楊巨鵬,呂春霞,雷葉斯,張慧恩,曹少謙,楊 華

(浙江萬里學(xué)院,浙江寧波 315100)

大黃魚(Pseudosciaenacrocea)俗名又稱大鮮、大黃花[1],資源豐富,且具有非常高的食用價(jià)值[2],是我國傳統(tǒng)意義上的四大海產(chǎn)之一?，F(xiàn)今對(duì)大黃魚的研究主要集中在養(yǎng)殖、保鮮、魚肉深加工三個(gè)方面[3]。大黃魚蛋白質(zhì)含量很高,擁有豐富的微量元素和多種維生素,對(duì)人體的滋補(bǔ)效果明顯。除了作為常用菜肴之外,還可以作為身體虛弱老人的一道食補(bǔ)菜,它含硒豐富,所以可以很大程度地消滅新陳代謝產(chǎn)生的自由基,延緩衰老,預(yù)防多種癌癥的發(fā)生[4]。中醫(yī)認(rèn)為,大黃魚可以健脾胃、治痢疾、補(bǔ)氣、補(bǔ)精,不僅如此,它還對(duì)于貧血、失眠、頭暈、食欲不振等不良癥狀有很好的食療功效[5]。

超高壓技術(shù)(ultrahigh pressure,UHP)是一種新興食品加工技術(shù),即將食品通過一定的液體介質(zhì)(一般情況下為水、甘油等),在一定的溫度下對(duì)樣品采用100～1000 MPa高壓處理適當(dāng)時(shí)間[6]。UHP屬于一項(xiàng)非熱加工技術(shù),利用物理作用,避免熱加工的破壞作用,從而達(dá)到殺滅食品中的微生物、鈍化酶或使其部分失活、使蛋白質(zhì)變性的效果,實(shí)現(xiàn)延長食品貨架期、保持食品原有營養(yǎng)成分與風(fēng)味[7-8]的效果,現(xiàn)階段UHP已在諸多食品領(lǐng)域有所運(yùn)用[9]。UHP可以把維持蛋白空間結(jié)構(gòu)的各種化學(xué)鍵破壞,導(dǎo)致其空間結(jié)構(gòu)改變,甚至使蛋白發(fā)生變性。目前,超高壓對(duì)養(yǎng)殖大黃魚肌動(dòng)球蛋白生化特性的影響鮮有報(bào)道。鑒于此,本文通過研究超高壓處理后養(yǎng)殖大黃魚肌動(dòng)球蛋白生化特性的變化,為科學(xué)加工大黃魚提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

新鮮死的養(yǎng)殖大黃魚(0.5～1.0 kg) 寧波市水產(chǎn)市場(chǎng);磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀、乙酸、馬來酸(順丁烯二酸)、Tris(三羥甲基氨基甲烷)、1-苯胺基8-萘基碩酸鹽(ANS)、氯化鉀 均為分析純,國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;5.5-二硫代雙-C2-硝基苯甲酸(DTNB BR)、EDTA Na2(乙二胺四乙酸二鈉)國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;Ca2+-ATPase酶測(cè)試盒(貨號(hào):A070-4) 南京建成生物工程研究所。

