吳婷玉 周景芬

(武漢市第一醫(yī)院老年病科，武漢430000)

缺血性心力衰竭(Ischemic heart failure，IHF)可導(dǎo)致心肌組織缺血缺氧，心肌細(xì)胞壞死，心肌間質(zhì)纖維化等病變，影響心臟功能[1]。研究發(fā)現(xiàn)，缺血性心力衰竭的發(fā)生與心肌間質(zhì)纖維化密切相關(guān)，細(xì)胞自噬是真核生物特有的一種自我保護(hù)機(jī)制，可消化大分子物質(zhì)、受損細(xì)胞器等并進(jìn)行循環(huán)利用，在心肌病變過程中具有重要作用[2]。隨著分子生物學(xué)的進(jìn)展，信號通路在疾病發(fā)展中的作用逐漸受到重視。有絲分裂原活化蛋白激酶(Mitogen-activated protein kinase，MAPK)系列通路，作為機(jī)體中重要的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路之一，參與調(diào)控細(xì)胞增殖、凋亡等生物學(xué)過程，其中MAPK磷酸化后可級聯(lián)激活下游凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)，促進(jìn)心肌細(xì)胞凋亡[3]。研究表明，MAPK過度激活與缺血性心肌損傷密切相關(guān)，抑制MAPK活性可有效改善心臟功能[4]。據(jù)此推測，靶向MAPK的新藥物開發(fā)可為缺血性心力衰竭的臨床治療提供新思路。近年研究表明，葡萄籽原花青素(Grape seed proanthocyanidin extract，GSPE)具有抗凋亡、抗氧化、抗心血管疾病等多種藥理作用[5]。然而，GSPE對缺血性心力衰竭所致心臟損傷的保護(hù)作用及機(jī)制尚不明確。本研究構(gòu)建缺血性心力衰竭大鼠模型，觀察GSPE對缺血性心力衰竭大鼠心臟功能的保護(hù)作用并初步探討其作用機(jī)制，試圖為GSPE應(yīng)用于缺血性心力衰竭的治療提供一定理論支撐。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動物及分組 清潔級SD大鼠，雌雄各半，體重170～200 g，許可證號：SCXK(滬)-2014-0001，購自上海邦耀生物公司。所有實(shí)驗(yàn)SD大鼠均于本院實(shí)驗(yàn)動物管理中心集中進(jìn)行常規(guī)飼養(yǎng)，適應(yīng)1周后隨機(jī)選取一定數(shù)量大鼠用于研究。本研究成功復(fù)制IHF模型大鼠75只，隨機(jī)分成5組：IHF組、低劑量GSPE組、中劑量GSPE組、高劑量GSPE組和陽性對照卡普托利組。自術(shù)后第一天起，分別給予各組大鼠相應(yīng)藥物(以生理鹽水溶解)處理，低、中、高劑量GSPE組：給予50 mg/kg GSPE、100 mg/kg GSPE、200 mg/kg GSPE灌胃給藥；卡普托利組：給予300 mg/kg卡普托利灌胃給藥；對照組和模型組：給予等體積生理鹽水灌胃處理。各組大鼠均每天定時灌胃給藥1次，灌胃容積為1 ml/100 g，持續(xù)4周。

1.1.2 主要試劑及儀器 葡萄籽原花青素(GSPE)(含量≥95.0%，貨號：hbyc1652)購自湖北遠(yuǎn)成科技生物公司；卡普托利(Captopril，CAPT)(規(guī)格：12.5 mg×100粒，貨號：C14200011098)購自上海施貴寶制藥有限公司；蛋白抽提試劑盒、戊二醛、戊巴比妥鈉購自碧云天公司；DAB顯色試劑盒購自中杉金橋公司；兔源一抗cleaved-caspase9抗體(貨號：ab25758)、cleaved-caspase3抗體(貨號：ab90437)、JNK抗體(貨號：ab208035)、ERK1/2抗體(貨號：ab115799)、p38MAPK抗體(貨號：ab126425)、p-JNK抗體(貨號：ab76572)、p-ERK1/2抗體(貨號：ab200807)、p-p38MAPK抗體(貨號：ab207483)、GAPDH抗體(貨號：ab181602)、羊抗兔二抗抗體(貨號：ab6721)均購于美國Abcam公司；蛋白電泳儀購自美國Bio-Rad公司；透射電子顯微鏡(H-7500)購自日本日立公司等。

