謝忠利 李 旦 陳遠(yuǎn)書(shū) 于相君 古 旭 何承忠

( 1. 西南林業(yè)大學(xué)云南省高校林木遺傳改良與繁育重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 昆明 650233；2. 西南林業(yè)大學(xué)云南生物多樣性研究院，云南 昆明 650233)

云南松（Pinus yunnanensis）為松科（Pinaceae）松屬（Pinus）常綠喬木，是以云南省為分布中心的西南山地特有樹(shù)種[1]，主要分布于北緯23°～29°，東經(jīng)96°～108°，為木材與樹(shù)脂生產(chǎn)的主要樹(shù)種，其產(chǎn)品涵蓋造紙、栲膠、醫(yī)藥等領(lǐng)域，對(duì)生態(tài)建設(shè)和經(jīng)濟(jì)建設(shè)有舉足輕重的作用[2]。然而現(xiàn)存的云南松優(yōu)株數(shù)量極少，彎、扭木衰退現(xiàn)象明顯，制約云南松經(jīng)濟(jì)效益、生態(tài)效益和社會(huì)效益的發(fā)揮。同時(shí)，云南松優(yōu)株的結(jié)實(shí)率低，種子繁殖后代分化嚴(yán)重，扦插生根困難成活率低，嫁接技術(shù)要求高難以推廣。通過(guò)離體培養(yǎng)技術(shù)實(shí)現(xiàn)快速繁殖，不僅可推進(jìn)優(yōu)良苗木大規(guī)模高效繁殖和商業(yè)化生產(chǎn)，實(shí)現(xiàn)松樹(shù)良種品種化應(yīng)用的捷徑，還可為松樹(shù)遺傳改良過(guò)程中的分子育種搭建平臺(tái)，也能為種質(zhì)資源的中長(zhǎng)期保存提供參考[3]。

自1985年，Hakman等[4]從挪威云杉（picea abies）未成熟合子胚培養(yǎng)中首次獲得了體細(xì)胞胚及其再生植株以來(lái)，針葉類樹(shù)種的胚胎發(fā)生技術(shù)得以快速發(fā)展。截至目前已有糖松（Pinus lambertiana）[5]、濕地松（P. elliottii）[6]和紅松（P.koraiensis）[7]等30多種松屬樹(shù)種通過(guò)體胚發(fā)生途徑獲得了再生植株。但云南松體胚發(fā)生技術(shù)尚處于探索階段，還沒(méi)有再生植株的報(bào)道。大量研究表明，合子胚的發(fā)育階段直接影響著體胚誘導(dǎo)的成敗，大多數(shù)樹(shù)種的未成熟種子比成熟種子更容易誘導(dǎo)胚性愈傷組織。為此，本實(shí)驗(yàn)選取未成熟云南松種子作為外植體，探究不同外植體類型、采果母樹(shù)基因型、培養(yǎng)基等因素對(duì)云南松胚性愈傷組織誘導(dǎo)的影響，為云南松體胚發(fā)生技術(shù)體系建立奠定基礎(chǔ)，也為進(jìn)一步開(kāi)展云南松優(yōu)株規(guī)模化育苗提供一種周期短、繁殖率高、性狀穩(wěn)定的方法。

1 材料與方法

1.1 材料采集及處理

于2015年7月8日起從西南林業(yè)大學(xué)后山采集12株云南松的球果用于合子胚發(fā)育階段研究，球果采集間隔4 d，每棵樹(shù)共計(jì)采集5次。在篩選出最適種子采集時(shí)間后，于第2年從云龍縣天池國(guó)家自然保護(hù)區(qū)采集8棵云南松優(yōu)株未成熟球果，依次編號(hào)為 072、073、074、075、076、078、079、080，每棵采15～20個(gè)未成熟球果，用于胚性愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基篩選和基因型影響研究。2個(gè)研究階段的球果帶回實(shí)驗(yàn)室，用75%乙醇溶液浸泡8 min，加硅膠密封后存放于4 ℃冰箱中，備用。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 種子表面消毒實(shí)驗(yàn)

