鄭上游 胡崇輝 陳汝福

中山大學(xué)孫逸仙紀(jì)念醫(yī)院膽胰外科，廣州 510120

多數(shù)胰腺癌化療患者最終因?qū)煯a(chǎn)生多重耐藥導(dǎo)致疾病進(jìn)展而死亡[1]。多藥耐藥性的特征在于對具有靶位點(diǎn)的化學(xué)治療藥物的交叉抗性?；熕幬锏幕瘜W(xué)抗性的主要機(jī)制與藥物攝取、代謝和作用靶點(diǎn)有關(guān)[2]，其常見原因之一是ATP結(jié)合盒(ATP-binding cassette，ABC)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族的上調(diào)[3]。Mohelnikova-Duchonova等[4]研究表明，顯微切割的胰腺癌腫瘤細(xì)胞中ABC轉(zhuǎn)運(yùn)家族的ABCB4、11，ABCC1、3、5、10和ABCG2等 mRNA表達(dá)顯著上調(diào)，說明ABC轉(zhuǎn)運(yùn)家族表達(dá)可抵抗胰腺癌化療的效應(yīng)。Passacantilli等[5]和Arumugam等[6]檢測抗癌藥物的半抑制濃度(50% inhibitory concentration, IC50)及行細(xì)胞增殖實驗時發(fā)現(xiàn)，胰腺癌細(xì)胞株BxPC-3、 CFPAC-1和L3.6pl為敏感細(xì)胞株，而Hs766T、MIAPaCa-2、Mpanc96 和PANC1為耐藥細(xì)胞株。肝細(xì)胞核因子1α(hepatocyte nuclear factor 1 homeobox A，HNF1A)作為抑癌因子在胰腺癌中發(fā)揮重要調(diào)控作用[7]。本研究檢測胰腺癌組織和胰腺癌耐藥株P(guān)ANC1細(xì)胞 HNF1A表達(dá)，分析HNF1A通過調(diào)控ABC轉(zhuǎn)運(yùn)家族對PANC1細(xì)胞IC50和凋亡能力的影響及與臨床化療療效的相關(guān)性。

材料與方法

一、胰腺癌細(xì)胞株及胰腺癌組織HNF1AmRNA表達(dá)檢測

人胰腺癌細(xì)胞株BxPC-3、CFPAC-1、L3.6pl、PANC1、Hs766T、MIAPaCa-2和Mpanc96均購自ATCC，常規(guī)培養(yǎng)、傳代。選取2012年3月至2017年5月間中山大學(xué)孫逸仙紀(jì)念醫(yī)院膽胰外科78例行手術(shù)切除后接受吉西他濱聯(lián)合白蛋白紫杉醇化療方案的局部晚期或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的胰腺癌患者。所有胰腺癌組織標(biāo)本均由兩名病理科醫(yī)師重新評估并診斷為胰腺導(dǎo)管腺癌。出院后通過復(fù)診及電話隨訪了解病情發(fā)展，隨訪截止日為2017年10月?；颊叩纳嫫诙x為入組時間至死亡時間或隨訪終止時間。

使用Trizol法抽提7株胰腺癌細(xì)胞及78例胰腺癌組織的總RNA。應(yīng)用PrimeScript1M RT reagent Kit(TaKaRa公司，Cat.RR037A)將RNA 逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，再用GreenTMTB Premix Ex TaqTMⅡ(Tli RNaseH Plus，TaKaRa公司，Cat. RR820A)行熒光定量PCR反應(yīng)。HNF1A上游引物序列5′-GACCTGACCGAGTTGCCTAAT-3′，下游引物序列5′-CCGGCTCTTTCAGAATGGGT-3′；內(nèi)參GAPDH上游引物序列5′-CGCTGAGTACGTCGTGGAGTC-3′，下游引物序列5′-GCTGATGATCTTGAGGCTGTTGTC -3′。按試劑盒說明書進(jìn)行操作。采用公式2-△△CT計算mRNA表達(dá)量，每個樣品設(shè)3個復(fù)管，取均值。

