耿 多,陳 輝,羅瑞明,王麗娟

(寧夏大學(xué),寧夏銀川 750021)

隨著人們生活水平的提高和消費(fèi)觀(guān)念的轉(zhuǎn)變,肉制品的需求量逐年攀升,在利益的驅(qū)使下,很多商販為了提高商業(yè)利潤(rùn),在高價(jià)肉及肉制品中摻入廉價(jià)肉,同時(shí)使用各種添加劑調(diào)整產(chǎn)品口味及色澤,以達(dá)到以假亂真的效果。尤其是牛、羊肉卷和羊肉串等加工制品,消費(fèi)者難以從紋理和口感上對(duì)其進(jìn)行甄別。這些摻假肉制品的出現(xiàn)不僅嚴(yán)重侵犯了消費(fèi)者權(quán)益,更對(duì)消費(fèi)者的身體健康造成了嚴(yán)重危害。因此,建立一種精準(zhǔn)、快速、高通量的檢測(cè)方法,為動(dòng)物源性食品監(jiān)管提供有力的技術(shù)支撐,是當(dāng)前亟需解決的重要問(wèn)題。

目前,肉類(lèi)食品成分鑒別分析技術(shù)大多只針對(duì)單一畜種樣品檢測(cè),能夠?qū)Χ嘈蠓N畜肉同時(shí)檢測(cè)且檢測(cè)時(shí)間低于2 h的檢測(cè)方法研究較少,能對(duì)牛、羊、豬、狗、馬5個(gè)畜種畜肉同時(shí)檢測(cè)的尚未有報(bào)道。因此國(guó)內(nèi)外學(xué)者致力于降低檢測(cè)時(shí)間達(dá)到快速檢測(cè)及提高檢測(cè)通量等相關(guān)方面的研究[1]。已報(bào)道的相關(guān)檢測(cè)方法主要基于核酸分析,包括限制性?xún)?nèi)切酶酶切片段長(zhǎng)度多態(tài)性分析(PCR-RFLP)[2-3]、隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA技術(shù)(RAPD-PCR)[4]、物種特異性PCR(SSR)[5]、DNA序列分析(SA,Sequence Analysis)[6]、實(shí)時(shí)熒光定量PCR(Real-Time PCR)[7]、DNA條形碼(DNA Barcoding)[8]等。從核酸分子水平上進(jìn)行物種鑒別相較于蛋白質(zhì)和光譜分析具有顯著優(yōu)勢(shì)[9],因此本研究中選擇具有特異性強(qiáng)、不受組織類(lèi)別限制等優(yōu)勢(shì)的以聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)為基礎(chǔ)的PCR凝膠電泳法,以動(dòng)物種屬間遺傳信息的差異作為檢測(cè)靶點(diǎn),采用縮短檢測(cè)耗時(shí)及避免操作繁瑣的梯度PCR對(duì)多畜種同時(shí)檢測(cè)。

本研究基于物種特異性PCR技術(shù),建立針對(duì)牛、羊、豬、狗、馬五個(gè)畜種源性肉的檢測(cè)方法,在研究過(guò)程中,針對(duì)牛、羊、豬、狗、馬線(xiàn)粒體基因篩選特異性引物,優(yōu)化各畜種檢測(cè)條件。退火溫度是PCR擴(kuò)增成功的關(guān)鍵因素,為了擴(kuò)增出清晰目的條帶同時(shí)避免雜帶對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的判定產(chǎn)生影響,利用梯度PCR技術(shù)優(yōu)化得到每對(duì)引物的最適退火溫度,對(duì)牛、羊、豬、狗、馬分別設(shè)計(jì)了從51～67 ℃的共計(jì)69組相應(yīng)的適宜溫度及溫度梯度,并且通過(guò)比對(duì)重組質(zhì)粒測(cè)序結(jié)果與GenBank中的目的基因序列,確定牛、羊、豬、狗、馬的PCR產(chǎn)物序列分別與各自目的序列的同源性差異,以制備各畜種動(dòng)物源重組質(zhì)粒,建立常見(jiàn)肉及肉制品快速檢測(cè)模型,以期為快速鑒別牛、羊、豬、狗、馬多畜種畜肉提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

