心臟和腦組織中表達(dá)量顯著下調(diào)(P< 0.01)(圖3)。

注：GWA：高原裸鯉；GPA：厚唇裸重唇魚；SMA：巨須裂腹魚。圖1 HIF-α的蛋白序列比對Note: GWA: Gymnocypris waddelli; GPA: Gymnodiptychus pachycheilus; SMA: Schizothorax macropogon.Figure 1 Sequence alignment of HIF-α proteins

基因Genes參數(shù)估計(jì)Parameter estimates似然率值Likelihood values正向選擇位點(diǎn)Positively selected sitesHif -1αAM0ω=0.561814753.99M1ap0=0.679, p1=0.3214683.99M2ap0=0.729, p1=0.154, p2=0.117, ω1=7.8994626.15M7p=0.005, q=0.005024695.43M8p0=0.89, p=0.005, q=0.021 (p1=0.11), ω1=8.4174626.2748I* 163N** 265G* 402C** 495L* 496 L*502S* 523P**571G* 572R** 589R**605G** 623P* 693I**Hif -1αBM0ω=0.434665.21M1ap0=0.561, p1=0.4394637.1M2ap0=0.9727, p1=0, p2=0.027, ω1=36.4334581.56M7p=0.005, q=0.007374637.64M8p0=0.999, p=0.005, q=0.007 (p1=0.00097), ω1=9994560.76532I* 644T*Hif -2αAM0ω=0.535213.57M1ap0=0.549, p1=0.451 5177.25M2ap0=0.558, p1=0.4408, p2=0.00098, ω1=9995097.15M7p=0.005, q=0.007475178.24M8p0=0.999, p=0.005, q=0.0075 (p1=0.00094), ω1=9995097.5039Q* 608P* 749S*Hif -2αBM0ω=0.4595084.73M1ap0=0.611, p1=0.3885032.04M2ap0=0.634, p1=0.356, p2=0.00965, ω1=86.5654960.77M7p=0.005, q=0.00735032.11M8p0=0.99, p=0.005, q=0.00754 (p1=0.00967), ω1=90.8674961.17427A* 435P**480E* 766C**

A

支模型Branch modelsdN/dSHIF-1αAHIF-1αBHIF-2αAHIF-2αB10.57<0.010.140.1621.15*0.12<0.010.1030.680.930.13<0.0140.490.160.550.7150.210.280.771.26*60.271.51*0.190.3170.820.563.44*0.4480.220.491.31*0.4491.13*0.400.500.71100.530.341.13*0.45110.47<0.010.31Inf121.59*0.752.33*0.84130.960.190.840.55142.94*0.371.99*0.2615<0.013.61*0.09Inf16<0.012.33*124.44*1.21*170.170.56<0.01Inf18203.69*0.090.610.1219<0.010.340.280.4320InfInf0.43Inf21<0.010.200.330.32222.09*0.86Inf324.53*230.780.450.640.52

注：A為不同支系HIF-1αΑ、HIF-1αB、HIF-2αΑ和HIF-2αB的ω值，B中的分支編號是指A中系統(tǒng)發(fā)育樹上的編號，*表示ω值大于1，Inf表示相應(yīng)dN值為0，其中ω值表示非同義替換與同義替換比值，dN表示密碼子的非同義替換。B是13個(gè)裂腹魚亞科魚類的系統(tǒng)發(fā)育樹。圖2 13個(gè)裂腹魚亞科魚類的系統(tǒng)發(fā)育樹Note. A is a phylogenetic tree of 13 subfamilies of schizothoracine fishes. B indicates the ω values of HIF-1αΑ, HIF-1αB, HIF-2αΑ and HIF-2αB. The numbers in B refer to the numbers on the phylogenetic tree in A. The symbol* indicates that the ω value is greater than 1, and Inf indicates that the corresponding dN value is 0, where the ω value indicates the ratio of nonsynonymous to synonymous substitutions, and dN indicates nonsynonymous substitutions at codons.Figure 2 Phylogenetic tree of 13 subfamilies of schizothoracine fishes

注：單因子方差分析法檢測各組織基因的表達(dá)量差異(n=3)，與常氧組相比差異顯著(**P< 0.01,*P< 0.05)。圖3 重度低氧和常氧條件下花斑裸鯉主要組織Hif-α基因的表達(dá)量Note. Significant differences between tissues were analyzed by one-way ANOVA (n=3). Compared with the normoxia control group, the asterisks indicate significant difference (**P<0.01,*P<0.05).Figure 3 Expression of Hif-α gene in main tissues of Gymnocypris eckloni under severe hypoxia and normoxia