將新鮮球果剖開(kāi)取出未成熟種子，將其放入培養(yǎng)瓶中加洗滌劑流水沖洗2 h，之后采用3種方法在超凈工作臺(tái)中進(jìn)行種子表面消毒處理，分別為處理1：75%乙醇溶液消毒3 min，無(wú)菌水沖洗2～3次，0.1%升汞浸泡10 min，無(wú)菌水沖洗4～5次；處理2：75%乙醇溶液消毒30 s，無(wú)菌水沖洗2～3次，2%次氯酸鈉浸泡15 min，無(wú)菌水沖洗4～5次；處理3：75%乙醇溶液消毒30 s，無(wú)菌水沖洗2～3次，0.1%升汞浸泡10 min，無(wú)菌水沖洗4～5次。外植體經(jīng)消毒處理后接種在培養(yǎng)上，每皿接種10個(gè)外植體，接種接2皿，3次重復(fù)。接種21 d后觀測(cè)統(tǒng)計(jì)污染率和成活率。

1.2.2 不同采果時(shí)期的合子胚發(fā)育狀態(tài)觀測(cè)

取出保存于4 ℃的不同時(shí)期采集的球果，把球果剖開(kāi)，剝?nèi)∏蚬胁糠N子，用鑷子和剪刀去除種殼，解剖針挑出合子胚，將合子胚置于體視熒光顯微鏡下（M165FC），觀察合子胚形狀并拍照，根據(jù)前人的研究[8]劃分合子胚的發(fā)育時(shí)期。每株采果母樹(shù)每個(gè)采果時(shí)期觀測(cè)20粒種子。

1.2.3 外植體類型篩選實(shí)驗(yàn)

參照前人研究結(jié)果和本實(shí)驗(yàn)對(duì)合子胚發(fā)育狀態(tài)觀測(cè)結(jié)果，根據(jù)吳濤等[8]對(duì)云南松合子胚發(fā)育階段的劃分，選擇合子胚處于第Ⅲ和第Ⅳ發(fā)育階段的1株采果母樹(shù)種子進(jìn)行外植體類型篩選研究。在超凈工作臺(tái)中將表面消毒處理后的種子去除種殼，分別剝?nèi)呷榈暮献优遊4]和合子胚作為外植體，接種于以1/2Y為基本培養(yǎng)基，添加2,4-D 1.1 mg/L，6-BA 0.4 mg/L，KT 0.4 mg/L，AgNO33.4 mg/L，活性炭50 mg/L，肌醇20 g/L，谷氨酰胺（Gln）0.5 g/L，水解酪蛋白（CH）0.5 g/L，蔗糖30 g/L，植物凝膠2.0 g/L的胚性愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基中進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)。2種外植體類型，每皿接種5個(gè)外植體，接種7皿為7個(gè)重復(fù)，共接種14皿。培養(yǎng)21 d后觀測(cè)統(tǒng)計(jì)胚性愈傷組織誘導(dǎo)率。

1.2.4 適宜培養(yǎng)基篩選和母樹(shù)基因型的影響實(shí)驗(yàn)

將8株云南松優(yōu)株的種子進(jìn)行表面消毒處理后，參考其他針葉樹(shù)體細(xì)胞胚誘導(dǎo)的成功試驗(yàn)設(shè)計(jì)[2-7,9-13]，將帶胚乳的合子胚接種在以MLV、1/2LM、LM、1/2Y、S、DCR為基本培養(yǎng)基，添加2, 4-D（0.5、1.0、1.1、1.8、2.0、2.2、8.0 mg/L），6-BA（0.32、0.4、0.5、0.63、1.0、1.1、1.5 mg/L），KT（ 0.3、 0.4、 0.5、 0.61、 1.0 mg/L）， NAA（2.0 mg/L），AgNO3（3.4 mg/L），活性炭（50 mg/L），肌醇（0.1、0.2、1.0、20 g/L），麥芽糖（15 g/L），谷氨酰胺（Gln）0.5 g/L，水解酪蛋白（CH）0.5 g/L，蔗糖30 g/L（添加麥芽糖者除外），植物凝膠2.0 g/L，共計(jì)14種配比組合的誘導(dǎo)培養(yǎng)基。每株采果母樹(shù)接種3皿，每皿接種5個(gè)外植體，3次重復(fù)，培養(yǎng)21 d后觀測(cè)胚性愈傷組織產(chǎn)生情況，并計(jì)算誘導(dǎo)率。