蛋白酶K、紅色熒光核酸染色液(EB1)、瓊脂糖、Tris-Base、核酸提取液(氯仿/異戊醇(24∶1))、D2000、50×TAE、Loading Buffer、氨芐青霉素鈉、IPIG 北京索萊寶科技有限公司;HCl、乙二胺四乙酸(EDTA)、NaCl、三水合乙酸鈉、冰乙酸(分析純) 天津市北聯(lián)精細(xì)化學(xué)品開(kāi)發(fā)有限公司。

TGL-16D冷凍高速離心機(jī) 常州中捷實(shí)驗(yàn)儀器制造有限公司;TLTERTEK BERTHOLD微量核酸蛋白濃度測(cè)定儀 美國(guó)Bio-Rad公司;Minisc及SC型水平電泳槽 美國(guó)Bio-Rad公司;Analyticjena Biosystems Tone Manual普通PCR儀 美國(guó)Bio-Rad公司;Azure Biosystems雙激光-近紅外分子成像系統(tǒng) 美國(guó)Azure Biosystems公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 DNA的提取 將5種畜肉分別使用液氮研磨儀研磨至肉糜粉末狀,4 ℃封口保存。取100 mg畜肉組織樣品,加入500 μL SDS裂解液和20 μL蛋白酶K,55 ℃水浴至溶液透明,加入等體積Tris,12000 r/min離心10 min,取上清液,重復(fù)此步操作一次,加入0.5倍體積的Tris和0.5倍體積的氯仿/異戊醇(24∶1),12000 r/min離心10 min,取上清液加入0.1倍體積的乙酸鈉溶液和2.5倍體積的4 ℃無(wú)水乙醇,待白色沉淀析出,-20 ℃沉淀2 h,12000 r/min離心5 min,吸除上清,70%乙醇500 μL洗滌沉淀,12000 r/min離心5 min棄乙醇,室溫放置揮發(fā)殘余乙醇,加入100 μL TE緩沖液溶解DNA沉淀,-20 ℃保存DNA樣品。

1.2.2 特異性引物的篩選 根據(jù)已報(bào)道的現(xiàn)行檢測(cè)單一畜種方法[12-16]中的引物序列(見(jiàn)表1)進(jìn)行篩選。DNA提取[10-11]后,采用核酸蛋白濃度測(cè)定儀和瓊脂糖凝膠電泳評(píng)估DNA質(zhì)量。PCR條件:總體積50 μL,2×Taq Plus Master Mix 25 μL,上下游引物(10 μmol·L-1)各2 μL,DNA模板0.5 μg。PCR條件:94 ℃預(yù)變性5 min,94 ℃變性30 s,各引物退火溫度不同,遵循種間特異性原則,分別按表1設(shè)定溫度梯度反應(yīng),退火時(shí)間均為30 s,72 ℃延伸60 s,循環(huán)數(shù)分別為30、35、37和40個(gè);72 ℃延伸7 min。取5 μL PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳后,分析凝膠成像結(jié)果。

表1 引物序列、擴(kuò)增片段大小及退火溫度范圍Table 1 The primer sequence,the size of amplified fragments and the range of specific annealing temperature