注：a：腦；b：心臟；c：鰓；d：白肌；e：紅肌。單因子方差分析法檢測各組組織的基因表達(dá)量差異(n=3)，不同字母表示差異顯著(P< 0.05)。圖4 中度低氧和常氧條件下花斑裸鯉主要組織Hif-α基因的表達(dá)量Note. a: Brain. b: Heart. c: Gill. d: White muscle. e: Red muscle. Significant differences between tissues were analyzed by one-way ANOVA (n=3). Different letters indicate significant differences (P< 0.05).Figure 4 Expression of Hif-α gene in main tissues of Gymnocypris eckloni under moderate hypoxia and normoxia

中度低氧下，花斑裸鯉腦組織中Hif-1αA的表達(dá)量在48 h時(shí)達(dá)到最高，并且是0 h時(shí)的2.2倍，隨后表達(dá)量急劇下調(diào)(P< 0.05)；而Hif-1αB表達(dá)量從0 h開始逐漸上調(diào)，在48 h表達(dá)量最高，且72 h的表達(dá)量也明顯高于0 h(P< 0.05)；Hif-2αA表達(dá)量只在48 h和72 h時(shí)顯著上調(diào)，在84 h時(shí)其表達(dá)量顯著下調(diào)(P< 0.05)；而Hif-2αB在腦組織中的表達(dá)量在12 h和36 h時(shí)顯著高于0 h，且在48 h時(shí)表達(dá)量最高，隨后其表達(dá)量急劇下調(diào)。心臟組織中Hif-1αA的表達(dá)量在72 h和96 h顯著高于0 h(P< 0.05)；在12 h時(shí)Hif-1αB和Hif-2αA的表達(dá)量最高，且Hif-2αA表達(dá)量在96 h時(shí)較0 h顯著上調(diào)(P< 0.05)。鰓組織中，Hif-1αA的表達(dá)量除36 h外其他時(shí)間段均高于0 h的表達(dá)量(P< 0.05)；Hif-1αB和Hif-2αB基因的表達(dá)量在36、84和96 h時(shí)基本保持不變(P> 0.05)，其他時(shí)間段顯著上調(diào)(P< 0.05)；Hif-2αA的表達(dá)量在12 h和36 h表達(dá)量降低(P< 0.05)。白肌組織中，中度低氧脅迫時(shí)Hif-2αA的表達(dá)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其他三個(gè)基因，并在48 h時(shí)表達(dá)量最高；Hif-1αA和Hif-2αA基因在各個(gè)時(shí)間段的表達(dá)量與0 h相比均無明顯變化(P> 0.05)；Hif-1αB各個(gè)時(shí)間段的表達(dá)量均比0 h的表達(dá)量顯著下調(diào)(P< 0.05)。紅肌組織中，Hif-1αA和Hif-2αA基因在72 h表達(dá)量最高，而Hif-1αB和Hif-2αB表達(dá)量在24 h-96 h時(shí)間段較0 h均無明顯變化(P> 0.05)(圖4)。

3 討論

魚類具有同源基因Hif-αA和Hif-αB，并與人類HIF-α基因具有很高的相似性，同時(shí)魚類中的Hif-α基因可能在氧依賴基因的表達(dá)中產(chǎn)生的作用[22]。裂腹魚亞科魚類HIF-αA和HIF-αB氨基酸序列長度與鯉科其他魚類如鳙魚(Hypophthalmichthysnobilis)、鯉魚(Cyprinuscarpio)、鯽魚(Carassiusauratus)及斑馬魚基本一致，并具有bHLH結(jié)構(gòu)域、PAS和PAC結(jié)構(gòu)域、ODD結(jié)構(gòu)域以及TAD結(jié)構(gòu)域。目前大多數(shù)硬骨魚類丟失其中一個(gè)同源基因，鯉科魚類二者皆有保存，以上表明HIF-αA和HIF-αB在鯉科魚類長期進(jìn)化過程中體現(xiàn)出較高的保守性，與其產(chǎn)生的生物學(xué)功能一致。本研究獲得了13個(gè)裂腹魚亞科代表物種Hif-1αΑ、Hif-1αB、Hif-2αΑ和Hif-2αB基因編碼區(qū)完整序列，其N端的bHLH-PAS結(jié)構(gòu)域是高度保守的，但ODD結(jié)構(gòu)域保守性較低，特別是氧依賴性脯氨酸羥基化位點(diǎn)附近。HIF-α中檢測到兩個(gè)保守的脯氨酸羥基化序列LxxLAP，但在13個(gè)物種HIF-1αΑ的NODD中檢測到特異性缺失，并且特化及高度特化的裂腹魚的HIF-1αB的CODD結(jié)構(gòu)域中脯氨酸羥基化序列突變?yōu)镻xxLAP。HIF羥基化途徑在后生動(dòng)物中受氧依賴性脯氨酰羥化酶(prolyhydroxylases，PHD)家族的調(diào)控[23]。在哺乳動(dòng)物中，CODD結(jié)構(gòu)域中Pro-564是PHD與HIF-1α結(jié)合的重要位點(diǎn)[18]。缺氧條件下，PHD失活使HIF-α的羥基化受到抑制，從而與HIF-1β形成異源二聚體，結(jié)合DNA序列上的低氧反應(yīng)元件以激活下游基因的表達(dá)進(jìn)行耐氧適應(yīng)性反應(yīng)[24-25]。由此可以推斷，發(fā)生在ODD區(qū)域中的缺失和特異突變可能是裂腹魚亞科魚類在低氧適應(yīng)中進(jìn)化表現(xiàn)。