Centrifuge 5804R離心機(jī) 德國Eppendorf;F-80高速粉碎機(jī) 姜堰市新康醫(yī)療器械有限公司;J-26XP高速冷凍離心機(jī) 美國貝克曼庫爾特;Forma-725超低溫冰箱 艾本德中國有限公司;BCD-216ZDJ可調(diào)式冰箱 青島海爾特種電冰柜有限公司;UV2000 紫外分光儀 上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司;DK-8恒溫水浴鍋 上海維誠儀器有限公司;AFS-3100熒光分光光度計(jì) 北京市海光儀器有限公司;SYSTEM GelDoc XR+BIO-RAD凝膠成像儀 伯樂公司;HPP.M超高壓處理設(shè)備 天津市華泰森淼生物工程技術(shù)有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 大黃魚肌動(dòng)球蛋白的提取 取養(yǎng)殖大黃魚背部肌肉用絞碎機(jī)絞碎,取背部肌肉10 g,放入離心杯,再加入40 mL 4 ℃磷酸緩沖液(pH=7.5),充分?jǐn)嚢韬箅x心分離10 min,轉(zhuǎn)速6000 r/min,溫度4 ℃,取杯內(nèi)的下部沉淀物,然后將此操作重復(fù)4次。然后向最后一次提取好的沉淀中加入60 mL pH7.5 mol/L的氯化鉀磷酸緩沖液。在4 ℃冰箱內(nèi)靜置,時(shí)間為20 h,靜置期間用0.5 mol/L Na2HPO4控制pH為7.5,將提取液在8000 r/min 4 ℃的條件下離心分離15 min。然后取上清液用3層紗布過濾,只保留濾液。提前在容器中準(zhǔn)備好10倍提取液體積的冷卻水,將提取液隨著容器壁慢慢地注入,并緩緩攪拌。此時(shí)溶液用5%乙酸調(diào)節(jié)pH,至5.5～5.6左右,靜置冷卻。上下分層明顯后,棄去上清液,再將沉淀下來的蛋白質(zhì)在6000 r/min,4 ℃的條件下離心分離10 min。用容器收集蛋白,測(cè)定蛋白沉淀量,然后加入一定量3 mol/L的KCl溶液,使得KCl的最終濃度為0.6 mol/L,再用0.6 mol/L KCl-20 mmo1/L Tris-馬來酸緩沖液(pH=7.0)透析過夜,在11000 r/min,4 ℃的條件下離心分離15 min,所得上清液即為肌動(dòng)球蛋白溶液,按照順序編號(hào),放在4 ℃冰箱冷藏備用[10]。

首先對(duì)肌動(dòng)球蛋白進(jìn)行高壓蒸煮袋真空包裝,然后再用聚乙烯塑料進(jìn)行第二次真空包裝,第一次裝不得留有氣泡或者頂隙,第二次包裝是為了防止破壞單層蒸煮袋。放入超高壓機(jī)器,在300、350、400 MPa下分別保壓3、6、9 min,取出后快速采用冰水進(jìn)行冷卻,并進(jìn)行理化性質(zhì)分析,未用完的樣品放入-20 ℃冰箱保存。

1.2.2 Ca2+-ATPase活性測(cè)定 采用南京建成生物工程研究所所提供的超微量Ca2+-ATPase酶測(cè)試盒(貨號(hào):A070-4)實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行,酶活力單位的定義如下:

式中,酶的活力單位:微摩爾磷/毫克蛋白/小時(shí)(μmol Pi/mg prot/h);ATPase活力單位:U/mg prot;標(biāo)準(zhǔn)品濃度:0.02 μmol/mL;待測(cè)樣本蛋白濃度:mg prot/mL。

注:6:單位上是用小時(shí),但是操作時(shí)間只有10 min,所以要乘以6;2.8:在反應(yīng)體系中進(jìn)行2.8倍的稀釋。

1.2.3 表面疏水性測(cè)定 用ANS熒光探針法測(cè)定表面疏水性[11]。用0.6 mol/L KCl-磷酸鹽緩沖液將肌動(dòng)球蛋白稀釋成5個(gè)濃度(0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mg/mL),取2 mL樣品,在20 ℃孵育10 min,加入8 mmol/L ANS溶液10 μL,設(shè)定激發(fā)波長λex=390 nm(狹縫校正5 nm),發(fā)射波長λex=470 nm(狹縫校正5 nm),測(cè)定熒光強(qiáng)度。以熒光強(qiáng)度對(duì)蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度作曲線,曲線初始階段的斜率即為蛋白質(zhì)的表面疏水性指數(shù)(S0)。