1.2.3 重組質(zhì)粒的構(gòu)建及PCR產(chǎn)物的序列測(cè)定 a.目的片段的擴(kuò)增、鑒定、回收與純化：挑選每個(gè)畜種中提取兩管DNA作為模板,用已篩選得到的各畜種特異性引物在優(yōu)化得到的最適退火溫度下進(jìn)行PCR擴(kuò)增,凝膠電泳成像儀鑒定后,將鑒定結(jié)果良好的PCR產(chǎn)物分兩個(gè)點(diǎn)樣孔全部點(diǎn)到瓊脂糖凝膠上,電泳結(jié)束后進(jìn)行切膠操作,然后用DNA純化回收試劑盒對(duì)瓊脂糖凝膠中的DNA進(jìn)行回收和純化。b. LB平板制備:待已倒好的LB平板完全凝固后,在其表面加入16 μL 50 mg/mL IPIG和40 μL 20 mg/mL的X-gal,用無(wú)菌彎頭玻璃棒將其輕輕刮涂均勻,37 ℃下放置2 h以使得溶解X-gal 的二甲基甲酰胺揮發(fā)干凈。c.冰浴操作載體連接與轉(zhuǎn)化反應(yīng)：將p GM-T 克隆試劑盒中的組分在冰上完全融化后應(yīng)先瞬時(shí)離心,將掛在壁上的液滴收集到管底。d.陽(yáng)性克隆篩選：轉(zhuǎn)化子在平板上培養(yǎng)12～16 h后,挑選白色菌斑,此為正確的轉(zhuǎn)化子,將其挑取接種到LB液體培養(yǎng)基中,37 ℃、150 r/min搖床振蕩培養(yǎng)過(guò)夜。e.菌液保存、送樣及質(zhì)粒提取：將搖床培養(yǎng)過(guò)夜后得到的渾濁菌液分成三部分,一部分按照質(zhì)粒小提試劑盒的說(shuō)明進(jìn)行質(zhì)粒提取;一部分送樣,由上海生工生物有限公司進(jìn)行單向測(cè)序,測(cè)序所用的引物均為p GM-T載體通用引物;另一部分轉(zhuǎn)到凍存管中加入甘油保護(hù)后放置在-80 ℃條件下作為保存菌液。f.重組質(zhì)粒的鑒定。質(zhì)粒提取出來(lái)后,在微量核酸蛋白濃度測(cè)定儀上測(cè)定其濃度,同時(shí)應(yīng)進(jìn)行質(zhì)粒完整性檢測(cè),最終用EB2(Emotion Buffer)將其稀釋成10 ng/μL,進(jìn)行質(zhì)粒PCR。

1.2.4 序列分析軟件 利用軟件DNA star對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行處理,Gen Bank在線(xiàn)軟件Blast n比對(duì)測(cè)序處理結(jié)果。

1.2.5 生、熟肉檢測(cè)靈敏度及穩(wěn)定性測(cè)定 各畜種生肉清理潔凈后,水浴煮沸,99 ℃時(shí)開(kāi)始計(jì)時(shí)30 min(模擬肉的蒸煮過(guò)程),瀝干水分。DNA提取后,評(píng)估DNA質(zhì)量,系列10倍稀釋,采用已篩選的特異性PCR條件進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng),無(wú)菌雙蒸水作陰性對(duì)照,確定最低DNA濃度檢測(cè)限,分析該方法靈敏性。

1.2.6 常見(jiàn)肉檢測(cè)準(zhǔn)確性及可行性驗(yàn)證 購(gòu)買(mǎi)20種常見(jiàn)熟肉制品和復(fù)雜加工處理的生肉制品,經(jīng)沖洗后在蒸餾水中浸泡1 h,提取DNA,評(píng)估DNA質(zhì)量合格后,分別采用國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)推薦方法與本研究?jī)?yōu)化的快速高效檢測(cè)法進(jìn)行檢測(cè),對(duì)比本研究與國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)常見(jiàn)肉及肉制品動(dòng)物源性成分鑒定結(jié)果,分析該方法的準(zhǔn)確性與可行性。

1.3 常見(jiàn)肉類(lèi)檢測(cè)