二、穩(wěn)定過表達(dá)HNF1A細(xì)胞株的構(gòu)建

將人HNF1A cDNA片段(GeneCopoeia，EX-A1385-M13-10，cDNA克隆)插入pMk0.1-puro質(zhì)粒，通過攜帶HNF1A cDNA質(zhì)粒的慢病毒載體感染HNF1A表達(dá)量最低的胰腺癌細(xì)胞，用含2 μg/ml嘌呤霉素的培養(yǎng)皿培養(yǎng)、篩選陽性克隆，擴(kuò)增獲得過表達(dá)HNF1A的胰腺癌細(xì)胞(HNF1A組)，以攜帶空質(zhì)粒的慢病毒感染的胰腺癌細(xì)胞作為對照組。

三、HNF1A組和對照組細(xì)胞HNF1A、ABC轉(zhuǎn)運(yùn)家族的mRNA及蛋白表達(dá)檢測

收集HNF1A組和對照組對數(shù)生長期胰腺癌細(xì)胞，用上述同樣方法檢測兩組細(xì)胞HNFA及ABC轉(zhuǎn)運(yùn)家族中的ABCB1、ABCC1、ABCC3、ABCC5 mRNA表達(dá)。ABCB1上游引物序列5′-CCCATCATTGCAATAGCAGG-3′，下游引物序列5′-TGTTCAAACTTCTGCTCCTGA-3′；ABCC1上游引物序列5′-ATGGTGTCAGTGGTTTAGG-3′，下游引物序列5′-TGTGGGAAGAAGAGTTGC-3′；ABCC3上游引物序列5′-GTGGGGATCAGACAGAGAT-3′，下游引物序列5′-TAGTGGTGCAGGCAGAGTAGGA-3′；ABCC5上游引物序列5′-CAGCCAGTCCTCACATCA-3′，下游引物序列5′-GAAGCCCTCTTGTCTTTTTT-3′；內(nèi)參GAPDH上游引物序列5′-CGCTGAGTACGTCGTGGAGTC-3′，下游引物序列5′-GCTGATGATCTTGAGGCTGTTGTC-3′。

取兩組細(xì)胞，用裂解液提取細(xì)胞總蛋白，BCA法定量后行蛋白質(zhì)印跡法檢測細(xì)胞HNF1A及ABCB1、ABCC1、ABCC3、ABCC5 蛋白表達(dá)，以GAPDH為內(nèi)參。使用兔抗人HNF1A抗體(1∶1 000，#ab96777，Abcam)，兔抗人ABCB1抗體(1∶1 000，#ab170904，Abcam)，兔抗人ABCC1抗體(1∶1 000，#ab32574)，Abcam)，兔抗人ABCC3抗體(1∶1 000，#ab226804，Abcam)，兔抗人ABCC5抗體(1∶1 000，#ab24107，Abcam)和兔抗人GAPDH抗體(1∶1 000，#ab18162，Abcam)。最后ECL發(fā)光，X片曝光、顯影、定影。通過掃描獲取條帶的灰度值，以目的條帶與內(nèi)參條帶的灰度值比作為蛋白相對表達(dá)量。

四、PANC1細(xì)胞對吉西他濱聯(lián)合白蛋白紫杉醇的IC50檢測

取HNF1A組及對照組對數(shù)生長期PANC1細(xì)胞，以每孔7×103個細(xì)胞接種于96孔板中，分別加入終濃度均為1、20、40、60、80、100 μmol/L的吉西他濱和白蛋白紫杉醇處理48 h， 然后加入20 μl的3-(4,5-二甲基-2-噻唑基)-2,5-二苯基-2溴化四唑(MTT)5 mg/ml，繼續(xù)孵育4 h，棄上清液，加150 μl二甲基亞砜，30 min后上分光光度儀，采用熒光活化細(xì)胞分選法(FACS)檢測細(xì)胞凋亡。 每個濃度設(shè)5個復(fù)孔，實驗重復(fù)3次，取均值。