1.2.5 胚性愈傷組織鑒定

取少量可能胚性愈傷組織采用醋酸洋紅染色，經(jīng)過(guò)制片處理后，在體視熒光顯微鏡（M165FC）和徠卡正置熒光顯微鏡（DM2500）下進(jìn)行觀察。誘導(dǎo)出的愈傷組織分為2種類型。一種為非胚性愈傷組織，形態(tài)表現(xiàn)為淺黃色或黃色，透明半透明，表面粗糙伴有結(jié)節(jié)顆粒，無(wú)絲狀組織產(chǎn)生。制成玻片，在顯微鏡下觀察到此類細(xì)胞未能被醋酸洋紅染色，且細(xì)胞較大，近圓形，結(jié)構(gòu)致密。另一種為胚性愈傷組織，形態(tài)表現(xiàn)為淺白或白色，有透明絲狀組織產(chǎn)生，結(jié)構(gòu)較為疏松，繼代培養(yǎng)后晶瑩剔透。制成玻片，在顯微鏡下觀察到此類細(xì)胞能夠被醋酸洋紅溶液染為紅色，且細(xì)胞核大，胞質(zhì)濃厚，具有分化能力。

1.2.6 培養(yǎng)條件

將接種后的培養(yǎng)皿置于（25±3）℃的培養(yǎng)室內(nèi)進(jìn)行暗培養(yǎng)，濕度75%～85%。培養(yǎng)21 d后取出，觀測(cè)統(tǒng)計(jì)愈傷組織誘導(dǎo)情況。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

采用Excel 2007和SPSS 22.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)的整理與分析。多重比較采用Duncan’s新復(fù)極差測(cè)驗(yàn)法進(jìn)行顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 消毒體系對(duì)外植體污染的影響

大量文獻(xiàn)表明，升汞具有較好的滅菌效果，但滅菌清洗后難除殘毒，對(duì)處理材料有毒害作用，影響其成活或生長(zhǎng)。采用處理1和處理3作消毒處理后，接種培養(yǎng)21 d的帶胚乳的合子胚污染率均為0%，但其存活率也低，分別為43.67%和56.33%；采用處理2消毒處理后，帶胚乳的合子胚污染率為3.3%，而其存活率達(dá)到86.89%，極顯著高于處理1和處理3（表1）。綜合考慮，選擇處理2，即75%乙醇溶液消毒30 s，無(wú)菌水沖洗2～3次，2%次氯酸鈉浸泡15 min，無(wú)菌水沖洗4～5次較適宜用于種子表面消毒，其污染率可控制在3.3%以內(nèi)，滿足后續(xù)實(shí)驗(yàn)要求。

表 1 3種消毒方法對(duì)外植體污染的影響Table 1 Effects of 3 disinfection methods on explants pollution

2.2 不同采果時(shí)期的合子胚發(fā)育狀態(tài)