鑒別方法建立優(yōu)化后,從寧夏某幾個(gè)市場(chǎng)隨機(jī)購(gòu)買(mǎi)20種常見(jiàn)肉類(lèi)產(chǎn)品進(jìn)行實(shí)際樣品檢測(cè),進(jìn)一步驗(yàn)證該方法的準(zhǔn)確度和可行性。熟肉制品和復(fù)雜加工處理的生肉制品經(jīng)沖洗后在蒸餾水中浸泡1 h,去除產(chǎn)品中部分調(diào)味料和添加劑。每個(gè)樣品DNA采用五個(gè)檢測(cè)體系同時(shí)進(jìn)行檢測(cè),綜合檢測(cè)結(jié)果得出鑒定結(jié)論。

2 結(jié)果與討論

2.1 DNA質(zhì)量評(píng)估結(jié)果

采用核酸蛋白濃度測(cè)定儀和瓊脂糖凝膠電泳對(duì)DNA質(zhì)量進(jìn)行評(píng)估,DNA在260、280 nm處的值均在1.8～2.0之間;DNA完整性良好,條帶清晰明亮。

2.2 特異性引物篩選結(jié)果

特異性引物和退火溫度是影響檢測(cè)結(jié)果特異性是否顯著的重要參數(shù)[17-18],因此退火溫度參數(shù)的篩選廣泛應(yīng)用于物種鑒定及其群體和個(gè)體水平的遺傳差異分析中[19-21]。通過(guò)對(duì)牛、羊、豬、狗、馬的特異性引物篩選,對(duì)5畜種、9對(duì)引物、69組溫度變化、4組平行樣本(1組空白組、3組對(duì)照組)通過(guò)梯度PCR-凝膠電泳成像方法進(jìn)行共計(jì)12000余次摸索篩選引物及反應(yīng)條件試驗(yàn),分別比對(duì)牛(271、79 bp)、羊(133、294、98 bp)、豬(263 bp)、狗(213 bp)、馬(127 bp)等引物(圖1～圖5)退火溫度、循環(huán)數(shù)對(duì)鑒定結(jié)果的影響,分析摒棄有交叉反應(yīng)、引物二聚體及無(wú)明亮清晰條帶等引物特異性差者,確定特異性引物。

圖1 牛引物快速檢測(cè)凝膠成像圖

圖2 羊引物快速檢測(cè)凝膠成像圖

圖3 豬引物快速檢測(cè)凝膠成像圖

圖4 狗引物快速檢測(cè)凝膠成像圖

圖5 馬引物快速檢測(cè)凝膠成像圖

在此過(guò)程中,檢測(cè)到牛引物1在退火溫度為63 ℃時(shí)與馬有交叉反應(yīng),在63.5 ℃時(shí)只有添加馬DNA模板的PCR體系能擴(kuò)增出條帶,而當(dāng)退火溫度進(jìn)一步提高到64、65 ℃時(shí)無(wú)任何條帶擴(kuò)增出,說(shuō)明該引物特異性不好,與馬有交叉反應(yīng),棄用;牛引物2經(jīng)檢測(cè),確定其在54 ℃退火溫度下特異性良好。分析得到,當(dāng)羊引物1退火溫度為59、59.5 ℃時(shí),其與其他五個(gè)畜種均有交叉反應(yīng),當(dāng)進(jìn)一步提高退火溫度到60、60.5 ℃時(shí)只能擴(kuò)增出馬源性DNA,而退火溫度高于61 ℃后無(wú)任何條帶出現(xiàn),說(shuō)明該引物特異性差,與馬有交叉反應(yīng),棄用;羊引物2在53 ℃退火溫度下與其他畜種均有交叉反應(yīng),當(dāng)退火溫度提高到58 ℃時(shí)能擴(kuò)增出其他五個(gè)畜種的DNA,只有羊DNA無(wú)法擴(kuò)增出,該引物不適用于本實(shí)驗(yàn),棄用;羊引物3在低于65 ℃的退火溫度下與其他畜種均有交叉反應(yīng),而在65 ℃時(shí)特異性良好,當(dāng)進(jìn)一步提高退火溫度到67 ℃時(shí)無(wú)任何條帶出現(xiàn)。在豬引物方面,當(dāng)退火溫度低于62 ℃時(shí)與其他畜種均有交叉反應(yīng),當(dāng)退火溫度為60.5、61 ℃時(shí),其與馬有交叉反應(yīng),當(dāng)退火溫度提高到62 ℃時(shí),其具有良好且穩(wěn)定的特異性。狗引物經(jīng)反復(fù)實(shí)驗(yàn),最終確定其在46 ℃時(shí)特異性良好,而退火溫度提高到47 ℃時(shí)該引物不穩(wěn)定。馬引物1在66 ℃的退火溫度下與驢有交叉反應(yīng),當(dāng)退火溫度提高到67 ℃時(shí)其特異性良好,當(dāng)退火溫度提高到67 ℃以上時(shí)無(wú)任何條帶出現(xiàn);馬引物2在60 ℃的退火溫度下與其他畜種均有交叉反應(yīng),而當(dāng)退火溫度提高到62 ℃時(shí)無(wú)任何條帶出現(xiàn),棄用。

