紀榮靜 趙永輝 藏小彪 張靜 王現(xiàn)青 馬繼芳 宋衛(wèi)峰

隨著膜片鉗技術(shù)的逐漸推廣和心肌細胞電異質(zhì)性等研究領(lǐng)域的發(fā)展，心肌細胞已成為各類心血管疾病結(jié)構(gòu)重構(gòu)和電重構(gòu)機制研究的重要部分。尤其是對犬等大型動物的心肌細胞的電生理特性的研究越來越多，也越來越精細。目前分離的犬心房肌細胞即刻存活率為80%～90%，復(fù)鈣至1.0 mmol/L KB液中靜置72 h存活約70%左右[1-2]；分離犬心室肌細胞即刻存活率為60%～80%[3-4]，復(fù)鈣后存活40%～60%。成功分離出高活性和高產(chǎn)量的犬心室肌三層心肌細胞并使其保持良好狀態(tài)是決定整個實驗成敗的核心環(huán)節(jié)。因此，尋求一種簡單、經(jīng)濟、高效的分離和鑒別大型動物心肌細胞的方法已成為當務(wù)之急。筆者借鑒前人的經(jīng)驗，根據(jù)文獻[3,5]的方法對實驗裝置、灌流液成分、酶液成分及消化時間的判斷等方面加以改進，摸索出簡單、高效的分離方法，并應(yīng)用全細胞膜片鉗技術(shù)對正常和肥厚左室三層心肌細胞動作電位(AP)內(nèi)、外向離子流進行研究，旨在為研究治療哺乳類動物心血管疾病的新型藥物提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1實驗動物

成年健康比格犬15只，體重12 ～15 Kg，由南京亞東實驗動物研究中心提供，編號：NO.201708679。

1.2主要試劑

Ⅱ型膠原酶(collagenease type Ⅱ-Gibco 17101-015 315.00 uints/mg)為Gibco Biochemical公司產(chǎn)品，HEPES(4-羥乙基哌嗪乙磺酸，J3015)為Santa cruz Biotechnology公司產(chǎn)品，Mg-ATP(SLBR2781V)、Na2-ATP(A1852)、K-Gluconate(110M0003V)、Phosphocreatine disodium salt(磷酸肌酸二鈉鹽P7936)、Nifedipine(N7634)、TEA-Cl(氯化四乙胺T2265)、多聚賴氨酸(polylysine SLBV1703)、Taurine(?；撬?，SLBS2001V)、EGTA(乙二醇二乙醚二胺四乙酸，SLBR7504)均為Sigma Biochemical公司產(chǎn)品，其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.3溶液配制(單位：mmol/L)

無鈣Tyrode′s液：NaCl 137.0、KCl 5.4、HEPES 20.0、MgCl2·6H2O 1.2、NaH2PO4·2H2O 1.2、Glucose 10.0、Taurine 10.0，用NaOH調(diào)節(jié)批pH值至7.35 ～7.40。Tyrode′s液：CaCl21.0，其他成分與無鈣Tyrode′s液相同。KB液：KOH 80.0、KCl 30.0、L-Glutamic 50.0、MgCl2·6H2O 1.0、HEPES 10.0、Glucose 10.0、KH2PO420.0、Taurine 20.0、EGTA 0.5,用KOH調(diào)節(jié)pH至7.35～7.40。酶液：無鈣Tyrode′s液(mmom/L)+II型膠原酶(0.9～1.0mg/ml)+BSA (1.0mg/ml)。CaCl2儲液 200.0 mmol/L、BSA儲液 100 mg/ml。

AP內(nèi)液：NaCl 5.0、K-Gluconate 140.0、CaCl20.1、MgCl21.0、HEPES 10.0、D-Glucose 10.0、EGTA 1.0、Mg-ATP 2.0，用KOH調(diào)節(jié)pH值至7.20。AP外液：NaCl 140.0、KCl 3.5、HEPES 10.0、NaH2PO41.25、MgCl2·6H2O 1.0、CaCl22.0，用NaOH調(diào)節(jié)pH值至7.40。

