鄒家通 羅一然 韓國偉 何小帆 和潤喜 何承忠,3

( 1. 西南林業(yè)大學(xué)云南省高校林木遺傳改良與繁育重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 昆明 650233；2. 西南林業(yè)大學(xué)西南地區(qū)生物多樣性保育國家林業(yè)局重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 昆明 650233；3. 西南林業(yè)大學(xué)西南山地森林資源保育與利用教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 昆明 650233)

澳洲堅果（Macadamia ternifolia）又稱為澳洲胡桃、夏威夷果、昆士蘭堅果、巴布果，屬山龍眼科（Proteaceae）澳洲堅果屬（Macadamia）的常綠喬木。原產(chǎn)于澳大利亞東南部的昆士蘭洲沿海地區(qū)及新南威爾士洲北部的江河地區(qū)，因其具有豐富的營養(yǎng)和獨(dú)特的風(fēng)味而備受消費(fèi)者青睞，且價格昂貴，具有很大的市場潛力和很高的經(jīng)濟(jì)價值、科研價值。我國自20世紀(jì)70年代引進(jìn)澳洲堅果品種并開展了環(huán)境適應(yīng)性試驗(yàn)，至今已成為澳洲堅果發(fā)展最快、種植面積最大的國家[1]。目前，澳洲堅果苗木繁殖方法主要采用扦插育苗和嫁接育苗[2]。

組織培養(yǎng)快繁技術(shù)不僅能夠?qū)崿F(xiàn)植物優(yōu)良品種的工廠化育苗，在較短時間內(nèi)達(dá)到規(guī)?；a(chǎn)苗木，且組培再生體系的建立也是開展植物分子育種的前提和基礎(chǔ)[3]。Gitonga等[4]探討了澳洲堅果組織培養(yǎng)的基本條件，并在WPM培養(yǎng)基上以幼嫩莖段為外植體獲得了高達(dá)98%的萌芽率，但進(jìn)一步嘗試生根誘導(dǎo)時，沒有獲得成功。Cha-um等[5]以蛭石為載體，向培養(yǎng)容器中充入高濃度CO2，從而獲得了根系發(fā)達(dá)的粗殼澳洲堅果品種"Keaau"的生根苗。國內(nèi)有關(guān)澳洲堅果組培技術(shù)報道較少，肖再云[6]利用莖段培養(yǎng)愈傷組織和畸胚，再進(jìn)一步培養(yǎng)分化獲得不定芽，剪下單芽誘導(dǎo)生根培養(yǎng)60 d，再將這些無根苗移入沙床中煉苗60 d，最終獲得了生根苗。郭凌飛等[7]在澳洲堅果成年樹上剪取帶芽莖段進(jìn)行組織培養(yǎng)研究，獲得了萌芽率較好的培養(yǎng)基配方，但未能成功獲得生根苗。由此可見，目前國內(nèi)澳洲堅果組織培養(yǎng)技術(shù)尚不成熟，限制了澳洲堅果遺傳改良、良種快繁及現(xiàn)代生物技術(shù)育種等工作[8]。澳洲堅果是多年生木本植物，其外植體存在脫毒難、易褐化、生根誘導(dǎo)困難等問題。本研究以澳洲堅果‘H2’品種幼苗的帶腋芽莖段為外植體材料，通過開展不同植物生長調(diào)節(jié)劑及其配比對腋芽啟動、增殖及生根的影響研究，從而建立其組織培養(yǎng)快繁技術(shù)體系，為澳洲堅果優(yōu)良品種苗木規(guī)?；庇?、人工多倍體誘導(dǎo)育種及現(xiàn)代生物技術(shù)育種等研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料來源

供試材料為德宏州林業(yè)局苗圃中心引種栽培的澳洲堅果‘H2’品種2年生實(shí)生苗，將苗木帶回昆明并栽種于西南林業(yè)大學(xué)格林溫室，待苗木抽生新梢后，取著生有側(cè)芽的幼嫩莖段為外植體。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 外植體消毒

將剪取的幼嫩莖段切除葉片，用洗潔精溶液清洗其表面的泥土及灰塵，之后置于燒杯中流水沖洗1 h。在超凈工作臺上先用75%乙醇浸泡20 s，再用無菌水沖洗4次，5%次氯酸鈉浸泡3 min，0.1%升汞處理5 min，用無菌水沖洗5次，無菌濾紙吸干表面水分，備用。

1.2.2 腋芽啟動培養(yǎng)