此外,本研究中曾選用的牛引物1、羊引物1(見(jiàn)表1)分別為T(mén)artaglia、Herman等設(shè)計(jì),其均為國(guó)內(nèi)飼料中牛、羊源性成分檢測(cè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)所標(biāo)示出來(lái)的引物,但在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中發(fā)現(xiàn),將退火溫度升至63 ℃時(shí),此兩對(duì)引物對(duì)馬源性成分仍有擴(kuò)增。但這并不意味著前人的研究有誤,而是由于前人在實(shí)驗(yàn)中未對(duì)引物是否對(duì)馬源性成分有交叉反應(yīng)[22]做分析和討論,本實(shí)驗(yàn)的研究結(jié)果可作為對(duì)前人研究結(jié)果的補(bǔ)充。由此可進(jìn)一步驗(yàn)證,在PCR反應(yīng)條件摸索確定方面,退火溫度降低時(shí)會(huì)導(dǎo)致非特異性擴(kuò)增[23],提高退火溫度可提高反應(yīng)的特異性[24],但同時(shí)擴(kuò)增效率也會(huì)下降。這與桑付明[25]、黃亞威[26]、Thapana[27]等在研究中的詳盡討論相一致。在序列影響方面,有文獻(xiàn)[28-29]提供了根據(jù)序列中A、T、G、C四種堿基的數(shù)量來(lái)估計(jì)引物退火溫度的公式,但這些公式對(duì)其它影響因素進(jìn)行考量的程度尚有缺乏,計(jì)算出的退火溫度往往和實(shí)際有較大的差距,因此理論值作為重要參考指標(biāo)同時(shí),依然需要試驗(yàn)進(jìn)一步摸索條件[30]。本研究在確定某一引物的退火溫度時(shí),以引物合成報(bào)告為基準(zhǔn),上下5 ℃做梯度PCR,以篩選特異性退火溫度。在特異性引物篩選過(guò)程中,反應(yīng)循環(huán)數(shù)的確定至關(guān)重要,一般循環(huán)數(shù)變化范圍在30～40個(gè)循環(huán)之內(nèi),通過(guò)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),當(dāng)循環(huán)數(shù)為30時(shí),得到的擴(kuò)增產(chǎn)物量較少,直觀(guān)表現(xiàn)為PCR產(chǎn)物經(jīng)電泳后在凝膠成像儀上顯示的條帶亮度不足,而加大循環(huán)數(shù)后,非特異性條帶增多的同時(shí)也延長(zhǎng)了擴(kuò)增時(shí)間,故在同時(shí)考慮條帶亮度和擴(kuò)增所需時(shí)間的基礎(chǔ)上,本實(shí)驗(yàn)最終確定的最佳循環(huán)數(shù)為30。