1.2 方法

1.2.1 CHF模型的制備 參照文獻(xiàn)[6]中方法復(fù)制缺血性心力衰竭模型大鼠。手術(shù)前，將2.5%戊巴比妥鈉(50 mg/kg)注射進(jìn)大鼠腹腔進(jìn)行麻醉。徹底麻醉后，將大鼠固定在手術(shù)臺上(仰臥位)，沿腹部中線切開腹腔，暴露出腹主動脈和下腔靜脈。在距大鼠髂骨動脈根部上方約3 mm處夾閉腹主動脈，并做U形縫合，將18G留置針于縫合處貼血管前壁向上穿刺進(jìn)入腹主動脈，小心沿右上方向推行，至腹腔靜-動脈聯(lián)合壁時，刺破進(jìn)入下腔靜脈造瘺，拔除穿刺針，打緊U型縫合線，逐層縫合腹部肌肉并消毒，成功構(gòu)造慢性心衰模型。對照組只穿刺腹主動脈不刺破下腔靜脈，其余操作均同模型組。術(shù)后統(tǒng)一進(jìn)行常規(guī)喂養(yǎng)。若造模大鼠數(shù)量不足預(yù)定數(shù)量，則通過隨機(jī)原則取備用大鼠補(bǔ)足。

1.2.2 大鼠超聲心臟血流動力學(xué)檢測 GSPE作用4周后，采用上述方法麻醉各組大鼠，分別行多普勒彩色超聲心臟血流動力學(xué)檢測，在超聲二維影像指導(dǎo)下，檢測并記錄大鼠心率(Heart rate，HR)、左心室收縮壓(Left ventricular systolic pressure，LVSP)、平均動脈壓(Mean arterial pressure，MAP)以及左心室舒張末壓(Left ventricular end-diastolic pressure，LVEDP)，連續(xù)檢測3個心臟周期，計算平均值。

1.2.3 標(biāo)本采集 心臟超聲血流動力學(xué)檢測完成后，處死各組大鼠(每組15只)，迅速取出心臟，摘除非心肌其他組織，將心室直徑最大處心肌組織剪切為1 cm×1 cm×1 cm組織，部分浸泡于福爾馬林緩沖液(10%)固定24 h，制備石蠟切片備用，部分浸泡于4%戊二醛固定；另取部分心肌組織切碎，在液氮中迅速冷凍后保存于-80℃冰箱。

1.2.4 心肌組織形態(tài)學(xué)觀察 將上述心肌組織切片脫蠟、乙醇水合、洗滌后，采用蘇木精(Hematoxylin，H)-伊紅(Eosin，E)逐步對切片染色，最后洗去多余染液，采用中性樹膠封片，采用光學(xué)顯微鏡觀察大鼠心肌組織形態(tài)并拍照記錄。

1.2.5 TUNEL法檢測細(xì)胞凋亡 將心肌組織制備冷凍切片(7 μm/片)，采用TUNEL染色試劑盒(綠色熒光)處理切片，然后以4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(4′,6-diamidino-2-phenylindole，DAPI)(藍(lán)色熒光)對細(xì)胞核染色，將切片置于激光共聚焦掃描顯微鏡下觀察并拍照，以綠色熒光強(qiáng)度與藍(lán)色熒光強(qiáng)度的比值表示TUNEL陽性細(xì)胞比例，即凋亡細(xì)胞比例。

1.2.6 蛋白免疫印跡分析 研磨大鼠心肌冷凍組織，提取組織中總蛋白，定量后，采用SDS-凝膠電泳分離分子量不同的蛋白質(zhì)，轉(zhuǎn)印至PVDF膜。首先加入5%脫脂奶粉，封閉PVDF膜1 h；然后分別加入兔源cleaved-caspase9抗體、cleaved-caspase3抗體、ERK1/2抗體、p38MAPK抗體、p-ERK1/2抗體、p-p38MAPK抗體、GAPDH抗體等一抗(1∶500)，4℃孵育過夜；之后加入與HRP綴合的羊抗兔二抗(1∶5 000)，室溫孵育1 h；最后經(jīng)增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光試劑處理后，采用Tanon軟件采集圖像并對蛋白條帶灰度進(jìn)行分析。