將消毒處理后的外植體截取長度為2.5～3.0 cm的帶腋芽莖段，將其豎直插入腋芽啟動培養(yǎng)基中。腋芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基設(shè)計的因素及水平為：6-BA 1.0、2.0、3.0 mg/L； IBA 0、0.5、1.0 mg/L；NAA 0、0.5、1.0 mg/L；活性炭（AC）0、200、400 mg/L。以WPM為基本培養(yǎng)基，添加20 g/L蔗糖和4 g/L瓊脂。采用L9（34）正交試驗(yàn)探索不同濃度6-BA、IBA、NAA、AC對腋芽啟動培養(yǎng)的影響。試驗(yàn)共9個處理，每個處理接種5瓶，每瓶接種3個外植體，3次重復(fù)。接種后定期觀察和記錄腋芽萌發(fā)情況，15 d后統(tǒng)計腋芽誘導(dǎo)系數(shù)。

1.2.3 腋芽增殖培養(yǎng)

待腋芽萌發(fā)生長至1～2 cm時，將其切下接種于不定芽分化的增殖培養(yǎng)基中。增殖培養(yǎng)基以MS為基本培養(yǎng)基，加入30 g/L蔗糖和4 g/L瓊脂，分別添加2.0 mg/L的TDZ、2.0 mg/L的6-BA、0.5 mg/L或 1.0 mg/L的 NAA以及 0.5 mg/L或1.0 mg/L的KT。共設(shè)計8個處理組合，每個處理組合接種5瓶，每瓶接入3個單芽，3次重復(fù)，培養(yǎng)45 d后統(tǒng)計不定芽增殖系數(shù)。

1.2.4 生根誘導(dǎo)培養(yǎng)

待不定芽生長高度達(dá)到2 cm左右時，剪取生長健壯的不定芽，接種于生根培養(yǎng)基誘導(dǎo)生根。生根培養(yǎng)以WPM、1/2MS為基本培養(yǎng)基，加入30 g/L蔗糖，4 g/L瓊脂，200 mg/ L的AC，植物生長調(diào)節(jié)劑6-BA 0.2 mg/L，NAA 1.0 mg/L，IBA（0.5、1.0 mg/L），ABA 0.5 mg/L，調(diào)節(jié)培養(yǎng)基酸度分別為pH=5.0和pH=6.0兩個水平。共設(shè)置8個處理組合，每個處理組合接種5瓶，每瓶接種3個不定芽，3次重復(fù)。培養(yǎng)40 d后統(tǒng)計生根率，并觀察組培苗生長狀況。

1.2.5 煉苗移栽

生根組培苗苗高達(dá)到4～5 cm時即可進(jìn)行煉苗。在培養(yǎng)室內(nèi)打開瓶蓋，放置3～4 d，然后移至室溫下放置7 d，取出生根苗洗凈粘附在根部的培養(yǎng)基，移栽到用多菌靈消毒后的基質(zhì)中（珍珠巖、河沙、紅土、腐殖土4種基質(zhì)按不同比例混合配制），移栽后定期采用霧狀化噴水保濕，于14 d后統(tǒng)計成活率。

1.2.6 培養(yǎng)條件

培養(yǎng)條件為晝溫（25±2）℃，夜溫（22±2）℃，光照強(qiáng)度2 000～2 500 lx，光照時間12 h/d。

1.2.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

采用Excel 2007進(jìn)行數(shù)據(jù)整理，運(yùn)用SPSS 22.0軟件對試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析，多重比較采用Duncan’s新復(fù)極差測驗(yàn)法（P＜0.01）進(jìn)行顯著性分析。

主要指標(biāo)計算公式如下：

2 結(jié)果與分析

2.1 植物生長調(diào)節(jié)劑配比對腋芽萌發(fā)的影響

將消毒外理后的帶腋芽幼嫩莖段接入含不同濃度植物生長調(diào)節(jié)劑配比的培養(yǎng)基中，15 d后腋芽萌發(fā)（圖1a）及生長狀況見表1。由表1可見，處理組合AG6為最優(yōu)組合，萌發(fā)的腋芽生長健壯，葉片翠綠舒展，且腋芽誘導(dǎo)系數(shù)達(dá)到3.51，極顯著地高于其他處理組合，表明植物生長調(diào)節(jié)劑6-BA與IBA按一定濃度配比使用時，對澳洲堅果腋芽萌發(fā)具有顯著的促進(jìn)作用，且有利于萌發(fā)后的腋芽生長。處理組合AG1的腋芽誘導(dǎo)系數(shù)最低，僅為0.42，說明在WPM基本培養(yǎng)中僅添加植物生長調(diào)節(jié)劑6-BA，對澳洲堅果腋芽萌發(fā)和腋芽生長的作用效果不明顯。然而，當(dāng)6-BA使用濃度為3.0 mg/L時，無論與IBA、NAA共同配比使用，還是僅與IBA或NAA配比使用，雖然對腋芽萌發(fā)具有較好的促進(jìn)作用，但萌發(fā)抽生的腋芽出現(xiàn)較嚴(yán)重的玻璃化和葉片畸形現(xiàn)象（處理組合AG7，AG8和AG9）。此外，在培養(yǎng)基中添加適量的活性炭（AC），腋芽生長更為健壯，葉色翠綠。因此，結(jié)合腋芽生長狀況和誘導(dǎo)系數(shù)，從節(jié)約成本方面考慮，較適宜澳洲堅果莖段腋芽萌發(fā)的培養(yǎng)基為WPM+ 6-BA 2.0 mg/L+IBA 1.0 mg/L+AC 200 mg/L。