因此,確定如圖1～圖5顯示最終五畜種的特異性引物及退火溫度為牛2(54 ℃)、羊3(65 ℃)、豬(62 ℃)、狗(46 ℃)、馬2(67 ℃),最佳循環(huán)數(shù)為30,同時(shí)檢測(cè)5種畜肉凝膠電泳檢測(cè)時(shí)長(zhǎng)30 min。表明該方法具有對(duì)多種畜肉可同時(shí)檢測(cè)、特異性好、可重復(fù)性高、穩(wěn)定性好的優(yōu)點(diǎn)。

2.3 PCR產(chǎn)物的重組質(zhì)粒初測(cè)結(jié)果及測(cè)序結(jié)果分析

2.3.1 質(zhì)粒電泳及質(zhì)粒PCR結(jié)果分析 將特異性擴(kuò)增產(chǎn)物切膠純化回收后連接到p GM-T載體上,挑取經(jīng)連接轉(zhuǎn)化、單克隆搖管培養(yǎng)完成后的渾濁培養(yǎng)基中牛源、羊源、豬源、狗源、馬源重組質(zhì)粒進(jìn)行初步檢測(cè),結(jié)果如圖6所示。由圖6可知,牛、羊、豬、狗、馬的質(zhì)粒PCR電泳,初步表明此5種特異性目的片段已成功轉(zhuǎn)化到Top10中。繼而將提取的牛源、羊源、豬源、狗源、馬源重組質(zhì)粒模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增檢測(cè)。如圖7所示,牛(79 bp)、羊(98 bp)、豬(263 bp)、狗(213 bp)、馬(127 bp)的重組質(zhì)粒樣品皆獲得與預(yù)期大小相符條帶,證實(shí)牛源、羊源、豬源、狗源、馬源性目的片段已成功轉(zhuǎn)化到質(zhì)粒中,表明該引物為目標(biāo)特異性引物,可進(jìn)行下一步重組質(zhì)粒測(cè)序的分析。

圖6 質(zhì)粒PCR電泳結(jié)果

圖7 重組質(zhì)粒PCR電泳結(jié)果

2.3.2 重組質(zhì)粒測(cè)序結(jié)果 如表2所示,將牛、羊、豬、狗、馬源性的重組質(zhì)粒PCR 產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果與靶基因序列分析同源性結(jié)果,該結(jié)果表明,牛、羊、豬、狗、馬源性的PCR產(chǎn)物序列分別與Gen Bank 中的目的基因序列均有100%的同一性,測(cè)序結(jié)果進(jìn)一步證明重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化成功。因此本研究中最終確定的特異性引物確為目標(biāo)篩選的各畜種Cyt b中存在的牛源、羊源、豬源、狗源、馬源的特異性引物。表明本研究確定的方法真實(shí)可靠,可用于檢測(cè)鑒定此5種常見(jiàn)畜肉。

表2 動(dòng)物源性成分測(cè)序結(jié)果與Gen bank中序列的比對(duì)Table 2 Comparison between the sequencing result and genome of bovine,ovies,pig,dog and horse

2.4 生、熟肉檢測(cè)靈敏度及穩(wěn)定性

如圖8所示,將牛、羊、豬、狗、馬的生、熟肉DNA模板量系列10倍稀釋,最低至10-8μg,采用已篩選的特異性PCR條件進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng),無(wú)菌雙蒸水作陰性對(duì)照,確定各畜種畜肉的DNA濃度檢測(cè)限。結(jié)果表明,羊的生肉和熟肉源的DNA擴(kuò)增結(jié)果相同濃度間無(wú)顯著差異;牛、豬、狗和馬源性生、熟肉的DNA相同濃度間檢測(cè)結(jié)果差異顯著,牛肉的生肉檢測(cè)限為10-7μg,熟肉為10-2μg;羊肉的生、熟肉檢測(cè)限均為10-2μg;豬肉的生、熟肉檢測(cè)限分別為10-3、10-2μg;狗肉的生、熟肉檢測(cè)限分別為10-2、10-1μg;馬肉的生、熟肉檢測(cè)限分別為10-3、10-2μg。說(shuō)明本研究建立的快速檢測(cè)方法不僅適用于生肉樣品檢測(cè),同時(shí)還適用于熟肉樣品的檢測(cè),最低檢測(cè)限為5×10-7μg,表明該方法靈敏度高。