快激活延遲整流鉀電流(IKr)細胞外液：NaCl 135、CdCl20.2、 CsCl 1、KCl 5.4、HEPES 15、BaCl20.2、D-glucose 5.5、 NaH2PO40.4、 MgCl21、 CaCl21.8，用NaOH調(diào)節(jié)pH值至7.40。細胞內(nèi)液：KCl 120、MgCl21、EGTA 5、Phosphocreatine disodium salt 14、 Na2-ATP 5、用KOH調(diào)節(jié)pH值至7.20。

慢激活延遲整流鉀電流(IKs)細胞外液：Choline chloride 115、 NaCl 20、CaCl21.8、MgCl21、CsCl 5.4、D-glucose 10、HEPES 10、BaCl20.3、CdCl20.1，用NaOH調(diào)節(jié)pH值至7.40。細胞內(nèi)液：KCl 20、K-Aspartic 115、MgCl21、EGTA 5、HEPES 10、Na2-ATP 2，用KOH調(diào)節(jié)pH值至7.20。

晚鈉電流(INa-L)細胞外液： NaCl 140、CsCl 5.4、MgCl21、CaCl21.8、BaCl20.3、D-glucose 10、HEPES 10、NaH2PO40.33，用NaOH調(diào)節(jié)pH值至7.40。使用前加10 μol/L Nifedipine 阻斷鈣電流。細胞內(nèi)液： CsCl 120、TEA-Cl 10、CaCl21、MgCl25、HEPES 10、EGTA 10、Na-ATP 5，用CsOH調(diào)節(jié)pH值至7.20。Buffer A：含0.05 mmom/L CaCl2的KB液。Buffer B：含1.0mmol/L CaCl2的KB液。

以上所有溶液均使用無菌去離子水配制，使用前通以100%氧氣。且所有配制好的溶液均經(jīng)0.22μm濾膜過濾除菌。同時遵循無菌操作原則。

1.4器械和儀器

臺式低速自動平衡離心機(YIDA TDZ5M)、臺式高速冷凍離心機(YIDA TGL20M)、改良Langendorff裝置(自制)、離體心臟灌流蠕動泵(LongerPump BT100-2J)、膜片鉗倒置顯微鏡(OLYMPUS IX71)、膜片鉗放大器(HEKA EPC 10USB)、微操縱儀(SUTTER MP-285)、膜片鉗恒溫器(WARRNER TC-334B)、膜片鉗蠕動泵(LeadFluid BT100L)、玻璃微電極拉制儀(SUTTER P-97)、玻璃毛細管(SUTTER BF150-86-10 10cm)，其他器械均為中國制造。

1.5實驗方法

1.5.1準備 依次用75%的酒精、無菌超純水、有鈣臺氏液以恒定的12 ml/min流速沖洗 改良Langendorff灌流裝置(圖1A)各15 min。排除灌流裝置內(nèi)的氣泡和雜質(zhì)。同時，將恒溫水浴裝置的溫度設(shè)置為43℃，使灌流液經(jīng)自制蛇形管流出的溫度達到并維持37℃。并且將所有的灌流液以100% O2充灌至少30 min。

1.5.2獲取犬左室灌流組織塊和單個心室肌細胞 參考Tadevosyan等[5]的手術(shù)方法和灌流方法，稱重、麻醉，打開胸腔取出心臟，將心臟置于預(yù)冷的Buffer A中，從主動脈確定主動脈左竇的位置，保留左竇，并以其為起點中心，向下成輻射狀保留左前降支，去除右心室及大部分室間隔。將左室灌流組織塊經(jīng)主動脈左冠竇懸掛于改良Langendorff裝置上(圖1B)。以12 ml/min的速度灌流Buffer B，此時將左回旋支、右側(cè)冠狀動脈及可見的血管斷端全部結(jié)扎(圖1C)，使心肌組織內(nèi)的灌流壓升高。待Buffer B灌流約2 min后，灌流無鈣臺氏液，約5 min后，灌流酶液3～5 min心臟開始拉絲即可開始循環(huán)灌流。酶液循環(huán)灌流約15 min時取下一小塊組織觀察，若有大量單細胞散落，且橫紋清晰，即可終止消化。

