桂 青 陳碧玉 劉翰琛 黃念來 陳貞磊 林炤華 周常文

(福建醫(yī)科大學基礎醫(yī)學院，福州 350122)

腦脊液(cerebrospinal fluid，CSF)是充滿在各腦室、蛛網(wǎng)膜下腔和脊髓中央管內(nèi)的無色透明的液體，其性質(zhì)與血漿和淋巴液相似，略帶黏性。它供應腦細胞一定的營養(yǎng)，運走腦組織的代謝產(chǎn)物，調(diào)節(jié)中樞神經(jīng)系統(tǒng)的酸堿平衡，并緩沖腦和脊髓的壓力，對腦和脊髓具有保護和支持作用[1]。由于血腦屏障的存在，中樞系統(tǒng)疾病或損傷，常常以腦脊液為觀察對象，檢測腦脊液中目的物含量變化。若中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)生病變，神經(jīng)細胞代謝紊亂，將使腦脊液的性狀和成分發(fā)生改變。因此，小鼠腦脊液常被用于腦損傷機制、生物標記物、藥物治療等研究領域中[2]，如對腦脊液炎癥因子敏感性的研究[3]，對腦脊液中蛋白含量的影響研究[4]，對腦脊液中去甲腎上腺素、五羥色胺的動態(tài)變化[5]及腦脊液中腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子的研究[6]。課題組為了利用蛋白組學技術鑒定α分泌酶ADAM10的新底物，需利用已建立好的動物模型，抽取純合子及野生型小鼠的腦脊液進行質(zhì)譜分析[7]。文獻記載中，尚未發(fā)現(xiàn)簡單易行的小鼠腦脊液抽取方法。由于大鼠與小鼠大腦具有相似的解剖結構，通過參考抽取大鼠腦脊液的方法建立了一種抽取小鼠腦脊液的新方法[2]。

1 材料

1.1 實驗動物

清潔級20～30 g健康C57BL/6小鼠，由福建醫(yī)科大學動物實驗中心提供，生產(chǎn)許可證號為：2015000519041。

1.2 實驗材料

手術彎剪，彎鑷，止血鉗，體視顯微鏡，20 μL微量采血管，無菌棉球與棉簽，75%酒精，4%水合氯醛(福州科諾生物技術有限公司)，注射器，鐵架臺，燒瓶夾，手電筒或頭燈，酒精燈，生理鹽水，7號縫合針線，PCR管，封口膜。

2 實驗方法與結果

2.1 微量吸管的制作

打開酒精燈，用手捏住微量采血管兩端，將微量采血管中間部位對準酒精燈外焰，中間部位一旦融化即向兩端平直外拉，這時可見兩根管的頭部為絲狀，用剪刀稍作修剪，將其在體視顯微鏡下檢查，內(nèi)部通暢即可。兩根微量吸管即制作成功。

圖1 微量吸管的制作Fig.1 Micropipets production

2.2 麻醉及固定

腹腔注射4%水合氯醛麻醉小鼠。利用鐵架臺與燒瓶夾固定小鼠前肢，調(diào)整燒瓶夾到合適的高度，可將頭部墊到一定高度使小鼠頭部與身體大約成120°角?？稍诠潭ㄐ∈笄爸臒繆A的上方加一個燒瓶夾固定手電筒，使整個視野更加明亮，有助于觀察小鼠硬脊膜的位置(也可直接佩戴頭燈)。

2.3 鈍性分離

對小鼠頭部皮膚進行消毒去毛處理，沿后正中線切一縱行切口(約1 cm)。用止血鉗將皮膚夾住分開。用彎鑷沿正中白線撕離表層肌肉，再用止血鉗夾住分開。最深層附著在枕骨大孔的肌肉繼續(xù)用鑷子沿正中線的方向縱向分開，方法為用力夾緊鑷子，將鑷子頭部插入中線中間部，然后放松鑷子以縱向撐開肌肉，如此反復操作幾次(不易觸破血管)，可見只剩殘留的少量肌肉。最后用鑷子或棉簽的末端刮開附著在硬脊膜的殘留肌肉(以避免出血)，直到完全暴露白色硬脊膜。

2.4 抽取

暴露白色硬脊膜后，將其用無菌棉簽擦凈。將事先準備好的微量吸管，輕輕旋入硬脊膜，一旦見到清亮的腦脊液沿吸管緩慢上升(顱內(nèi)壓的作用)應立刻穩(wěn)住，直到管內(nèi)腦脊液的液面高度停止上升，輕輕將吸管退出?？傻玫讲粠а?～5 μL腦脊液。

圖2 從延髓池抽取腦脊液Fig.2 CSF samples are taken from the cisterna magna

圖3 抽取腦脊液操作次序Fig.3 The operation sequence of CSF extraction

2.5 獲取與保存

取經(jīng)高壓滅菌過的PCR管，將微量吸管尖部對著管口。將已充滿空氣的注射器對準微量吸管的另一頭，一次性快速用力將注射器推到底，可將吸管內(nèi)的腦脊液成功打入PCR管。封口膜密封好后，放入-80 ℃冰箱保存。

2.6 縫合及飼養(yǎng)

抽到腦脊液后，縫合外層皮膚，縫合完畢后向縫合缺口注入約1 mL生理鹽水，放回籠中并繼續(xù)飼養(yǎng)，密切觀察?？梢娦∈笾饾u恢復正常，待縫合線脫落后可再次抽取。

3 討論

本文采用的改進方法，其新穎之處在于：①目前，大多文獻記載的是大鼠腦脊液抽取方法[2,8]，尚未發(fā)現(xiàn)簡單易行的小鼠腦脊液抽取方法。而小鼠腦脊液常被用于腦損傷機制、生物標記物、藥物治療等研究領域中，更為簡單易行的方法亟待被發(fā)現(xiàn)。②建立的方法簡單易行，儀器低廉，成功率高。在許多實驗室，腦脊液抽取多需昂貴的儀器和特定的小鼠固定裝置[9]，而本方法則僅在普通的實驗條件下用常見的實驗材料即可達到高的成功率。例如，用鐵架臺及燒瓶夾代替小鼠固定裝置，用酒精燈與微量采血管代替拉針儀與玻璃管。

另外，本文詳細地介紹了如何抽取腦脊液不帶血的同時也不易導致小鼠死亡的過程，如嚴格按照操作方法進行，能在短時間內(nèi)十分順利地抽取到腦脊液。如果不慎有微量血液進入，可將腦脊液在4 ℃、10 000 r/min離心2 min。取白色透明的上清液體即可[2]。③不易感染，生存率高。此方法只造成輕微腦組織損傷，不易出血，縫合后，小鼠的生存率極高。本實驗對100只小鼠抽取腦脊液，麻醉死亡3只，直接傷及延髓死亡2只，縫合后感染死亡2只，存活率高達93%。

在操作過程中應注意以下事項：

1) 鈍性分離，切勿觸及血管是成功的關鍵因素之一，由于小鼠腦部血管隱藏較深且細小，肉眼無法避及，故一定要采用鈍性分離；

2) 旋針速度一定要緩慢，當有腦脊液涌出，此時應穩(wěn)住，手盡量不要顫抖。如果抽取失敗導致硬脊膜損傷，不應繼續(xù)抽?。缋^續(xù)抽取，血液易進入吸管。

綜上所述，本文所建立的小鼠腦脊液抽取方法簡單易行、結果穩(wěn)定、重復性好，是一種有效、新穎，可以達到反復抽取實驗對象目的的方法，為利用小鼠腦脊液的相關研究提供了良好的實驗基礎。