圖 1 澳洲堅果不定芽誘導(dǎo)與生根培養(yǎng)Fig. 1 Adventitious bud induction and rooting culture of M. ternifolia

表 1 不同植物生長調(diào)節(jié)劑配比對腋芽萌發(fā)的影響Table 1 Effects of different exogenous hormones ratio on the axillary bud germination

2.2 植物生長調(diào)節(jié)劑配比對腋芽增殖的影響

將生長健壯，高度達(dá)到2.0 cm以上的腋芽從基部切下，豎直接種于增殖培養(yǎng)基，45 d后統(tǒng)計增殖系數(shù)及不定芽生長情況（圖1b和表2）。由表2可知，不同處理組合間的不定芽增殖系數(shù)呈極顯著差異（P＜0.01）。其中處理組合AP7的增殖系數(shù)最高（3.49），其次是處理組合AP3，增殖系數(shù)為3.09，二者之間差異不顯著，且誘導(dǎo)發(fā)生的不定芽生長勢良好，而TDZ + KT/NAA組合（AP1，AP2，AP5和AP6）不僅增殖系數(shù)低，而且誘導(dǎo)發(fā)生的不定芽生長勢一般，表明6-BA +KT/NAA組合更適宜于澳洲堅果腋芽的增殖培養(yǎng)。此外，澳洲堅果不定芽對NAA比較敏感。當(dāng)NAA濃度為0.5 mg/L時（處理組合AP1，AP3），不定芽生長良好；而NAA濃度增加為1.0 mg/L時（處理組合AP2，AP4），則引起不定芽的玻璃化。植物生長調(diào)節(jié)劑KT與TDZ組合對澳洲堅果不定芽也存在相同的作用效果，但KT與6-BA組合中（處理組合AP7，AP8），KT濃度為0.5 mg/L或1.0 mg/L時均沒有出現(xiàn)玻璃化現(xiàn)象。綜合上述分析認(rèn)為，澳洲堅果腋芽增殖的適宜培養(yǎng)基為MS+6-BA 2.0 mg/L+KT 0.5 mg/L。

表 2 不同植物生長調(diào)節(jié)劑配比處理對腋芽增殖的影響Table 2 Effects of different exogenous hormones ratio on proliferation of axillary bud

2.3 植物生長調(diào)節(jié)劑配比對誘導(dǎo)生根的影響

剪取生長健壯的不定芽，接種于生根培養(yǎng)基誘導(dǎo)生根（圖1c），培養(yǎng)40 d后不定芽生根結(jié)果見表3。結(jié)果顯示，當(dāng)培養(yǎng)基pH=6.0時，僅有3個處理組合（R2，R6，R8）誘導(dǎo)不定芽產(chǎn)生不定根，生根率最高值為16.3%；當(dāng)培養(yǎng)基pH=5.0時，除R1處理組合外，其他7個處理組合均能夠誘導(dǎo)不定芽產(chǎn)生不定根，生根率最高值達(dá)到42.2%，表明生根培養(yǎng)基pH=5.0更適宜于澳洲堅果不定芽的生根培養(yǎng)。在植物生長調(diào)節(jié)劑配比相同的情況下，以1/2MS為基本培養(yǎng)基的處理組合生根率均顯著高于以WPM為基本培養(yǎng)基的處理組合生根率，說明1/2MS基本培養(yǎng)基較WPM基本培養(yǎng)基更適宜用于澳洲堅果不定芽的生根培養(yǎng)。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，接種于添加有ABA成分的培養(yǎng)基（處理組合R2和R6），不定芽生根率顯著高于其他培養(yǎng)基，表明植物生長調(diào)節(jié)劑ABA對澳洲堅果不定芽誘導(dǎo)生根具有促進(jìn)作用。由此可知，可用于澳洲堅果不定芽誘導(dǎo)生根的培養(yǎng)基為1/2MS+6-BA 0.2 mg/L+IBA 0.5 mg/L+ABA 0.5 mg/L，pH=5.0。