吳濤等[8]將云南松合子胚發(fā)育分為8個(gè)階段。本實(shí)驗(yàn)5個(gè)不同采果時(shí)期的球果整體呈綠色，基部略顯黃褐色，種子的種殼外觀為淺黃色，質(zhì)地軟。在解剖鏡下觀察合子胚，2015年7月8日采集球果的種子合子胚95%以上處于第Ⅰ和第Ⅱ發(fā)育階段；而7月12日的種子合子胚有85%以上處于第Ⅱ和第Ⅲ發(fā)育階段；到7月16日，75%的種子合子胚處于第Ⅲ 和第Ⅳ發(fā)育階段。處于第Ⅰ～Ⅳ發(fā)育階段的合子胚，胚體半透明，輪廓尚不分明，頂端突起、圓頂形；7月20日時(shí)，大部分未成熟胚的頂端分生組織原基明顯可見(jiàn)，子葉原基開(kāi)始顯露，但未超過(guò)頂端莖尖分生組織，75%處于階段Ⅴ～Ⅵ；7月24日的合子胚已經(jīng)接近成熟，子葉逐漸成形，相互間可見(jiàn)明顯的縫隙，但合子胚發(fā)育的不同步性非常明顯，能觀察到云南松合子胚發(fā)育的全部8個(gè)時(shí)期，其中70%處于Ⅶ～Ⅷ 階段（圖1），處于發(fā)育Ⅰ～Ⅱ階段約為5%。

圖 1 云南松合子胚發(fā)育階段Fig. 1 Zygote embryo of P. yunnanensis in development stages

2.3 不同外植體類型對(duì)胚性愈傷組織誘導(dǎo)的影響

以合子胚處于第Ⅴ～Ⅵ 階段的球果種子為材料，分別挑取帶胚乳的合子胚和合子胚作為外植體，培養(yǎng)21 d后觀測(cè)愈傷組織和胚性愈傷組織。結(jié)果表明，2種外植體類型均可產(chǎn)生愈傷組織和胚性愈傷組織。以合子胚為外植體時(shí)，愈傷組織誘導(dǎo)率高于帶胚乳的合子胚，但二者差異不顯著，而以合子胚為外植體的胚性愈傷組織誘導(dǎo)率低于帶胚乳的合子胚，且二者之間的胚性愈傷組織誘導(dǎo)率差異達(dá)極顯著水平（P＜0.01）。以帶胚乳合子胚為外植體胚性愈傷組織誘導(dǎo)率可達(dá)34.3%，以合子胚為外植體胚性愈傷組織誘導(dǎo)率為14.3%，說(shuō)明帶胚乳的合子胚更有利于云南松胚性愈傷組織誘導(dǎo)。

2.4 母樹(shù)基因型對(duì)胚性愈傷組織誘導(dǎo)率的影響

以云龍縣天池國(guó)家自然保護(hù)區(qū)8株云南松優(yōu)株為對(duì)象，取其合子胚處于第Ⅴ～Ⅵ發(fā)育階段帶胚乳的合子胚為材料，接種于14種培養(yǎng)基中，研究云南松采果母樹(shù)基因型對(duì)胚性愈傷組織誘導(dǎo)率的影響，結(jié)果見(jiàn)表2。

表 2 不同優(yōu)樹(shù)的胚性愈傷組織誘導(dǎo)效果Table 2 Effects of different elite trees on embryonic callus induction

從表2可看出：080號(hào)優(yōu)樹(shù)帶胚乳的合子胚在14種培養(yǎng)基上均能誘導(dǎo)出胚性愈傷組織，誘導(dǎo)率在4.8%～23.8%之間；其次是079和076號(hào)優(yōu)樹(shù)，各有1種培養(yǎng)基未能誘導(dǎo)出胚性愈傷組織；而072號(hào)優(yōu)樹(shù)有6種培養(yǎng)基不能誘導(dǎo)產(chǎn)生胚性愈傷組織。從14種培養(yǎng)基的通用性來(lái)看，6#培養(yǎng)基均能對(duì)8株優(yōu)樹(shù)誘導(dǎo)產(chǎn)生胚性愈傷組織，誘導(dǎo)率在4.8%～23.8%之間；而5#、9#和11#培養(yǎng)基各有3株優(yōu)樹(shù)不能誘導(dǎo)獲得胚性愈傷組織。8株優(yōu)樹(shù)在14種培養(yǎng)基上的胚性愈傷組織平均誘導(dǎo)率差異達(dá)極顯著水平，變異幅度在5.1%～19.5%之間，076號(hào)優(yōu)樹(shù)具有最高誘導(dǎo)率，而075號(hào)優(yōu)樹(shù)的誘導(dǎo)率最低，二者之間差異極顯著。由此可知，基因型對(duì)云南松胚性愈傷組織誘導(dǎo)具有極顯著影響。

