黃垂名 張小波 彭小旅

(海南省人民醫(yī)院小兒外科，?？?70100)

神經(jīng)母細胞瘤是較為常見的神經(jīng)系統(tǒng)惡性腫瘤，據(jù)統(tǒng)計我國每年發(fā)病兒童達上千例，且患病兒童常在晚期發(fā)現(xiàn)，患兒治療困難，預(yù)后差，嚴重影響患者的身心健康[1]。神經(jīng)母細胞瘤中細胞的異常增殖與細胞侵襲是導(dǎo)致神經(jīng)母細胞瘤患者死亡的主要原因，F(xiàn)as/FasL通路在細胞的增殖、凋亡中發(fā)揮重要作用[2]。近年來隨著對腫瘤研究的深入，已經(jīng)從編碼蛋白RNA層面逐漸延伸到非編碼RNA(lncRNA)。LNCRNs是一類長度超過200個核苷酸的內(nèi)源性非編碼蛋白質(zhì)RNA，其在胚胎發(fā)育、細胞增殖、細胞分化中發(fā)揮重要作用[3]。多項研究表明lncRNA的調(diào)控機制與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展相關(guān)。lncRNA HOTAIR 在腫瘤的進展中發(fā)揮重要作用，其通過重組染色質(zhì)促進癌轉(zhuǎn)移[4]；lncRNA TUG1過表達促進宮頸癌細胞增殖和遷移[5]。MAGI2-AS3是近年來新發(fā)現(xiàn)的lncRNA，其在乳腺癌中發(fā)揮重要作用[6]。但其在神經(jīng)母細胞瘤中的研究鮮有報道，故本研究通過組織學(xué)和分子學(xué)機制探究lncRNA MAGI2-AS3在Fas/FasL通路中對神經(jīng)母細胞瘤的調(diào)控作用。

1 資料與方法

1.1 資料

1.1.1 材料與儀器 人神經(jīng)母細胞瘤細胞系SH-SY5Y、SK-N-SH均購自中國科學(xué)院。MAGI2-AS3慢病毒顆粒(LV-MAGI2-AS3)和對照慢病毒顆粒(LV-NC)購自上海GenePharma Bio。DMEM培養(yǎng)基(美國Thermo Fisher Scientific公司)，胎牛血清(FBS，美國Gibco-BR)，胰蛋白酶(美國Difo公司)，DMSO(美國Amresco公司)，Trizol試劑盒、RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒(中國大連TaKaRa公司)，SYBR Prime Script RT-PCR試劑盒(大連寶生物工程有限公司)，BCA蛋白試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)，PVDF微孔濾膜(美國Bio-Rad 公司)，β-肌動蛋白抗體(美國ABcam公司)，F(xiàn)as抗體、FasL抗體(美國Proteintech公司)，二抗辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的羊抗鼠IgG(美國Pierce公司)，十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE，上海生物技術(shù)研究所)，多功能酶標(biāo)儀(美國Bio-Tek公司)，F(xiàn)ACS流式細胞儀(美國BD公司)，CO2恒溫培養(yǎng)箱(美國Thermo公司)，凝膠成像系統(tǒng)(美國UVP公司)，離心機、熒光定量儀(德國Eppendorf公司)。

1.1.2 臨床資料 本研究選用2016年1月至2018年6月在本院接受治療的23例神經(jīng)母細胞瘤患者為研究對象，其中男11例，女12例，年齡5個月～14歲，平均(4.15±3.06)歲；按照國際神經(jīng)母細胞瘤分期系統(tǒng)進行臨床分期：Ⅰ～Ⅱ期8例，Ⅲ～Ⅳ期15例。手術(shù)采集患者癌組織和癌旁正常組織，采集后比標(biāo)號所有組織樣本保存于液氮中。經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)同意，所有患者及監(jiān)護人均知情同意且簽署同意書。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)與慢病毒處理 人神經(jīng)母細胞瘤細胞系SH-SY5Y、SK-N-SH培養(yǎng)在含有10%胎牛血清的DMEM完全培養(yǎng)液中，置于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，當(dāng)細胞融合度達到80%左右時，棄掉培養(yǎng)基，適量PBS清洗，使用0.25% 的胰蛋白酶進行消化，消化完成后用含有10%胎牛血清的DMEM終止消化，1 000 r/min離心收集細胞，接種到25 cm2細胞培養(yǎng)瓶中繼續(xù)培養(yǎng)，每2 d換液，3～4 d傳代，穩(wěn)定傳代2～3代，收集對數(shù)期細胞進行實驗。