圖8 各畜種DNA(生、熟肉)用于PCR時(shí)的靈敏度比較

2.5 常見(jiàn)肉類(lèi)檢測(cè)

從寧夏某幾個(gè)市場(chǎng)隨機(jī)購(gòu)買(mǎi)如表3所示的20種常見(jiàn)肉類(lèi)產(chǎn)品進(jìn)行實(shí)際樣品檢測(cè),通過(guò)分析比對(duì)本研究與現(xiàn)行國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)常見(jiàn)肉及肉制品動(dòng)物源性成分鑒定結(jié)果,進(jìn)一步驗(yàn)證該方法的準(zhǔn)確性與可行性?，F(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)每次檢測(cè)1個(gè)樣品,每個(gè)樣品檢測(cè)時(shí)長(zhǎng)40 min;本研究建立的快速檢測(cè)方法每次檢測(cè)5個(gè)樣品,每5個(gè)樣品檢測(cè)時(shí)長(zhǎng)30 min。從表3中實(shí)際樣品檢測(cè)結(jié)果可以看出,該快速檢測(cè)方法與現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)比較,具有同等檢測(cè)效力,且該檢測(cè)方法特異性更強(qiáng),5個(gè)動(dòng)物源性核酸樣品可同時(shí)檢測(cè),檢測(cè)通量更大,檢測(cè)時(shí)間極大縮短,可為畜種鑒別及檢驗(yàn)檢疫工作者提供數(shù)據(jù)理論參考。

表3 肉類(lèi)檢測(cè)結(jié)果(20份樣品)Table 3 Test results of meat(20 samples)

3 結(jié)論

本文通過(guò)梯度PCR電泳法成功建立了基于牛、羊、豬、狗、馬等動(dòng)物源性核酸特異性引物的快速檢測(cè)肉及肉制品基因的快速檢測(cè)方法。與現(xiàn)行肉及肉制品國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)及地方標(biāo)準(zhǔn)相比,最低檢測(cè)限得到進(jìn)一步精確,其中牛肉的生肉檢測(cè)限為10-7μg,熟肉為10-2μg;羊肉的生、熟肉檢測(cè)限均為10-2μg;豬肉的生、熟肉檢測(cè)限分別為10-3、10-2μg;狗肉的生、熟肉檢測(cè)限分別為10-2、10-1μg;馬肉的生、熟肉檢測(cè)限分別為10-3、10-2μg。蛋白質(zhì)及光譜分析檢測(cè)方法往往不適用于熟肉制品的鑒別,而本研究建立的快速檢測(cè)方法不僅適用于生肉樣品的檢測(cè),而且完全可用于熟肉制品的檢測(cè)。此外,5個(gè)動(dòng)物源性核酸樣品的同時(shí)檢測(cè),平均每組5個(gè)樣品節(jié)省200 min,檢測(cè)通量更大,極大地縮短了檢測(cè)時(shí)間。綜上所述,本研究建立的快速檢測(cè)試劑盒方法耗時(shí)短、通量高,5種畜肉可同時(shí)進(jìn)行檢測(cè)。本實(shí)驗(yàn)為各檢驗(yàn)檢疫等分析機(jī)構(gòu)進(jìn)行實(shí)際樣品檢測(cè)提供理論依據(jù)、方法指導(dǎo)和技術(shù)支持,有望在各基層單位推廣應(yīng)用。