2.5 培養(yǎng)基對(duì)胚性愈傷組織誘導(dǎo)的影響

以8株云南松優(yōu)樹(shù)帶胚乳的合子胚為外植體，接種于14種培養(yǎng)基，暗培養(yǎng)21 d后的愈傷組織誘導(dǎo)率和胚性愈傷組織誘導(dǎo)率見(jiàn)表3。14種培養(yǎng)基均能誘導(dǎo)出愈傷組織和胚性愈傷組織，且愈傷組織誘導(dǎo)率較高者，誘導(dǎo)產(chǎn)生胚性愈傷組織的可能性也較大，但2類愈傷組織誘導(dǎo)率之間不完全相關(guān)，如1#、6#、8#和12#培養(yǎng)基的愈傷組織誘導(dǎo)率較高，在50.5%～59.3%之間，最大值出現(xiàn)12#培養(yǎng)基，最小值出現(xiàn)在8#培養(yǎng)基，差異不顯著，但該4種培養(yǎng)基的胚性愈傷組織誘導(dǎo)率變化范圍為12.1%～17.6%，最大值出現(xiàn)在6#培養(yǎng)基，最小值出現(xiàn)在1#培養(yǎng)基，且差異達(dá)顯著水平。結(jié)合愈傷組織和胚性愈傷組織誘導(dǎo)率，云南松未成熟胚的胚性愈傷組織誘導(dǎo)適宜培養(yǎng)基為3#、6#和12#。

表 3 不同培養(yǎng)基的胚性愈傷組織誘導(dǎo)效果Table 3 Effects of different media on embryonic callus induction

2.6 胚性愈傷組織的形態(tài)特征

接種在1/2Y+2, 4-D 1.1 mg/L+6-BA 0.4 mg/L+KT 0.4 mg/L+AgNO33.4 mg/L+活性炭 50 mg/L+肌醇20 g/L+谷氨酰胺（Gln）0.5 g/L+水解酪蛋白（CH）0.5 g/L+蔗糖30 g/L+植物凝膠2.0 g/L誘導(dǎo)培養(yǎng)基中3 d后，合子胚開(kāi)始響應(yīng)，具體表現(xiàn)為胚膨大，胚軸基部有褐色突起出現(xiàn)，子葉分化出“點(diǎn)狀突起”，7 d后接種的合子胚發(fā)育形成愈傷組織（圖2a），15 d后胚性愈傷組織開(kāi)始出現(xiàn)，連同非胚性愈傷組織逐漸長(zhǎng)大（圖2b）。帶胚乳的合子胚響應(yīng)晚于合子胚，將其接種在3號(hào)培養(yǎng)基中，7 d后開(kāi)始膨大，珠孔末端有“突起”（圖2c），15 d后“突起”生長(zhǎng)明顯，長(zhǎng)出晶瑩剔透的白色柱狀物（圖2d）。誘導(dǎo)出的愈傷組織分為2種類型，一種為非胚性愈傷組織，表現(xiàn)為淺黃或黃色（圖2e），透明或半透明，表面粗糙或?yàn)榻Y(jié)節(jié)狀；另一種為胚性愈傷組織，形態(tài)特征為顏色淺白或白色，半透明，結(jié)構(gòu)較為疏松，表面透明絲狀，經(jīng)繼代培養(yǎng)后常晶瑩剔透（圖2f），醋酸洋紅染色后可觀察到胚性胚柄團(tuán)（圖2h、i），通常細(xì)胞較小，近圓形，細(xì)胞核較大，胞質(zhì)濃厚，具分化能力。