收集對數(shù)期的SH-SY5Y、SK-N-SH細胞，每種細胞分為3組，每組做3個重復(fù)，control組(control)未轉(zhuǎn)染慢病毒顆粒，LV-NC組為轉(zhuǎn)染空載，LV-MAGI2-AS3組為轉(zhuǎn)染MAGI2-AS3慢病毒顆粒，轉(zhuǎn)染步驟按照說明書進行。在病毒轉(zhuǎn)染前用5 μg/ml聚丁烯(GenePharma Bio)處理80%融合細胞，1 d后轉(zhuǎn)入新鮮培養(yǎng)基。轉(zhuǎn)染后細胞于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)，收集轉(zhuǎn)染后0、24、48、72 h的細胞熒光顯微鏡檢測轉(zhuǎn)染效率。

1.2.2 qRT-PCR檢測組織(細胞)中mRNA的表達 收集轉(zhuǎn)染后各細胞系對數(shù)期細胞，用Trizol法抽提組織(細胞)總RNA，反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄為cDNA，熒光定量PCR儀進行qRT-PCR檢測各細胞系MAGI2-AS3、Fas、FasL mRNA相對表達量。SYBR Green法qRT-PCR反應(yīng)體系為25 μl：SYBR GreenⅡMaster Mix 12 μl，上下游引物各1 μl，cDNA模板1 μl，ddH2O補足25 μl；參數(shù)設(shè)置為95℃ 2 min，95℃ 15 s，60℃ 20 s，72℃ 20 s，共40個循環(huán)。以β-actin為管家基因。采用Primer Premier5.0 設(shè)計引物，由上海生工合成，引物序列見表1。

1.2.3 細胞增殖情況的檢測 采用CCK-8方法檢測細胞增殖情況。收集各組細胞懸液于96孔板中(100 μl/孔)，每組設(shè)置3個平行對照，每孔加入10 μl CCK-8溶液，在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)4 h，使用酶標(biāo)儀檢測450 nm處的吸光值，分析細胞增殖情況。

1.2.4 細胞凋亡的檢測 采用流式細胞儀檢測細胞凋亡情況。胰蛋白酶進行消化，室溫2 000 r/min離心5 min收集各組細胞；PBS洗滌細胞2次，調(diào)整細胞為1×106ml-1；吸取1 ml細胞懸浮液，加入 500 μl 的結(jié)合緩沖液混合，上機前加入5 μl碘化丙啶(PI)和 5 μl 膜聯(lián)蛋白-V(Annexin-V)，室溫避光反應(yīng)10 min，1 h內(nèi)使用流式細胞儀檢測細胞凋亡情況。

2 結(jié)果

2.1 lncRNA MAGI2-AS3、Fas、FasL mRNA在神經(jīng)母細胞瘤組織中的表達 對23例神經(jīng)母細胞瘤患者進行qRT-PCR檢測癌組織和正常組織的MAGI2-AS3表達水平。結(jié)果顯示，MAGI2-AS3 mRNA在神經(jīng)母細胞瘤組織中的表達顯著低于相對應(yīng)的正常組織(圖1A)。對Fas、FasL mRNA表達水平進行檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)神經(jīng)母細胞瘤組織Fas、FasL mRNA表達較正常組織均顯著降低(圖1B、C)，見表2。

2.2 lncRNA MAGI2-AS3的表達與神經(jīng)母細胞瘤患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系 根據(jù)lncRNA MAGI2-AS3表達水平的中位值分為高表達組共16例，低表達組共7例，觀察lncRNA MAGI2-AS3表達與神經(jīng)母細胞瘤患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系，結(jié)果顯示lncRNA MAGI2-AS3與臨床分期、組織分化程度有關(guān)，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，與年齡、腫瘤大小、浸潤深度無顯著相關(guān)。詳見表3。

2.3 轉(zhuǎn)染效率的檢測 采用轉(zhuǎn)染慢病毒上調(diào)SK-N-SH、SH-SY5Y 兩個神經(jīng)母細胞瘤細胞系中MAGI2-AS3表達水平，用熒光顯微鏡法測定感染效率，結(jié)果表明轉(zhuǎn)染MAGI2-AS3慢病毒(LV-MAGI2-AS3)可顯著提高MAGI2-AS3在神經(jīng)母細胞中的表達(圖2A、B)。qRT-PCR檢測結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染LV-MAGI2-AS3的MAGI2-AS3表達水平顯著高于轉(zhuǎn)染LV-NC和control組。

表1 引物信息

Tab.1 Primer information

GeneForward primer(5'-3')Reverse primer(5'-3')β-actinGGTCTCAAACATGATCTGGGGGGTCAGAAGGACTCCTATGMAGI2-AS3CACCTTGCTTGACAACTTGACATTACAGCTCGGCTACTGCFasCTGGATTTAGGAATTGCTCTTGTCAGGTGGTTCCAGGTATCTGCTTCAFasLTGCACACAGCATCATCTTTGGAAGGCATGGACCTTGAGTTGGAC

圖1 lncRNA MAGI2-AS3、Fas、FasL mRNA在組織中的表達水平Fig.1 Expression of lncRNA MAGI2-AS3,Fas and FasL mRNA in tissuesNote: ***.P<0.001.