A:改良Langendorff裝置。B：經(jīng)主動脈左冠竇沿左前降支走行的方向，懸掛并固定左室心肌組織塊。C：用4-0縫合線依次將左冠狀動脈回旋支及前降支各分支斷端結(jié)扎，進行灌流，心肌組織逐漸漲大，表面繃緊、光滑

圖1灌流裝置及灌流組織處理

室溫下，取下心肌組織，放入盛有100% O2飽和KB液的玻璃皿中，分三層剪下心肌組織，外層(Epi)：外膜面至其下2 mm；中層(Mid)：外膜面下2～7 mm；內(nèi)層(Endo)：內(nèi)膜面至其下2 mm。注意剪取內(nèi)中外三層心肌組織時，使用不同的眼科剪。將剪下的三層心肌組織分別放于預(yù)先標記好的盛有100%O2飽和KB液的40 ml小燒杯中。三層心室肌用各自的眼科剪剪成1 mm3左右絮狀塊，再用各自吸管輕輕吹打，使細胞分散。將吹打后的組織靜置1 min，將懸濁液吸入15 ml離心管中，500 r/min、離心30～40 s，去除上清液，保留沉淀。

向上述離心管中按3∶1、2∶1、1∶1、0∶1的比例加入Buffer A和Buffer B復(fù)鈣。每次復(fù)鈣重旋后，靜置5 min， 然后500 r/min、離心30～40 s，去除上清液，保留沉淀。重復(fù)上述步驟，直至最后一次復(fù)鈣，重旋，靜置5 min后，將混懸液均勻鋪于經(jīng)多聚賴氨酸處理的盛有細胞爬片的3.5 cm培養(yǎng)皿中。將培養(yǎng)皿置于4℃冰箱靜置1 h。

1.5.3全細胞膜片鉗技術(shù) 用微電極拉制儀將毛細玻璃管拉制成記錄電極。采用Hammill等[6]膜片鉗全細胞記錄方法，在倒置顯微鏡下操縱微電極操縱儀將記錄電極接觸到細胞上，給予負壓抽吸，形成高阻抗封接。形成高阻抗封接后進行快速電容補償，然后繼續(xù)給予負壓，吸破細胞膜，形成全細胞記錄模式。然后進行慢速電容的補償并記錄膜電容及串聯(lián)電阻。不給予漏電補償。記錄快激活延遲整流鉀電流(IKr),慢激活延遲整流鉀電流(IKs),晚鈉電流( INa-L)，電流記錄在室溫下進行，AP在37℃條件下記錄。實驗數(shù)據(jù)由 EPC-10 放大器進行采集并儲存于PatchMaster 軟件中。各電流具體刺激方案見相應(yīng)電流圖。各電流根據(jù)不同膜電壓下相應(yīng)的電流密度繪制電流-電壓(I-V)曲線。

1.6數(shù)據(jù)測量和統(tǒng)計分析 用Patch Maste+Clampfit(Version 10.6.2.2，HEKA)軟件進行曲線測量，所有數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差表示。用SPSS24．0統(tǒng)計軟件進行單因素方差分析，以P<0.05為差異有顯著性。