PPP項(xiàng)目融資指的就是國家政府和個(gè)人企業(yè)為了公共設(shè)施的建設(shè)暫時(shí)達(dá)成的一種具有合作意義的關(guān)系。PPP項(xiàng)目最早是由英國政府為了緩解國內(nèi)的資金流動(dòng)，建設(shè)公共設(shè)施而提出的模式，這種模式能夠充分的利用民間資本極大的彌補(bǔ)資金上的短缺問題，從而降低投資上的風(fēng)險(xiǎn)問題。就目前國內(nèi)發(fā)展現(xiàn)狀來說，我國還處于社會(huì)主義初期階段，各項(xiàng)公共基礎(chǔ)設(shè)施還不完善，建設(shè)資金也十分有限，所以才會(huì)引用PPP機(jī)制，使得我國的公共基礎(chǔ)設(shè)施建設(shè)得到了很好的發(fā)展。

1.2.4 活性巰基含量測(cè)定 參照朱東宏等[12]的實(shí)驗(yàn)方法,并稍作修改。向1 mL蛋白樣液中加入9 mL的Tris-HCl(0.2 mol/L,pH6.8,10 mmol/L EDTA)緩沖液。取4 mL上述混合液,加入0.4 mL 0.1% DTNB溶液,在4 ℃的條件下靜置1 h后于412 nm下進(jìn)行比色?？瞻讟右簩⒌鞍讟右簱Q成蒸餾水即可?；钚詭€基含量計(jì)算方法

式中,B是在除去試劑空白之后在412 nm處的吸光值;D是在此反應(yīng)過程中稀釋的倍數(shù),C為蛋白質(zhì)濃度(mg/mL)。

1.2.5 蛋白質(zhì)熱變性 將超高壓處理過的肌動(dòng)球蛋白溶液進(jìn)行冷凍干燥處理,所得肌動(dòng)球蛋白固體樣品放入-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩Ｓ貌钍緬呙枇繜岱?DSC)分析蛋白質(zhì)熱變性[13]。精確稱取冷凍干燥處理過的肌動(dòng)球蛋白固體樣品3～9 mg置于鋁坩堝中,記錄數(shù)值精確到1/10000 g,保持初始溫度為30 ℃,密封坩堝,放入儀器,進(jìn)行測(cè)定。保持恒定的溫度5 min,加熱范圍為30～180 ℃,加熱速率為10 ℃/min,氮?dú)饬髁繛?00 mL/min,反應(yīng)氣體流量50 mL/min,空坩堝作為對(duì)照樣,平行測(cè)定3次。

1.2.6 SDS-PAGE電泳的測(cè)定 取適量樣品,用0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液調(diào)整濃度為1 mg/mL左右,取5 μL調(diào)整好的樣品,加入5 μL蛋白質(zhì)上樣緩沖液,100 ℃加熱3 min,冷卻至室溫后取10 μL進(jìn)行點(diǎn)樣,分離膠質(zhì)量分?jǐn)?shù)為12%,濃縮膠質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%。電泳結(jié)束標(biāo)志為溴酚藍(lán)到達(dá)分離膠底部上方約1 cm處,關(guān)閉電源,取出凝膠。用0.1%的考馬斯亮藍(lán)R-250對(duì)凝膠進(jìn)行染色20 min,用25%的甲醇和7%的醋酸混合液脫色。用BIO-RAD凝膠成像儀拍照,并保存圖片。

1.3 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)結(jié)果采用Excel與Origin進(jìn)行處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 超高壓處理對(duì)養(yǎng)殖大黃魚肌動(dòng)球蛋白的Ca2+-ATPase活性的影響

魚體中存在的肌球蛋白與肌動(dòng)蛋白在ATP作用下生成肌動(dòng)球蛋白,而肌球蛋白的重要生物活性之一就是具有Ca2+-ATPase活性。活性反映肌球蛋白頭部性質(zhì)的變化,是魚肉在保鮮過程中蛋白質(zhì)性質(zhì)的一個(gè)重要指標(biāo),其活性值越高,說明蛋白質(zhì)性質(zhì)越穩(wěn)定,變性程度越小。同時(shí)鈣離子ATP酶活力的大小反映了肌球蛋白分子完整性[14-15]。