表2 lncRNA MAGI2-AS3、Fas、FasL mRNA在組織中的表達水平

Tab.2 Expression of lncRNA MAGI2-AS3,Fas and FasL mRNA in tissues

GroupsnMAGI2-AS3FasFasL Normal group231.02±0.291.01±0.310.91±0.28Colon cancer group23 0.48±0.211)0.52±0.201)0.50±0.181)

Note：Compared with the normal group,1)P<0.001.

表3 lncRNA MAGI2-AS3的表達與患者臨床病理特征的關(guān)系[例(%)]

Tab.3 Relationship between expression of lncRNA MAG-I2-AS3 and clinicopathological features of patients[n(%)]

圖2 lncRNA MAGI2-AS3的過表達情況和lncRNA MAGI2-AS3 mRNA的表達水平(×400)

Fig.2 Overexpression of lncRNA MAGI2-AS3 and express-ion level of lncRNA MAGI2-AS3(×400)

Note: ***.P<0.001.

圖3 過表達lncRNA MAGI2-AS3對Fas、FasL mRNA表達水平的影響Fig.3 Effects of overexpression of lncRNA MAGI2-AS3 on Fas and FasL mRNA expression levelsNote: ***.P<0.001.

2.4 過表達LncRNA MAGI2-AS3對神經(jīng)母細胞瘤細胞Fas、FasL mRNA的影響 qRT-PCR檢測過表達LncRNA MAGI2-AS3對SK-N-SH、SH-SY5Y細胞系中Fas、FasL mRNA表達的影響，結(jié)果顯示，過表達 LncRNA MAGI2-AS3后Fas、FasL mRNA表達水平顯著高于LV-NC組和control組(圖3A、B)，F(xiàn)as/FasL是腫瘤發(fā)生過程中的關(guān)鍵調(diào)控因子，由結(jié)果表明MAGI2-AS3可能通過抑制Fas/FasL信號轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制神經(jīng)母細胞瘤細胞增殖。

2.5 過表達LncRNA MAGI2-AS3對神經(jīng)母細胞瘤細胞增殖的影響 CCK-8檢測過表達LncRNA MAGI2-AS3后，SK-N-SH、SH-SY5Y細胞系的增殖情況，結(jié)果顯示，感染LV-MAGI2-AS3的兩個細胞系增殖率均顯著降低，顯著低于LV-NC組和control組，LV-NC組和control組無顯著變化(圖4A、B)。

圖4 過表達lncRNA MAGI2-AS3對神經(jīng)母細胞瘤增殖的影響Fig.4 Effect of overexpression of lncRNA MAGI2-AS3 on proliferation of neuroblastomaNote: **.P<0.05,***.P<0.001.

表4 各組細胞凋亡率比較

Tab.4 Comparison of apoptotic rate in each group

GroupsSK-N-SHSH-SY5YControl6.38±1.106.65±1.22LV-NC7.16±1.217.32±1.26LV-MAGI2-AS312.68±2.431)2)13.16±2.441)2)

Note：Compared with control group,1)P<0.05;compared with LV-NC group,2)P<0.05.

2.6 過表達LncRNA MAGI2-AS3對神經(jīng)母細胞瘤細胞凋亡的影響 三組細胞凋亡率組進行比較，結(jié)果顯示LV-MAGI2-AS3z組細胞凋亡率顯著高于LV-NC組和control組，LV-NC組和control組凋亡率比較無顯著差異。詳見表4。

3 討論

神經(jīng)母細胞瘤是兒童較為常見的交感神經(jīng)系統(tǒng)的惡性腫瘤，其發(fā)病率在世界范圍內(nèi)正在增加。目前對腫瘤的治療主要是外科手術(shù)和化療，來延長患兒的生存時間，但治療方式具有嚴重的副作用。研究發(fā)現(xiàn)，多種基因與神經(jīng)母細胞瘤的發(fā)生發(fā)展相關(guān)，且腫瘤細胞的生長不僅與細胞增殖相關(guān)，還與細胞異常凋亡密切相關(guān)[7]。近年來發(fā)現(xiàn)，LncRNA的失調(diào)可能影響表觀遺傳信息，促進細胞的無限增長，進而導(dǎo)致腫瘤的生成[8]。但是LncRNA影響腫瘤的分子機制尚不清楚，因此LncRNA在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用備受關(guān)注。