五、PANC1細(xì)胞凋亡率檢測

用終濃度均為10 μmol/L的吉西他濱和白蛋白紫杉醇處理PANC1細(xì)胞72 h后，收集細(xì)胞，加入70%冷乙醇固定，加入500 μl ahypotonic混合溶液(0.1%檸檬酸鈉，0.1% Triton x-100，20 μg/ml核糖核酸酶，50 μg/ml碘化丙啶)進(jìn)行細(xì)胞染色，30 min后上流式細(xì)胞儀，采用FACS法檢測細(xì)胞凋亡。

六、統(tǒng)計學(xué)處理

結(jié) 果

一、胰腺癌組織HNF1A表達(dá)及其與臨床病理參數(shù)、患者生存期的相關(guān)性

78例胰腺癌的HNF1A mRNA表達(dá)量為0.049～0.001，中位數(shù)為0.017，將>0.017的歸為高表達(dá)組，≤0.017歸為低表達(dá)組，各39例。胰腺癌HNF1A表達(dá)水平與患者的性別、年齡、腫瘤分化程度均無關(guān)，而與腫瘤的TNM分期、神經(jīng)浸潤相關(guān)(P值均<0.05)，TNM Ⅳ期及有神經(jīng)浸潤者的HNF1A mRNA表達(dá)水平顯著下調(diào)(表1)。

78例患者的生存期為1.5～22.5個月，平均生存期為12.7個月，其中HNF1A高表達(dá)組患者的平均生存期為17.9個月，明顯長于低表達(dá)組患者的12.4個月(P<0.001，圖1)。單因素及多因素分析均顯示，腫瘤TNM分期晚、有神經(jīng)浸潤、HNF1A低表達(dá)是影響患者生存期的危險因素(表2)。

二、胰腺癌細(xì)胞株HNF1A mRNA表達(dá)

胰腺癌敏感細(xì)胞株BxPC-3、 CFPAC-1、L3.6pl 的HNF1A mRNA表達(dá)水平分別為0.038±0.005、0.048±0.001和0.036±0.004，耐藥細(xì)胞株Hs766T、MIA PaCa-2、Mpanc96、PANC1的HNF1A mRNA表達(dá)水平分別為0.020±0.003、0.017±0.002、0.009±0.001、0.006±0.001，其中PANC1的表達(dá)量最低，相比常用的BxPC-3細(xì)胞的表達(dá)量下降6.73倍，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=11.97，P<0.001)，故選擇PANC1細(xì)胞構(gòu)建過表達(dá)HNF1A細(xì)胞。

表1 HNFA1表達(dá)水平與胰腺癌臨床病理參數(shù)的相關(guān)性(例)

圖1 HNF1A表達(dá)水平對總生存期的影響

表2單因素和多因素分析胰腺癌患者臨床特征與總生存期的關(guān)系

變量單因素分析HR(95% CI)P值多因素分析HR(95% CI)P值年齡(歲) <60 ≥601.164(0.637～2.127)0.621性別 男性 女性1.163(0.630～2.144)0.629分化程度 高分化 中分化0.893(0.309～2.583)0.835 低分化1.022(0.158～3.359)0.971TNM分期 Ⅲ Ⅳ2.480(1.303～4.718)0.0062.521(1.283～4.955)0.007神經(jīng)浸潤 無 有2.414(1.249～4.665)0.0091.958(0.990～3.873)0.054HNF1A表達(dá)水平 高表達(dá) 低表達(dá)3.131(1.621～6.045)<0.0012.939(1.466～5.893)0.002

三、HNF1A組和對照組PANC1細(xì)胞HNF1A、ABC轉(zhuǎn)運(yùn)家族的mRNA及蛋白水平

對照組、HNF1A組PANC1細(xì)胞HNF1A mRNA 表達(dá)水平分別為0.006±0.001、0.018±0.003；蛋白表達(dá)水平分別為0.652±0.041、0.966±0.038。HNF1A組細(xì)胞HNF1A表達(dá)水平較對照組顯著上調(diào)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=-6.57，P=0.003，t=-10.14，P<0.001)。