2 結(jié)果

2.1心室肌細胞的分離情況

分離即刻，光鏡下可見95%左右的心室肌細胞狀態(tài)良好(圖2A)，呈桿狀或矩形，邊緣整齊，具有橫紋清晰，表面光滑、穩(wěn)定無收縮、折光性好、立體感強 。室溫下靜置3 h后，仍存活90%左右。復(fù)鈣到1.0 mmol/L，4℃冰箱靜置1～2 h后，約20%左右的細胞發(fā)生自發(fā)性收縮或死亡，細胞皺縮變?yōu)榍蛐危?0%左右的細胞可用于膜片鉗實驗(圖2B)。存活的細胞在含1 mmol/L CaCl2的KB液中可存活10 h以上。在靜息狀態(tài)下，心肌細胞不發(fā)生自發(fā)性收縮；不同強度的電刺激下，心肌細胞產(chǎn)生收縮，細胞收縮的方向與細胞長軸方向一致或平行(圖2C、D)。

A：心室肌細胞分離后即刻存活率約95%左右；B：復(fù)鈣到1.0 mmol/L，4℃冰箱靜置1～2 h后，約20%左右的細胞發(fā)生自發(fā)性收縮或死亡，細胞皺縮變?yōu)榍蛐危?0%左右的細胞可用于膜片鉗實驗 ；C：高倍鏡下心肌細胞的形態(tài)；D：膜片鉗下心肌細胞形態(tài)

圖2不同情況下的鏡下細胞狀態(tài)

2.2三層心肌細胞AP比較 Endo細胞AP復(fù)極50%的時程(APD50)分別短于Mid和Epi細胞APD50(P<0.5)，而Mid細胞與Epi細胞無差異(P>0.5)；Mid細胞AP復(fù)極90%的時程(APD90)長于Epi與Endo細胞(P<0.05),而Epi與Endo細胞無差異(P>0.05)(見表1和圖3)。

表1 正常犬心室肌三層細胞的APD90、APD50/ms

注：與Endo、Epi比較，#P<0.01，*P<0.05；與Endo比較，△P<0.05

2.3三層心肌細胞的INa-L、IKr、IKs

三層細胞中INa-L極小或幾乎測不到(圖4A)。在-30 mV電壓下，Mid細胞INa-L電流密度較Endo、Epi稍大，但三者之間無統(tǒng)計學(xué)差異[(-0.198±0.087) pA/pF vs (-0.174±0.124；-0.178±0.088) pA/pF](圖4B)；Mid細胞IKr的電流密度峰值較Epi和Endo細胞稍大，但無統(tǒng)計學(xué)差異[(1.342±0.46) pA/pF vs (1.158±0.211 ;1.038±0.513) pA/pF](圖5A、B)；Mid細胞中IKs電流密度峰值最小，與Endo、Epi存在明顯差異[(2.318±0.370) pA/pF vs (3.586±2.176；3.756±0.778) pA/pF，P<0.05](圖6A、B)。

AP刺激方案：將細胞記錄轉(zhuǎn)換為電流鉗模式(C-Clamp)下，維持在0pA。用時程為10 ms的600pA刺激電流激發(fā)出動作電位(具體的刺激強度根據(jù)每一個細胞有所差異，由先導(dǎo)的檢測刺激確定),記錄APD90

圖3內(nèi)、中、外三層心室肌細胞APD90典型圖

4 討論

本實驗Langendorff裝置由小水浴鍋、蠕動泵、五口蛇形套管、水浴燒杯組成。與郭凱等[4]試驗中應(yīng)用的Langendorff裝置相比，利用蠕動泵控制灌流壓力，比通過高度梯度更精確，更能滿足不同情況下灌流需要。將灌流液放于水浴燒杯中并且利用蛇形套管的逆向?qū)α髯饔?，使其溫度穩(wěn)定在36.5℃～37.5℃。蛇形管下端接由8號灌胃針制成的冠脈插管，不會被止血鉗夾閉或夾碎。整套裝置相對小巧、可拆分，完全可移至無菌操作臺下進行操作，從而分離得到無菌灌流的單個細胞。