基因調(diào)控對癌細胞活性具有重要作用，LncRNA可以調(diào)節(jié)腫瘤細胞的生物活性。特別是癌癥的轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后水平[9,10]。Liu 等[11]研究發(fā)現(xiàn)lncRNA GHET1通過上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)變(Epithelial mesenchymal transition)促進食管鱗癌細胞的增殖。Yu 等[12]報道，HOXA11-AS通過調(diào)節(jié)LATS1的表達促進肝細胞癌增殖。MAGI2是一種具有募集和錨定作用的支架蛋白，研究發(fā)現(xiàn)，MAGI2在腦組織中高表達，且是一種潛在的腫瘤抑制因子。研究報道，MAGI2抑制肝癌細胞的增殖、遷移及促進其凋亡[13]。Yang等[14]報道，lncRNA MAGI2-AS3 通過抑制乳腺癌細胞的增殖。本研究通過對神經(jīng)母細胞瘤患者的腫瘤組織和正常組織的檢測發(fā)現(xiàn)，lncRNA MAGI2-AS3在腫瘤組織中的表達顯著低于正常組織，且Fas、FasL的表達也處于低水平，這表明神經(jīng)母細胞瘤患者的腫瘤組織中l(wèi)ncRNA MAGI2-AS3處于低表達水平。還研究了MAGI2-AS3表達與神經(jīng)母細胞瘤患者臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系，結(jié)果表明lncRNA MAGI2-AS3與臨床分期、組織分化程度有關(guān)，且呈負相關(guān)。通過臨床參數(shù)和組織檢測發(fā)現(xiàn)lncRNA MAGI2-AS3在神經(jīng)母細胞瘤中具有重要作用。

為了進一步研究MAGI2-AS3在神經(jīng)母細胞瘤中的作用，我們用LV-MAGI2-AS3轉(zhuǎn)染神經(jīng)母細胞瘤細胞，以上調(diào)MAGI2-AS3的表達，結(jié)果顯示MAGI2-AS3表達上調(diào)。Fas是腫瘤壞死因子受體家族的細胞表面受體，通過與腫瘤壞死因子天然配體FasL相互作用，啟動外源性凋亡途徑誘導(dǎo)細胞凋亡，F(xiàn)as/FasL途徑是細胞凋亡的關(guān)鍵調(diào)控因子[15,16]。因此，F(xiàn)as/FasL通路在腫瘤抑制中起著重要的作用[17]。Zhang等[18]研究報道，LncRNA LIcN900152通過調(diào)控Fas表達誘導(dǎo)細胞凋亡，降低CSC細胞的存活率。lncRNA MAGI2-AS3 通過調(diào)控Fas/FasL通路促進乳腺癌細胞的凋亡。石萌等[19]報道，miRNA 通過Fas調(diào)控胃腸道腫瘤的凋亡。趙國棟等[20]報道，F(xiàn)as/FasL信號通路在PBDE-47誘導(dǎo)的SH-SY5Y細胞凋亡中具有重要作用。為了進一步闡明MAGI2-AS3抑制神經(jīng)母細胞瘤細胞生長的機制，我們對Fas、FasL mRNA的表達進行檢測，發(fā)現(xiàn)過表達MAGI2-AS3后Fas、FasL mRNA表達水平也顯著升高，表明MAGI2-AS3調(diào)節(jié)Fas和FasL的表達，激活MAGI2-AS3可以導(dǎo)致Fas/FasL通路的激活。且過表達后MAGI2-AS3后，CCK-8檢測發(fā)現(xiàn)細胞增殖率顯著低于LV-NC和control組，通過流式細胞儀檢測發(fā)現(xiàn)細胞凋亡率顯著高于LV-NC和control組。根據(jù)這些結(jié)果表明，MAGI2-AS3在腫瘤組織中低表達，且其抑制Fas、FasL mRNA的表達，其可能是通過Fas/FasL信號通路而潛在地抑制神經(jīng)母細胞瘤的生長。

綜上所述，lncRNA MAGI2-AS3、Fas、FasL在神經(jīng)母細胞瘤組織和細胞系中均低表達，過表達lncRNA MAGI2-AS3引起Fas、FasL的表達上調(diào)，表明MAGI2-AS3可能通過抑制Fas/FasL信號通路而潛在地抑制神經(jīng)母細胞瘤的生長，但是其具體的作用機制有待進一步研究。