由圖1可得出超高壓處理對(duì)大黃魚肌動(dòng)球蛋白的影響顯著(p<0.05),肌動(dòng)球蛋白的鈣離子ATP酶活性出現(xiàn)明顯改變。在保壓時(shí)間3 min下,樣品鈣離子ATP酶活性隨壓力上升呈現(xiàn)先增后減又增趨勢(shì);在保壓時(shí)間6 min下,樣品鈣離子ATP酶活性隨壓力上升呈現(xiàn)先增后減趨勢(shì);而9 min保壓時(shí)間下,樣品鈣離子ATP酶活性隨壓力上升呈現(xiàn)逐漸降低趨勢(shì)。在同一壓力下,在400 MPa壓力下隨著處理壓力時(shí)間的增加,鈣離子ATP酶活性隨保壓時(shí)間延長呈現(xiàn)逐漸降低趨勢(shì);在300、350 MPa壓力下隨著處理壓力時(shí)間的增加,鈣離子ATP酶活性隨保壓時(shí)間延長呈現(xiàn)呈現(xiàn)先增后減趨勢(shì)。高壓過程中,過高的壓力使肌動(dòng)球蛋白分子的表面結(jié)構(gòu)有所改變,破壞了蛋白質(zhì)原有的排列方式,使表現(xiàn)出來的鈣離子ATP酶活性降低。由于壓力越大,表面結(jié)構(gòu)改變?cè)酱?400 MPa 9 min處理的樣品鈣離子ATP酶活性最低。

圖1 不同壓力及不同保壓時(shí)間作用下Ca2+-ATPase活性變化Table 1 Changes of Ca2+-ATPase activity under different pressure and pressure holding time

2.2 超高壓處理對(duì)養(yǎng)殖大黃魚肌動(dòng)球蛋白的表面疏水性影響分析

表面疏水性屬于蛋白質(zhì)的重要性質(zhì),對(duì)于維持蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性和生物活性有著很大的作用[19]。疏水基團(tuán)和極性溶液環(huán)境結(jié)合數(shù)目的指標(biāo)是蛋白質(zhì)表面疏水性,蛋白的表面疏水性是用來衡量蛋白變性程度的,這是因?yàn)樗軌蚍磻?yīng)蛋白位點(diǎn)在化學(xué)上或物理上的微妙變化,同時(shí)可以體現(xiàn)出蛋白表面疏水性氨基酸的相對(duì)含量[19]。表面疏水性在蛋白結(jié)構(gòu)研究中是一個(gè)普遍的指標(biāo)。一般認(rèn)為由于氧化使得埋藏在蛋白天然構(gòu)像內(nèi)部的疏水性氨基酸殘基暴露出來,繼而提高了蛋白表面的疏水性。

由圖2可得出超高壓處理后大黃魚肌動(dòng)球蛋白表面疏水性變化顯著(p<0.05)。在同一保壓時(shí)間下,隨著壓力增加,表面疏水性也隨之增加;在同一壓力下,隨著保壓時(shí)間增加,表面疏水性也隨之增加。但9 min 350 MPa以后,表面疏水性增加的趨勢(shì)有所減緩(p>0.05)?？赡苁怯捎诔邏哼^程中,過高的壓力破壞了蛋白質(zhì)的表面結(jié)構(gòu),讓內(nèi)部的疏水性基團(tuán)暴露在蛋白質(zhì)表面,破壞了蛋白質(zhì)原有的排列方式和順序,提高了蛋白質(zhì)表面的疏水性。同時(shí),350 MPa的高壓處理時(shí),蛋白質(zhì)內(nèi)部的疏水性氨基酸已經(jīng)大部分暴露在蛋白質(zhì)表面了,故400 MPa處理下表面疏水性增加趨勢(shì)有所減緩。壓力對(duì)疏水作用的影響可能主要是由于水化壓縮性之間的差量導(dǎo)致蛋白分子的展開[16]。疏水區(qū)域的暴露是大的肌球蛋白聚集體形成的先決條件。疏水基團(tuán)在蛋白質(zhì)發(fā)生凝聚時(shí)起了促進(jìn)作用,促進(jìn)方式主要是通過加強(qiáng)蛋白質(zhì)之間的相互作用[15]。

