楊 林 黎桂玲 劉 科 代路路 李金鳳 朱葉萌 鄺少松

(1.廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，佛山 528248)(2.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)，廣州 510642)

動(dòng)物體內(nèi)的脂類物質(zhì)代謝異常時(shí)，多余的脂質(zhì)會(huì)沉積在血管壁上，并逐漸形成斑塊，使血管內(nèi)皮增厚、變硬，是引起動(dòng)脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)的重要原因之一。載脂蛋白E(apolipoprotein E, apoE)主要存在于乳糜微粒(chylomicron, CM)、極低密度脂蛋白(very low desity lipoprotein, LDL)等多種血漿脂蛋白中，可介導(dǎo)脂蛋白殘粒的攝取，維持血漿膽固醇的平衡、促進(jìn)泡沫細(xì)胞中膽固醇的外流以及具有抗氧化和消炎等作用，該基因缺陷將使體內(nèi)脂代謝發(fā)生紊亂。ApoE基因敲除的純合小鼠(ApoE-/-)可正常存活和繁殖，當(dāng)給予適當(dāng)?shù)母咧嬍硶r(shí)，可導(dǎo)致各種高脂蛋白血癥[1-3]，并且其斑塊分布與人類的動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的分布相似，在動(dòng)脈粥樣硬化的研究中發(fā)揮重要作用。本文使用西方膳食飼料和標(biāo)準(zhǔn)飼料兩種不同脂肪和膽固醇含量的飼料喂養(yǎng)ApoE-/-基因敲除小鼠，探究其血生化指標(biāo)和動(dòng)脈病理學(xué)的改變，為后續(xù)該模型小鼠的使用提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

選取約3月齡的SPF級(jí)載脂蛋白E基因敲除小鼠(ApoE-/-)36只和C57BL/6J小鼠18只，其來(lái)源于廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心[SCXK(粵)2013-002]，動(dòng)物飼養(yǎng)環(huán)境條件為20～26 ℃，相對(duì)濕度40%～70%。36只ApoE-/-小鼠分為6組，每組6只，分別為：喂養(yǎng)西方膳食(主要成分見(jiàn)表1)3個(gè)月(H6)、4個(gè)月(H7)和5個(gè)月(H8)組，和標(biāo)準(zhǔn)飼料(主要成分見(jiàn)表2)3個(gè)月(M6)、4個(gè)月(M7)和5個(gè)月(M8)組。西方膳食飼料含21%脂肪、0.25%膽固醇；標(biāo)準(zhǔn)飼料含10%脂肪。18只C57BL/6J小鼠即對(duì)照組小鼠(所喂飼料見(jiàn)表2)，共分3組，每組6只，分別為：6月齡(WT6)、7月齡(WT7)和8月齡(WT8)組，飼養(yǎng)期間自由飲水。

表1 西方膳食飼料主要組分及營(yíng)養(yǎng)含量Table 1 Main components and nutrient contents of Western diet

表2 標(biāo)準(zhǔn)飼料及C57小鼠飼料主要組分及營(yíng)養(yǎng)含量Table 2 Main components and nutrient contents of standard diet and C57 mice diet

1.2 主要試劑和儀器

試劑：溶血?jiǎng)?，DH-910，DH-680；清洗劑，DH-520，DH-620；稀釋液，DH-640(東湖儀器試劑有限公司)

儀器：輪轉(zhuǎn)切片機(jī)(德國(guó)LEICA公司 RM2135)，生物組織全自動(dòng)脫水機(jī)(湖北孝感醫(yī)用儀器有限公司 TS-12C)，生物組織包埋機(jī)及冷凍機(jī)(湖北孝感醫(yī)用儀器有限公司 BM-VII)，攤片烤片機(jī)(湖北孝感醫(yī)用儀器有限公司 CS-VI)，生物組織全自動(dòng)染色機(jī)(湖北孝感醫(yī)用儀器有限公司 RS-18)，正置光顯微鏡(Olympus BX41)，病理圖像分析系統(tǒng)(Image-Pro Expess 5.1.1.14)，血液分析儀(NIHONKOHDEN)等。

1.3 血脂測(cè)定

9組小鼠喂養(yǎng)到指定月齡后，稱體質(zhì)量并摘取眼球取血(不空腹)，離心，分離血清，使用NIHONKOHDEN血液分析儀測(cè)定各組小鼠血清總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)和高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)。

1.4 樣本取材及制備

動(dòng)物處死后，取主動(dòng)脈根部，4%中性甲醛固定，常規(guī)脫水、透明、浸臘、包埋、切片(4 μm)、烤片，常規(guī)HE染色，封片。在光學(xué)顯微鏡下觀察主動(dòng)脈弓有無(wú)動(dòng)脈粥樣硬化病變，并用OLYMPUS BX41顯微鏡拍照。