2 結(jié)果

2.1 大鼠心臟血流動力學(xué)的變化 與對照組比較，IHF組大鼠HR、LVEDP明顯升高(P<0.05)，MAP、LVSP明顯降低(P<0.05)。與IHF組比較，低、中、高劑量GSPE組和卡普托利組大鼠HR、LVEDP均明顯降低(P<0.05)，MAP、LVSP均明顯升高(P<0.05)；與卡普托利組比較，高劑量GSPE組大鼠HR、LVEDP、MAP、LVSP均無明顯差異(P>0.05)，見表1。

2.2 大鼠心肌組織形態(tài)學(xué)改變 對照組心肌細(xì)胞排列規(guī)則、緊密，肌原纖維完整，組織結(jié)構(gòu)正常。IHF組心肌細(xì)胞細(xì)胞破碎、排列疏松，肌原纖維破裂，組織中出現(xiàn)炎性細(xì)胞，呈現(xiàn)病理損傷狀態(tài)。低、中、高劑量GSPE組和卡普托利組心肌細(xì)胞排列趨于規(guī)則，壞死細(xì)胞減少，肌原纖維逐漸完整。高劑量GSPE組與卡普托利組心肌組織形態(tài)趨于一致，見圖1。

2.3 大鼠心肌細(xì)胞凋亡的比較 與對照組比較，IHF組大鼠TUNEL陽性心肌細(xì)胞比例明顯升高(P<0.05)；與IHF組比較，低、中、高劑量GSPE組大鼠TUNEL陽性心肌細(xì)胞比例明顯降低(P<0.05)；與卡普托利組比較，高劑量GSPE組大鼠TUNEL陽性心肌細(xì)胞比例無明顯差異(P>0.05)，見圖2、表2。

圖1 心肌組織HE染色結(jié)果(×200)Fig.1 HE staining results of myocardial tissue(×200)

GroupsHR(beats/min)LVEDP(mmHg)MAP(mmHg)LVSP(mmHg)Ctrl487.75±24.327.75±1.03120.67±15.86146.25±13.78IHF559.27±29.141)16.28±3.351)93.53±13.791)108.76±12.351)CAPT495.64±30.861)2)6.57±1.161)2)119.21±10.571)2)133.74±11.481)GSPE-L543.14±26.781)2)3)12.58±1.961)2)3)108.13±13.951)2)3)116.51±13.161)2)3)GSPE-M522.06±26.171)2)3)8.06±1.231)2)3)115.34±12.141)2)3)128.31±10.171)2)3)GSPE-H490.27±25.211)2)6.34±1.091)2)121.03±9.631)2)132.56±9.761)2)

Note：Compared with the control group，1)P<0.05；compared with the IHF group，2)P<0.05；compared with the CAPT group，3)P<0.05.

2.4 大鼠心肌組織凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的比較 與對照組相比，IHF組大鼠心肌組織cleaved-caspase9、cleaved-caspase3蛋白水平明顯增加(P<0.05)。與IHF組相比，低、中、高劑量GSPE組和卡普托利組大鼠心肌組織cleaved-caspase9、cleaved-caspase3蛋白表達(dá)量水平明顯降低(P<0.05);與卡普托利組比較，高劑量GSPE組大鼠心肌組織cleaved-caspase9、cleaved-caspase3蛋白水平無明顯差異(P>0.05)，見圖3、表3。

圖2 TUNEL法觀察心肌細(xì)胞凋亡(×100)Fig.2 Apoptosis of myocardial cell by TUNEL(×100)

GroupsApoptosis ratio(%)Ctrl6.54±1.08IHF41.82±9.461)CAPT9.43±2.041)2)GSPE-L32.51±7.321)2)GSPE-M19.36±3.871)2)3)GSPE-H8.94±2.111)2)

Note：Compared with the control group，1)P<0.05；compared with the IHF group，2)P<0.05；compared with the CAPT group，3)P<0.05.