A：-30mv電壓下內(nèi)、中、外三層心肌細胞INa-L的典型電流圖及其整合圖;B:三層心肌細胞INa-L的I-V曲線圖；C：INa-L刺激方案簡圖

圖4三層心室肌細胞INa-L及I-V曲線

A：內(nèi)、中、外層IKr典型圖電流圖; B: IKr的I-V曲線;C：IKr刺激方案

A：內(nèi)、中、外層IKs典型圖電流圖; B: IKs 的I-V曲線;C：IKs刺激方案

通過參考Tadevosyan等[5]分離心肌細胞的方法，筆者利用改良的Langendorff灌流裝置，不斷摸索酶液成分、濃度及酶液灌流時間；總結(jié)出獲得高產(chǎn)量、高活性心肌細胞時心肌組織的狀態(tài)，以進一步明確灌流成功的終點。首先，筆者研究對象為大型哺乳動物，心臟體積較嚙齒類動物(如：大鼠、豚鼠等)心臟體積大，既往王如興等[7]研究方法為經(jīng)主動脈逆行全心灌流分離細胞，此方法于本實驗不可行。根據(jù)文獻[4,8]，經(jīng)摸索，筆者采用經(jīng)主動脈左冠竇灌流左室前降支供血的心肌組織塊法，既可獲取高活性的耐鈣心肌細胞，又節(jié)省實驗材料，縮短試驗時間。其次，酶液中未添加任何類型的蛋白酶，因為蛋白酶易破壞心肌細胞膜上的蛋白質(zhì)，影響膜結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性，從而降低細胞的活性及耐鈣性，影響心肌細胞電生理的研究。酶液的濃度控制在0.9～1.0 mg/ml，從灌流標準Tyrode′s液開始至灌流終點僅歷時30 min，酶液灌流僅歷時18～23 min，節(jié)約了實驗時間。避免因酶濃度太低，灌流時間過長，而使心肌細胞活性降低；也避免了因酶濃度過高，消化時間不好控制，易發(fā)生消化過度，以上均影響心肌細胞的活性和產(chǎn)量，進而影響后續(xù)實驗的進行。關(guān)于實驗終點的判斷，筆者總結(jié)出，在酶液進行灌流時，當心肌組織開始拉絲后，再灌流15～16 min，可獲得95%以上的高活性心肌細胞；期間，心肌組織的顏色由暗紅色變?yōu)榈凵?，用眼科鑷尖端扎心肌組織會感覺到組織由韌變軟，用眼科剪剪取組織，呈糜狀，鏡下觀察均為桿狀、橫紋清晰、邊緣規(guī)整的單個心肌細胞。酶液消化在分離單個心肌細胞過程中至關(guān)重要：酶消化不足，細胞耐鈣性差，覆蓋后，存活率低；酶消化時間過長，細胞耐鈣，但橫紋溶解，膜片鉗實驗時不易高阻抗封接，不易進行破膜。

筆者證實犬左室游離壁內(nèi)、外膜及中層細胞之間存在明顯的跨室壁復(fù)極異質(zhì)性，中層細胞APD比內(nèi)、外心室肌細胞明顯延長，與既往研究的結(jié)論相一致[9-10]。中層細胞有明顯長的APD，可能與某些離子流有關(guān)，比如：IKs、INa-L、INa-Ca[9,11-12]。IKr在犬三層心肌細胞間無差異，在中層細胞APD較長和慢頻率依賴性所起的作用不大，與Viswanathan等[12]的實驗結(jié)果一致；而IKs在中層細胞較心內(nèi)、外膜層肌細胞小，使復(fù)極過程延長，APD明顯延長[11]。與Suthedand等[13]以及李泱等[14]在兔、鼠心室肌細胞中記錄到的IKr、IKs的特性相一致。正常犬三層心肌細胞的INa-L無明顯差異，與Zygmunt等[9]報道的中層細胞中有較大的INa-L這一結(jié)論不一致，但在Wasserstrom等[15]的實驗中發(fā)現(xiàn)INa-L在正常犬三層心肌細胞中并沒有明顯不同。關(guān)于正常三層心室肌細胞INa-L是否存在差異，可能與實驗對象的種屬、性別、年齡等因素有關(guān)，還需進一步實驗研究。