對照組、HNF1A組PANC1細(xì)胞ABCB1、ABCC1、ABCC3、ABCC5 mRNA表達(dá)水平分別為0.029±0.007和0.025±0.003、0.047±0.008和0.012±0.004、0.056±0.004和0.051±0.006、0.061±0.010和0.058±0.007；5蛋白表達(dá)水平分別為0.471±0.046和0.446±0.049、0.832±0.046和0.281±0.040、1.0535±0.075和1.047±0.057、0.965±0.097和0.840±0.051。僅HNF1A組的ABCC1 mRNA及蛋白表達(dá)水平較對照組顯著下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=6.63，P=0.003；t=15.56，P<0.001，圖2)。

圖2 對照組(1)和HNF1A組(2)PANC1細(xì)胞ABCB1、ABCC1、ABCC3、ABCC5蛋白表達(dá)

四、HNF1A組和對照組PANC1細(xì)胞的IC50及細(xì)胞凋亡率

吉西他濱聯(lián)合白蛋白紫杉醇處理48h后，HNF1A組的IC50值較對照組顯著下降[(26.31±2.91)μmol/L比(72.63±4.07)μmol/L)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=9.26，P<0.001]；HNF1A組凋亡率較對照組顯著增加[(40.18±1.64)%比(21.31±1.98)%)，差異也有統(tǒng)計學(xué)意義(t=-7.35，P=0.002)。

討 論

HNF1A最初在肝臟中被發(fā)現(xiàn)，隨后被證實在包括胰腺、腎和腸道中均有表達(dá)[8]。研究表明HNF1A突變是年輕人成熟性發(fā)病糖尿病(maturity onset diabetes of the young 3，MODY3)的原因，其占所有MODY3病例的21%～64%[9]。 通過全基因組關(guān)聯(lián)研究也報道了HNF1A存在多個單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)，且與胰腺癌顯著相關(guān)。Luo等和Pierce等前期系列報道了HNF1A作為抑癌因子在胰腺癌中發(fā)揮重要調(diào)控作用，而肝細(xì)胞核因子家族的另一成員HNF1B已報道可介導(dǎo)卵巢癌的化療耐藥[7,10]。本研究首先關(guān)注HNF1A的表達(dá)是否與胰腺癌細(xì)胞對吉西他濱聯(lián)合白蛋白紫杉醇化療的敏感性相關(guān)。結(jié)果顯示，在7株胰腺癌細(xì)胞中，相比于化療敏感細(xì)胞系，耐吉西他濱聯(lián)合白蛋白紫杉醇的PANC1細(xì)胞 HNF1A表達(dá)水平明顯低下，說明在吉西他濱聯(lián)合白蛋白紫杉醇藥物代謝過程中可能存在某些特定的信號通路調(diào)控HNF1A的表達(dá)。

本研究發(fā)現(xiàn)，HNF1A表達(dá)與胰腺癌細(xì)胞對吉西他濱聯(lián)合白蛋白紫杉醇化療的敏感性呈正相關(guān)性。過表達(dá)HNF1A的PANC1細(xì)胞對吉西他濱聯(lián)合白蛋白紫杉醇兩種藥物的IC50顯著降低，細(xì)胞凋亡率明顯升高。既往研究表明，胰腺癌腫瘤細(xì)胞ABCB4、ABCB11、ABCC1、ABCC3、ABCC5、ABCC10和ABCG2 mRNA水平顯著上調(diào)[4]。本研究構(gòu)建的過表達(dá)HNF1A的PANC1細(xì)胞中ABCB1、ABCC1 mRNA和蛋白水平顯著下調(diào)。ABCC1最早報道于1992年，在體外模型中發(fā)現(xiàn)ABCC1介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞對阿霉素、依托泊苷長春新堿的多重耐藥性[11]。因此，HNF1A可能通過調(diào)控ABCC1表達(dá)改變細(xì)胞內(nèi)藥物外排影響腫瘤細(xì)胞的多藥耐藥性。本研究結(jié)果還顯示，HNF1A低表達(dá)與胰腺癌TNM分期晚、有神經(jīng)浸潤呈正相關(guān)，高表達(dá)HNF1A組患者的總生存期長于低表達(dá)組，提示HNF1A可能在胰腺癌細(xì)胞多藥耐藥生物學(xué)過程中起到關(guān)鍵調(diào)節(jié)作用。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突