圖3 WB檢測凋亡蛋白表達(dá)情況Fig.3 Expression of apoptosis-rated protein detected by WB

2.5 大鼠心肌組織MAPK通路相關(guān)蛋白表達(dá)的比較 與對照組相比，低、中、高劑量GSPE組和卡普托利組大鼠心肌組織ERK1/2、MAPK、JNK蛋白總相對表達(dá)量均無顯著差異(P>0.05)。與對照組相比，IHF組大鼠心肌組織ERK1/2、MAPK、JNK蛋白磷酸化水平明顯增加(P<0.05)。與IHF組相比，低、中、高劑量GSPE組和卡普托利組大鼠心肌組織ERK1/2、MAPK、JNK蛋白磷酸化水平明顯降低(P<0.05)；與卡普托利組比較，高劑量GSPE組大鼠心肌組織ERK1/2、MAPK、JNK蛋白磷酸化水平無明顯差異(P>0.05)，見圖4、表4。

Groupscleaved-caspase9/GAPDHcleaved-caspase3/GAPDHCtrl0.38±0.040.49±0.08IHF2.09±0.121)2.31±0.171)CAPT0.35±0.051)2)1.29±0.041)2)GSPE-L1.87±0.081)2)3)2.05±0.111)2)3)GSPE-M1.16±0.071)2)3)1.78±0.151)2)3)GSPE-H0.43±0.071)2)1.25±0.081)2)

Note：Compared with the control group，1)P<0.05；compared with the IHF group，2)P<0.05；compared with the CAPT group，3)P<0.05.

圖4 WB檢測各組大鼠心肌組織ERK1/2、MAPK、JNK蛋白表達(dá)情況Fig.4 Expression of ERK1/2，MAPK，JNK protein detected by WB

GroupERK1/2/GAPDHp-ERK1/2/GAPDHp38MAPK/GAPDHp-p38MAPK/GAPDHJNK/GAPDHp-JNK/GAPDHCtrl3.23±0.650.32±0.092.01±0.410.63±0.141.12±0.220.49±0.12IHF3.17±0.632.51±0.511)1.92±0.381.95±0.381.21±0.241.23±0.251)CAPT3.16±0.641.68±0.351)2)1.98±0.390.54±0.121)2)1.19±0.230.41±0.091)2)GSPE-L3.19±0.662.26±0.491)2)3)1.87±0.361.78±0.241)2)3)1.23±0.241.01±0.211)2)GSPE-M3.22±0.651.89±0.431)2)3)1.94±0.371.05±0.191)2)3)1.15±0.230.47±0.111)2)3)GSPE-H3.24±0.641.57±0.291)2)1.89±0.380.57±0.131)2)1.14±0.220.38±0.071)2)

Note：Compared with the control group，1)P<0.05；Compared with the IHF group，2)P<0.05；compared with the CAPT group，3)P<0.05.

3 討論

心力衰竭是指由于心臟功能損傷導(dǎo)致靜脈系統(tǒng)血液積滯、動脈系統(tǒng)血供不足，進(jìn)而引起心臟循環(huán)障礙，是臨床上多種心血管疾病的終末階段，具有預(yù)后差、致殘致死率高等特點(diǎn)，嚴(yán)重威脅人類生命安全，逐漸成為一種世界性健康問題[7，8]。本研究采用動脈-靜脈造瘺法制備缺血性心力衰竭大鼠模型，結(jié)果顯示，缺血性心力衰竭大鼠HR、LVEDP明顯升高，MAP、LVSP明顯降低，大鼠心肌細(xì)胞壞死、心肌纖維斷裂，表明造模大鼠心臟收縮舒張功能降低、心肌組織出現(xiàn)明顯損傷，提示造瘺法可成功復(fù)制缺血性心力衰竭模型。