目前，對于裂腹魚亞科魚類HIF-α分子進(jìn)化研究報(bào)道甚少。管麗紅等[18]在裂腹魚亞科魚類中首次克隆出Hif的旁系同源基因，并結(jié)合其他鯉科魚HIF-α中序列僅發(fā)現(xiàn)HIF-1αB中存在正向選擇作用，且在特化及高度特化的裂腹魚中存在選擇作用位點(diǎn)，Hif-1αB基因是裂腹魚適應(yīng)低氧環(huán)境中重要的調(diào)節(jié)因子，同時(shí)Hif-α基因的正向選擇可能反映了裂腹魚亞科魚類在高海拔地區(qū)缺氧環(huán)境的適應(yīng)性進(jìn)化[26]。本研究進(jìn)一步對裂腹魚亞科不同進(jìn)化等級物種間是否存在選擇壓力進(jìn)行分析，結(jié)果表明HIF-1αΑ、HIF-1αB、HIF-2αΑ和HIF-2αB中皆存在潛在的受到正向選擇作用的氨基酸位點(diǎn)，且后驗(yàn)概率大于0.95。同時(shí)，支模型表明HIF-α在特化各物種、高度特化各物種及其祖先支具有明顯不同的進(jìn)化速率，但具體的進(jìn)化物種分支并未檢測到。在支-位點(diǎn)混合模型中，以高度特化等級物種作為前景支，僅在HIF-2αA中存在正向選擇作用。由此看來，HIF-α在13個(gè)物種間存在正向選擇作用，但HIF-1αΑ、HIF-1αB和HIF-2αB僅檢測到特化等級支及高度特化支中存在選擇作用，具體物種分支有待進(jìn)一步研究。

低氧誘導(dǎo)因子作為氧敏感的轉(zhuǎn)錄激活因子，在低氧條件下可被誘導(dǎo)表達(dá)參與反應(yīng)調(diào)節(jié)。HIF-1α和HIF-2α兩者具有不同的激活域從而形成了各自的特異性靶基因以及各自獨(dú)特的功能[23]。本研究結(jié)果表明，重度缺氧條件下Hif-1αΑ和Hif-2αB基因在白肌組織中顯著上升，且在中度缺氧時(shí)，Hif-2αB在白肌組織中的表達(dá)量遠(yuǎn)高于另外3個(gè)基因。Hif-1αB在重度缺氧條件下在鰓組織中表達(dá)量顯著升高。Hif-2αA在重度缺氧條件下在心和紅肌中的表達(dá)量顯著上升，并在中度缺氧條件的12 h和96 h具有較高的表達(dá)量。在不同組織中Hif-αmRNA表達(dá)不同，可能是對氧氣敏感度不同，缺氧表達(dá)的動(dòng)力學(xué)取決于氧氣水平并存在組織器官特異性。在對尼羅羅非魚的研究中發(fā)現(xiàn)硬骨魚Hif-1αΑ/B和Hif-2αA/B基因在缺氧條件下的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)中存在物種特異性，也還受缺氧的組織及缺氧狀態(tài)的影響[27]。在重度缺氧條件下，花斑裸鯉的腦組織中Hif-1αB、Hif-2αΑ和Hif-2αB基因表達(dá)量顯著下降，心臟組織中Hif-1αA、Hif-1αB和Hif-2αB基因表達(dá)量顯著下降，可能在急性低氧環(huán)境中可以保護(hù)物種本身，在中度低氧的后期，心臟組織中的Hif-1αA和Hif-2αA基因表達(dá)量上調(diào)，可能是為了提高攜氧能力從而彌補(bǔ)機(jī)體缺氧而做出的應(yīng)激性應(yīng)答。由此推斷，裂腹魚亞科魚類在適應(yīng)長期低氧和應(yīng)激性低氧環(huán)境可能存在兩種不同的機(jī)制。