表 3 不同植物生長調(diào)節(jié)劑配比對生根誘導(dǎo)的影響Table 3 Effects of different exogenous hormones ratio on rooting induction

2.4 基質(zhì)對組培苗移栽成活的影響

將澳洲堅果組培苗在培養(yǎng)室內(nèi)開瓶煉苗3 d，移至實(shí)驗(yàn)室內(nèi)室溫下煉苗5 d后，移栽于不同基質(zhì)中（圖1d），14 d后統(tǒng)計成活情況（表4）。由表4可見，組培苗移栽成活率最高者是配比組合S2，成活率達(dá)到66.7%，其次是配比組合S1，移栽成活率為66.3%，移栽成活率最低者是配比組合S3（53.3%），但各配比組合基質(zhì)間的組培苗移栽成活率差異不顯著（P=0.397＞0.05），而含有河沙的栽種基質(zhì)有利于組培苗成活。由此，V（河沙）∶V（紅土）∶ V（腐殖土）=1∶ 1∶ 1的基質(zhì)適用于澳洲堅果組培苗的移栽。

表 4 不同基質(zhì)對組培苗成活的影響Table 4 Effects of different substrates on survival rate

3 結(jié)論與討論

植物細(xì)胞在理論上都存在全能性，任何植物的器官或組織都能作為組織培養(yǎng)的外植體[9]。但在組織培養(yǎng)實(shí)踐中，植物不同品種、組織或器官，其分化能力存在顯著差異，而且外植體的生理年齡、生長階段與取材部位等都直接影響著組織培養(yǎng)技術(shù)體系的建立，因此，外植體選擇是組織培養(yǎng)能否成功的首要因素[10]。在很多木本植物組織培養(yǎng)中，選擇以葉片、葉柄作為外植體，均能獲得較好的誘導(dǎo)效果。在預(yù)試驗(yàn)時，采集‘H2’澳洲堅果的幼嫩葉片、葉柄和幼嫩莖段作為外植體開展誘導(dǎo)研究，但葉片和葉柄的分化能力差，均在30 d后逐漸褐化、變黃死亡，只有以幼嫩莖段作為外植體獲得了較好的誘導(dǎo)效果。

澳洲堅果組培苗誘導(dǎo)生根較困難。郭凌飛等[7]和Bhalla等[11]在研究澳洲堅果組織培養(yǎng)時，曾嘗試添加多種植物生長調(diào)節(jié)劑進(jìn)行誘導(dǎo)生根，但均未獲得理想效果。Cha-um等[5]將澳洲堅果不定芽接入以蛭石為載體的MS液態(tài)培養(yǎng)基中，并向培養(yǎng)容器中注入高濃度CO2，成功誘導(dǎo)出了不定根。一般地，WPM培養(yǎng)基更適合于木本植物的組培苗生根培養(yǎng)，但本研究結(jié)果表明，‘H2’澳洲堅果組培苗在1/2MS培養(yǎng)基中的誘導(dǎo)生根效果優(yōu)于WPM培養(yǎng)基。

ABA作為植物天然的生長抑制物質(zhì)，對植物形態(tài)發(fā)生和生長具有負(fù)效應(yīng)[12]，并對植物生根發(fā)揮著關(guān)鍵作用[13-14]。赤霉素能夠抑制植株生根培養(yǎng)起始階段的細(xì)胞分裂，從而抑制根原基的分化和形成[15]。作為赤霉素的天然拮抗劑[16]，較高濃度的ABA在不定根的分化階段發(fā)揮作用，能夠促進(jìn)植物不定根的形成[14]。本研究中也發(fā)現(xiàn)，在不定芽誘導(dǎo)生根培養(yǎng)基中添加適量植物生長調(diào)節(jié)劑ABA，能夠顯著地提高澳洲堅果不定芽的生根率，與前人研究結(jié)果一致。

此外，培養(yǎng)基的酸堿度對澳洲堅果不定芽生根誘導(dǎo)有一定的影響，偏酸性（pH=5.0）的培養(yǎng)基有利于不定根的發(fā)生?？傊狙芯績H初步建立了澳洲堅果的組織培養(yǎng)快繁技術(shù)體系，組培苗生根率較低，僅為42.2%，還需要進(jìn)一步優(yōu)化完善。

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