GSPE是一種從葡萄籽提取分離的天然化合物，屬于多酚類物質(zhì)，可抑制氧化應(yīng)激、細(xì)胞凋亡、炎癥反應(yīng)等，常用于抗氧化、抗衰老等[9，10]。研究表明，GSPE通過激活自發(fā)性高血壓大鼠的抗氧化損傷系統(tǒng)，改善大鼠心臟收縮舒張功能，推測GSPE可增強(qiáng)高血壓大鼠心臟功能[11]。Vijayakumar等[12]發(fā)現(xiàn)，GSPE可通過抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)，有效抑制年齡相關(guān)性大鼠心肌細(xì)胞凋亡，保護(hù)大鼠心臟功能。本研究發(fā)現(xiàn)，GSPE作用4周后，IHF大鼠的HR、LVEDP顯著降低，MAP、LVSP顯著升高，心肌病理損傷程度明顯減輕，與卡普托利作用效果一致，提示GSPE可改善缺血性心力衰竭大鼠心臟收縮舒張功能和減輕心肌組織損傷，但其作用機(jī)制尚不明確。

心臟損傷是一個多因素共同作用的復(fù)雜過程，其病理過程與細(xì)胞凋亡密切相關(guān)[13]。正常生理情況下，細(xì)胞凋亡一般在衰老或病變細(xì)胞中發(fā)生，是機(jī)體清除衰老或病變細(xì)胞，維持細(xì)胞動態(tài)平衡的自我保護(hù)機(jī)制；當(dāng)機(jī)體受到外界凋亡刺激時，細(xì)胞失去對凋亡相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)的控制，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡出現(xiàn)異常，引起細(xì)胞壞死，進(jìn)而引起機(jī)體發(fā)生病理性變化[14，15]。本研究發(fā)現(xiàn)，IHF大鼠凋亡心肌細(xì)胞比例及心肌組織cleaved-caspase9、cleaved-caspase3蛋白水平均顯著高于對照組；GSPE作用4周后，IHF大鼠凋亡心肌細(xì)胞比例及心肌組織cleaved-caspase9、cleaved-caspase3蛋白水平明顯下降，提示GSPE可抑制缺血性心力衰竭大鼠心肌細(xì)胞凋亡。進(jìn)一步檢測發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞凋亡是生物體調(diào)節(jié)機(jī)體細(xì)胞平衡的一種自主死亡程序，研究表明MAPK信號通路與細(xì)胞凋亡密切相關(guān)。當(dāng)機(jī)體受到外界刺激時，MAPK通路通過一系列級聯(lián)激活，可將胞外信號傳遞至細(xì)胞內(nèi)，激活下游靶基因轉(zhuǎn)錄和表達(dá)，參與調(diào)控細(xì)胞凋亡、炎癥反應(yīng)等多種生理過程[16]。據(jù)報道，三條MAPK信號通路并行存在于哺乳類動物細(xì)胞中，分別為細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶(Extracellular signal regulated protein kinase，ERK)、p38 MAPK和C-Jun N-末端激酶(C-Jun N-terminal kinase，JNK)通路，當(dāng)細(xì)胞接收到外界刺激信號時，可激活ERK、p38 MAPK、JNK信號通路中的部分或全部，既可獨(dú)立作用也可協(xié)調(diào)作用調(diào)節(jié)細(xì)胞功能[17，18]。多項(xiàng)研究證實(shí)，MAPK信號通路異常激活與心肌肥厚、急性心梗、心衰等多種心血管疾病的發(fā)生密切相關(guān)[19]。Cipolletta等[20]通過構(gòu)建病理性心肌肥厚大鼠模型，發(fā)現(xiàn)ERK蛋白在模型大鼠心肌組織中高度磷酸化，抑制其磷酸化程度可有效降低模型大鼠心臟體積、減輕心臟質(zhì)量和降低心肌壁厚度，減輕心肌肥厚病癥。本研究發(fā)現(xiàn)，IHF組大鼠心肌組織ERK1/2、MAPK、JNK蛋白磷酸化水平程度明顯高于對照組；GSPE作用4周后，IHF大鼠心肌組織ERK1/2、MAPK、JNK蛋白磷酸化程度降低，提示GSPE可抑制MAPK信號通路激活。

綜上所述，葡萄籽原花青素可能通過調(diào)節(jié)MAPK通路抑制心肌細(xì)胞凋亡，為將葡萄籽原花青素應(yīng)用于改善缺血性心力衰竭提供了一定理論基礎(chǔ)。