1.5 統(tǒng)計(jì)方法

2 結(jié)果

2.1 血脂水平的變化

與同月齡的對(duì)照組小鼠相比，高脂日糧喂養(yǎng)的H組與普通日糧喂養(yǎng)的M組的APOE基因敲除小鼠在TC和LDL-C兩方面顯著升高，并且H組顯著高于M組小鼠。在HDL-C方面，H6組與M6組小鼠顯著高于WT6組小鼠，并且H6組小鼠也顯著高于M6組小鼠；同樣H8組與M8組小鼠在HDL-C方面也顯著高于同WT8組小鼠，H8組小鼠也顯著高于M8組；在7月齡組，H7與M7組小鼠顯著高于WT7組小鼠，但是H7組與M7組小鼠相比并沒(méi)有顯著性差異。各組血漿TG沒(méi)顯著性差異，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表3 6月齡各組小鼠血清血脂水平比較Table 3 Comparison of lipid levels in sera among the 6 months old mice

注：不同字母代表具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)

Note：Different uppercase indicate significant statistical difference between at the significance level of 0.05

表4 7月齡各組小鼠血清血脂水平比較Table 4 Comparison of lipid levels in sera among the 7 months old mice

注：不同字母代表具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)

Note：Different uppercase indicate significant statistical difference between at the significance level of 0.05

表5 8月齡各組小鼠血清血脂水平比較Table 5 Comparison of lipid levels in sera among the 8 months old mice

注：不同字母代表具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)

Different uppercase indicate significant statistical difference between at the significance level of 0.05

2.2 ApoE-/-小鼠主動(dòng)脈弓AS病變的觀察

在高倍鏡下觀察，WT6組：6只動(dòng)物主動(dòng)脈弓鏡下均未見(jiàn)動(dòng)脈粥樣硬化(見(jiàn)圖1 A)。M6組：4只動(dòng)物(4/6)主動(dòng)脈弓鏡下見(jiàn)動(dòng)脈粥樣硬化，泡沫細(xì)胞聚集(見(jiàn)圖1B)。H6組：5只動(dòng)物(5/6)主動(dòng)脈弓鏡下均見(jiàn)動(dòng)脈粥樣硬化(見(jiàn)圖1C)。

圖1 6月齡小鼠的HE染色情況注：A.WT6組主動(dòng)脈弓未見(jiàn)病變；B.M6組主動(dòng)脈弓部分出現(xiàn)動(dòng)脈粥樣硬化；C.H6組大多數(shù)出現(xiàn)動(dòng)脈粥樣硬化Fig.1 HE staining of 6 months old miceNote:A. no lesions of aortic arch in WT6 group；B. atherosclerosis in part of aortic arch in M6 group; C. atherosclerosis occurred mostly in H6 group

WT7組：1只動(dòng)物(1/6)可見(jiàn)動(dòng)脈粥樣硬化，內(nèi)膜下纖維斑塊形成，斑塊內(nèi)可見(jiàn)泡沫細(xì)胞及膽固醇結(jié)晶。其余動(dòng)物主動(dòng)脈弓未見(jiàn)明顯異常(見(jiàn)圖2A)。M7組：3只動(dòng)物(3/6)可見(jiàn)動(dòng)脈粥樣硬化，主要表現(xiàn)為血管內(nèi)膜下纖維斑塊形成，斑塊內(nèi)可見(jiàn)泡沫細(xì)胞及膽固醇結(jié)晶，其中1只動(dòng)物(1/6)斑塊局部可見(jiàn)壞死鈣化灶。其余動(dòng)物主動(dòng)脈弓未見(jiàn)明顯異常(見(jiàn)圖2B)。H7組：6只動(dòng)物(6/6)均可見(jiàn)動(dòng)脈粥樣硬化，主要表現(xiàn)為血管內(nèi)膜下纖維斑塊形成，斑塊內(nèi)可見(jiàn)泡沫細(xì)胞，其中5只動(dòng)物(5/6)斑塊內(nèi)可見(jiàn)膽固醇結(jié)晶(見(jiàn)圖2C)。

圖2 7月齡小鼠的HE染色情況注：A.WT7組主動(dòng)脈弓未見(jiàn)病變；B.M7組主動(dòng)脈弓部分出現(xiàn)動(dòng)脈粥樣硬化；C.H7組全部出現(xiàn)動(dòng)脈粥樣硬化Fig.2 HE staining of 7 months old miceNote：A. no lesions of aortic arch in WT7 group；B. atherosclerosis in part of aortic arch in M7group; C. atherosclerosis occurred mostly in H7 group

WT8組：所有動(dòng)物均未見(jiàn)動(dòng)脈粥樣硬化(見(jiàn)圖3A)；M8組：4只小鼠(4/6)主動(dòng)脈弓鏡下可見(jiàn)動(dòng)脈粥樣硬化(見(jiàn)圖3B)；H8組：5只小鼠(5/6)主動(dòng)脈弓鏡下可見(jiàn)動(dòng)脈粥樣硬化(見(jiàn)圖3C)。