2.3 超高壓處理對(duì)養(yǎng)殖大黃魚肌動(dòng)球蛋白的活性巰基影響分析

絕大多數(shù)的巰基存在于半胱氨酸中,其是蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的重要組成部分,也是生物體內(nèi)一些氧化還原反應(yīng)的基礎(chǔ)基團(tuán)。蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)中兩個(gè)巰基脫氫形成的二硫鍵能使相鄰多肽得以連接,這一點(diǎn)在維持蛋白質(zhì)完整結(jié)構(gòu)上有著十分重要的意義,并且在一定程度上可以反映超高壓處理對(duì)養(yǎng)殖大黃魚肌動(dòng)球蛋白的變性情況[21]。

由圖3可以看出,超高壓處理對(duì)大黃魚肌動(dòng)球蛋白的影響顯著(p<0.05),在同一保壓時(shí)間下,隨著壓力增加,活性巰基含量也隨之增加;在同一壓力下,隨著保壓時(shí)間增加,活性巰基含量也隨之增加。但350 MPa以后,活性巰基含量增加的趨勢(shì)有所減緩?？赡苁怯捎诔邏哼^程中,壓力促使蛋白質(zhì)開始變性和展開,逐漸促進(jìn)蛋白形成致密有序的三維網(wǎng)絡(luò)凝膠結(jié)構(gòu)[23]。同時(shí)其在350 MPa高壓處理下,致密有序的三維網(wǎng)絡(luò)凝膠結(jié)構(gòu)已經(jīng)大致形成,故400 MPa處理下活性巰基含量增加趨勢(shì)有所減緩。肌動(dòng)球蛋白在變性過程中發(fā)生了共價(jià)交聯(lián),活性巰基大多數(shù)會(huì)脫氫形成雙硫鍵。此外,巰基脫氫形成雙硫鍵的反應(yīng),一定的條件下是可逆的[22]。Lanier等[23]報(bào)道二硫鍵的形成對(duì)魚糜凝膠有重要作用。由于肌動(dòng)球蛋白中含有巰基的氨基酸在變性過程中形成二硫鍵,這對(duì)凝膠形成具有重要作用。

圖3 不同壓力及不同保壓時(shí)間作用下的活性巰基含量變化Table 3 Changes of active sulfhydryl content under different pressure and pressure holding time

2.4 超高壓處理對(duì)養(yǎng)殖大黃魚肌動(dòng)球蛋白的蛋白質(zhì)熱變性影響分析

超高壓處理會(huì)引起魚體中肌動(dòng)球蛋白的變性,蛋白質(zhì)發(fā)生變性其熱焓也會(huì)發(fā)生變化,采用差示掃描量熱儀(DSC)進(jìn)行分析[15],DSC曲線中的吸收峰表示蛋白熱量被吸收,也是蛋白質(zhì)的熱變性的過程,目標(biāo)蛋白會(huì)呈現(xiàn)固定的吸收峰;峰值的變化、變性溫度的位移和消失可反映蛋白的變性情況。由此可根據(jù)DSC圖譜的變化推測(cè)蛋白構(gòu)象的變化,進(jìn)而得到超高壓處理后肌動(dòng)球蛋白結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性。