圖 2 胚性愈傷組織的形態(tài)特征Fig. 2 Morphological characteristics of embryogenic callus

3 結(jié)論與討論

大量研究表明，不同的外植體消毒處理方法對(duì)其污染率和愈傷組織誘導(dǎo)有顯著影響。本實(shí)驗(yàn)篩選出來(lái)的最佳消毒處理為75%乙醇溶液消毒30 s，無(wú)菌水沖洗2次，2%次氯酸鈉浸泡15 min，無(wú)菌水沖洗4～5次，其污染率可控制在3.3%，與齊力旺[9]的相比對(duì)外植體的毒害作用更小，成活率更高，可以節(jié)約大量時(shí)間[10]，同時(shí)污染率比白卉等[11]的低。其次，次氯酸鈉能分解產(chǎn)生具有殺菌能力的氯氣，易除去，對(duì)環(huán)境的影響也較小，又易購(gòu)買，故選擇次氯酸鈉為處理云南松種子的滅菌劑。

趙曉敏等[12]在探究影響興安落葉松胚性愈傷組織誘導(dǎo)的因子中發(fā)現(xiàn)，興安落葉松帶胚乳的合子胚培養(yǎng)有利于胚性愈傷組織的誘導(dǎo)。本實(shí)驗(yàn)采用兩種類型外植體，以帶胚乳的合子胚為外植體，其誘導(dǎo)率是合子胚外植體的兩倍，這與上述結(jié)論相似。但Thompson等[2]在西部落葉松體細(xì)胞發(fā)生的研究中，采用了4種類型幼胚進(jìn)行接種培養(yǎng)，認(rèn)為直接培養(yǎng)帶胚乳合子胚沒(méi)有形成胚性培養(yǎng)物，而接種合子胚能誘導(dǎo)出胚性培養(yǎng)物，且誘導(dǎo)率為4種尖型幼胚中最高，達(dá)32%，產(chǎn)生這種差異的可能是物種不同造成的。

母樹(shù)效應(yīng)是影響體細(xì)胞胚胎發(fā)生的內(nèi)在因素，是不可忽略的。Egertsdotter[13]的研究表明，針葉樹(shù)種多為頑拗型植物，其體胚發(fā)生、體胚的質(zhì)量及胚苗轉(zhuǎn)化率更取決于母樹(shù)基因型。Couée等[14]比較20個(gè)家系體胚發(fā)生能力的差異，結(jié)果表明不同家系胚性愈傷組織誘導(dǎo)率從4.6%～49.1%不等。本實(shí)驗(yàn)采用云南松8株優(yōu)樹(shù)帶胚乳的合子胚進(jìn)行胚性愈傷組織誘導(dǎo)，不同優(yōu)樹(shù)之間的誘導(dǎo)率差異達(dá)極顯著水平，最高為19.5%，最低只有5.1%，這與前人的研究結(jié)論一致。然而，吳麗君[15]在濕地松、火炬松離體培養(yǎng)植株再生技術(shù)的研究中認(rèn)為，樹(shù)種及其基因型影響體胚發(fā)生的原因可能是不同樹(shù)種、不同基因型的最適誘導(dǎo)培養(yǎng)條件不同。基本培養(yǎng)基、外植體、植物激素對(duì)誘導(dǎo)體胚發(fā)生起著重要作用[16]。Duncan等[17]、Park等[18]認(rèn)為體胚發(fā)生困難的家系或基因型是可以通過(guò)培養(yǎng)基等培養(yǎng)條件的優(yōu)化得以克服的。因此通過(guò)培養(yǎng)基的調(diào)制、激素組合或其他培養(yǎng)條件的優(yōu)化打破母樹(shù)的限制無(wú)疑是今后研究工作的重要內(nèi)容。

致謝：本研究依托西南林業(yè)大學(xué)大型儀器共享平臺(tái)和云南生物多樣性研究院科研實(shí)驗(yàn)平臺(tái)完成！

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