圖3 8月齡小鼠的HE染色情況注：A.WT8組主動(dòng)脈弓未見(jiàn)病變；B.M8組主動(dòng)脈弓部分出現(xiàn)動(dòng)脈粥樣硬化；C.H8組大多數(shù)出現(xiàn)動(dòng)脈粥樣硬化Fig.3 HE staining of 8 months old miceNote：A. no lesions of aortic arch in WT8 group；B. atherosclerosis in part of aortic arch in M8group; C. atherosclerosis occurred mostly in H8 group

3 討論

以往的AS動(dòng)物模型多采用極高含量的膽固醇、脂肪的飼料長(zhǎng)期飼養(yǎng)制作，但由于小鼠、大鼠等動(dòng)物先天具有膽固醇抵抗的特性，在制作模型時(shí)，膽固醇負(fù)荷往往是正常膳食的數(shù)十倍的急性過(guò)程，因此與人類的病癥情況相差甚遠(yuǎn)[4-6]。ApoE基因敲除小鼠是由美國(guó)洛克菲勒大學(xué)生化遺傳與代謝實(shí)驗(yàn)室和北卡羅萊那大學(xué)病理遺傳實(shí)驗(yàn)室于1992年應(yīng)用胚胎干細(xì)胞基因敲除技術(shù)培育成功。有研究表明該小鼠用普通飼料喂養(yǎng)也可自發(fā)形成纖維斑塊和復(fù)合斑塊，高脂飼料喂養(yǎng)可以加速AS，并且動(dòng)脈粥樣硬化斑塊分布與人類的相似[7]。田楓等[8]研究發(fā)現(xiàn)普通飼養(yǎng)的ApoE敲除小鼠12個(gè)月時(shí)，其主要血管仍呈現(xiàn)明顯的動(dòng)脈粥樣特征，表明ApoE敲除小鼠是動(dòng)脈粥樣硬化研究的可靠的動(dòng)物模型。據(jù)報(bào)道ApoE敲除小鼠，15～20周齡后逐漸出現(xiàn)纖維斑塊，病變部位以主動(dòng)脈根最為明顯，其次為胸主動(dòng)脈。

本研究中我們采用的是21%脂肪、0.25%膽固醇的“西方膳食”飼料和標(biāo)準(zhǔn)飼料(中等脂肪含量)對(duì)ApoE-/-小鼠進(jìn)行誘導(dǎo)，經(jīng)過(guò)3個(gè)月、4個(gè)月和5個(gè)月的誘導(dǎo)后發(fā)現(xiàn)，相同月齡下，在TC和LDL-C方面，西方膳食組和標(biāo)準(zhǔn)飼料組顯著高于對(duì)照組(WT組)，同時(shí)西方膳食組也顯著高于標(biāo)準(zhǔn)飼料組；在HDL-C方面，飼喂3個(gè)月與5個(gè)月表現(xiàn)出同樣的結(jié)果。但是在飼喂4個(gè)月時(shí)，西方膳食組和標(biāo)準(zhǔn)飼料組都顯著高于對(duì)照組(WT組)，兩組無(wú)顯著差異。在主動(dòng)脈弓病理切片及染色方面，相同月齡下，西方膳食組主動(dòng)脈斑塊明顯并且AS發(fā)病率明顯升高。該小鼠可為AS的多方面研究提供有效的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型：藥物篩選、分子干預(yù)等；以及AS病理學(xué)機(jī)制的相關(guān)研究等。

本研究用含有21%脂肪和0.25%膽固醇的西方膳食飼料(高脂飼料)和10%脂肪的標(biāo)準(zhǔn)飼料飼養(yǎng)ApoE-/-小鼠，經(jīng)3個(gè)月、4個(gè)月及5個(gè)月的飲食處理后，西方膳食飼料喂養(yǎng)的小鼠血漿總膽固醇、高密度脂蛋白指標(biāo)(H6和H8)、低密度脂蛋白指標(biāo)比標(biāo)準(zhǔn)飼料及對(duì)照組組(WT組)明顯升高，同時(shí)標(biāo)準(zhǔn)飼料組也明顯高于對(duì)照組(WT組)；在主動(dòng)脈弓病理切片及染色方面，西方膳食飼料組和標(biāo)準(zhǔn)飼料組都表現(xiàn)出血管內(nèi)膜纖維斑塊形成，斑塊內(nèi)可見(jiàn)泡沫細(xì)胞及膽固醇結(jié)晶的典型動(dòng)脈粥樣硬化病理特征。表明：西方膳食飼料及標(biāo)準(zhǔn)飼料均可誘導(dǎo)ApoE-/-小鼠表現(xiàn)AS病癥，而且西方膳食飼料的誘導(dǎo)效果更明顯。本研究觀察動(dòng)物經(jīng)西方膳食飼料和標(biāo)準(zhǔn)飼料喂養(yǎng)后的血脂情況及ApoE-/-主動(dòng)脈弓的病變特點(diǎn)，為該模型在心血管疾病等老年病學(xué)研究的廣泛應(yīng)用提供了基礎(chǔ)資料。