如圖4所示,經(jīng)超高壓處理后的的熱焓高于未處理組樣品,超高壓組按保壓變化時(shí)間長短由短到長分別在118、109、101 ℃時(shí)出現(xiàn)吸收峰,而空白組在147 ℃出現(xiàn)吸收峰,說明超高壓處理降低了肌動(dòng)球蛋白的熱穩(wěn)定性,超高壓處理破壞肌動(dòng)球蛋白構(gòu)象,導(dǎo)致變性溫度降低。

圖4 超高壓處理對(duì)養(yǎng)殖大黃魚肌動(dòng)球蛋白的蛋白質(zhì)熱變性影響分析Table 4 Effects of ultrahigh pressure treatment on protein thermal denaturation of cultured large yellow croaker actin

蛋白質(zhì)的熱變的過程是一個(gè)吸熱的過程,通常情況為蛋白質(zhì)吸收能量,內(nèi)部氫鍵發(fā)生斷裂,其高級(jí)結(jié)構(gòu)展開,破壞了原有的構(gòu)象。從DSC曲線中能夠間接表現(xiàn)出蛋白質(zhì)內(nèi)部結(jié)構(gòu)的變化情況,變性焓值和蛋白質(zhì)的變性程度有著負(fù)相關(guān)的關(guān)系,變性焓值越小,變性程度就越大,反之亦然[24]。

2.5 超高壓處理對(duì)養(yǎng)殖大黃魚肌動(dòng)球蛋白的SDS-PAGE電泳影響分析

肌動(dòng)球蛋白并不是一種單一的蛋白,它是由肌動(dòng)蛋白和肌球蛋白組合形成的復(fù)合體[24]。肌球蛋白分子中有6條肽鏈,其中有2條分子質(zhì)量約200 kDa的重鏈(MHC)和4條分子質(zhì)量約20 kDa的輕鏈(MLC);而肌動(dòng)蛋白則較為簡(jiǎn)單,其內(nèi)部一般只有分子質(zhì)量在45 kDa左右的單鏈多肽鏈。

由圖5可知,超高壓處理對(duì)肌動(dòng)球蛋白影響明顯。與對(duì)照組相比,經(jīng)過超高壓處理的樣品在200 kDa左右的條帶均有明顯變淡和變淺,說明超高壓破壞了肌球蛋白中的重鏈結(jié)構(gòu)。隨著超高壓壓力的增加和保壓時(shí)間的延長,下部分子量較低的條帶各有不同程度的加粗和加深,說明在此區(qū)域內(nèi)的蛋白有所增加,很有可能是因?yàn)槌邏浩茐牧思?dòng)球蛋白分子的結(jié)構(gòu),將一部分的大分子蛋白破碎成小分子蛋白,總體分子量有所減少。

圖5 超高壓處理對(duì)養(yǎng)殖大黃魚肌動(dòng)球蛋白的電泳圖Table 5 Electrophoresis of actin in cultured large yellow croaker (Pseudosciaena crocea)by ultrahigh pressure treatment

3 結(jié)論

利用超高壓對(duì)養(yǎng)殖大黃魚肌動(dòng)球蛋白進(jìn)行處理,發(fā)現(xiàn)肌動(dòng)球蛋白在不同的壓力和保壓下肌動(dòng)球蛋白分子結(jié)構(gòu)發(fā)生改變和破壞。隨保壓時(shí)間的增加和壓力的增大,大黃魚肌動(dòng)球蛋白的鈣離子ATP酶活性整體呈下降趨勢(shì),表面疏水性隨之增大,活性巰基含量增加,蛋白質(zhì)熱變性變性焓值也隨之減少,蛋白質(zhì)分子量有所下降。故超高壓能使肌動(dòng)球蛋白發(fā)生聚集或斷裂,進(jìn)而影響蛋白質(zhì)生化特性。本文通過超高壓,研究肌動(dòng)球蛋白在不同的壓力以及不同保壓的影響,以便為養(yǎng)殖大黃魚的貯藏和加工中提供理論依據(jù),降低了獲取高質(zhì)量凝膠的難度,更易得到優(yōu)質(zhì)的魚糜制品。