張雅碩,侯一超,張紫薇,滿朝新,姜毓君

(東北農(nóng)業(yè)大學食品學院,乳品科學教育部重點實驗室,黑龍江哈爾濱 150030)

近年來,隨著乳酸菌作用機制的不斷研究,乳酸菌被廣泛應用于食品行業(yè)、醫(yī)藥行業(yè)、輕工業(yè)及畜禽生產(chǎn)業(yè)等眾多領(lǐng)域,這也促進了發(fā)酵劑種類的更新。目前制作乳酸菌發(fā)酵劑的方法有很多,主要有真空干燥、噴霧干燥、真空冷凍干燥和流化床干燥等,但應用較為廣泛和有效的是真空冷凍干燥技術(shù)。真空冷凍干燥主要分為三步,首先是產(chǎn)品的預凍,讓發(fā)酵劑中的水分凍結(jié)成冰,但預凍的速度和時間因菌種而異;其次是升華干燥,也稱為第一階段干燥,通過降低真空度,使環(huán)境中水的蒸汽壓降低,冰晶直接轉(zhuǎn)化為水蒸氣從制品中溢出;最后是解析干燥階段,主要是除去產(chǎn)品中結(jié)合水,使制品的水分含量達到要求,利于儲藏。

在真空冷凍干燥過程中,乳酸菌主要經(jīng)受兩種刺激,即冷凍和干燥,為了減少這兩個過程對微生物造成的損傷,必須采取有效的措施。其中,保護劑的應用是第一保護策略[1]。乳酸菌凍干保護劑可按照不同的方式進行分類,按相對分子量大小可分為兩類[2-3],一類是低分子量化合物(如糖類、醇類和抗氧化劑等),這類物質(zhì)在冷凍干燥過程中能夠進入細胞,與水分子相互作用,增加溶液的黏度,弱化水的結(jié)晶過程,從而減少細胞損傷;另一類是高分子量化合物(如脫脂奶粉、可溶性淀粉和聚合物類等),這類物質(zhì)能夠在凍干時使溶液呈過冷狀態(tài),降低細胞外溶質(zhì)濃度,避免由于鹽類濃縮而使細胞脫水,從而減少細胞發(fā)生滲透性休克、細胞壁和細胞膜塌陷、蛋白質(zhì)鹽析變性等不良后果。在真空冷凍干燥過程中,低分子量保護劑發(fā)揮直接作用,高分子量保護劑起到促進前者的保護作用,因此高分子和小分子保護劑配合使用,會使乳酸菌在凍干期間維持較高的活性。由于微生物細胞結(jié)構(gòu)和大小有差異,因此需要根據(jù)菌株的特異性而選擇合適的凍干保護劑[4]。此外,改變工藝參數(shù),如預凍溫度、預凍時間等也可以減少真空冷凍干燥對細胞造成的損傷[5]。本研究以副干酪乳桿菌為研究對象,對保護劑配方和真空冷凍干燥工藝參數(shù)進行優(yōu)化,以確定制備副干酪乳桿菌凍干菌粉的最佳工藝。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

副干酪乳桿菌(Lactobacillusparacasei) 分離自我國傳統(tǒng)發(fā)酵稀奶油,本實驗室保存;MRS液體培養(yǎng)基:葡萄糖20 g,蛋白胨10 g,牛肉浸粉8 g,乙酸鈉5 g,酵母浸粉4 g,磷酸氫二鉀2 g,檸檬酸氫二鉀2 g,硫酸鎂0.2 g,硫酸錳0.04 g,吐溫-80 1 mL,加蒸餾水至1000 mL,調(diào)pH為7.0～7.2,于121 ℃下滅菌15 min;MRS計數(shù)培養(yǎng)基:向MRS液體培養(yǎng)基中加入1.5%～2.0%(w/v)瓊脂粉;海藻糖 Sigma生物試劑有限公司;乳糖 北京索來寶科技有限公司;蔗糖 上?？笊锛夹g(shù)有限公司;麥芽糊精 上海瑞永生物科技有限公司;酵母粉 北京奧博星生物技術(shù)有限公司;可溶性淀粉 天津基準化學試劑有限公司;聚乙烯吡咯烷酮(PVP K-30)、谷胱甘肽(GSH) 生工生物工程(上海)股份有限公司;明膠 天津市永大化學試劑開發(fā)中心;維生素C 天津市光復科技發(fā)展有限公司;脫脂奶粉 市售。

3K15型高速離心機 美國SIGMA公司;ALPHA 1-4 LSC plus型真空冷凍干燥機 德國CHRIST公司;S-3400N型掃描電子顯微鏡、E-1010型離子濺射鍍膜儀 日本日立公司;酶標儀 瑞士TECAN公司;BXM-30R型立式壓力蒸汽滅菌器 上海博訊醫(yī)療生物儀器股份有限公司;PL2002型電子天平(0.01 g)、MS-TS型分析天平(0.0001 g)、Delta320型pH計 梅特勒-托利多儀器有限公司

1.2 實驗方法

1.2.1 工藝流程 菌種活化→擴大培養(yǎng)→菌體收集→洗滌→離心收集→菌體懸浮液配制(添加凍干保護劑溶液)→活菌計數(shù)→真空冷凍干燥→存活因子的測定。

1.2.2 工藝操作要點

1.2.2.1 菌體的活化、生長曲線的測定及擴大培養(yǎng) 將副干酪乳桿菌以2%的接種量接種到新鮮的MRS液體培養(yǎng)基中,37 ℃培養(yǎng)18 h,用接種環(huán)蘸取少量菌液于MRS固體平板上三區(qū)劃線,37 ℃培養(yǎng)48 h,挑取典型的單菌落接種于新鮮的MRS液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)18 h,以此反復3次,第三代得到的菌液作為工作液。

將活化好的副干酪乳桿菌按2%的接種量接種至100 mL MRS液體培養(yǎng)基中,在37 ℃下培養(yǎng)24 h。每隔2 h測定一次菌液的OD620值,以時間為橫坐標,OD620值為縱坐標建立菌株的生長曲線。

將活化三次后的菌液,以2%的接種量接種至錐形瓶進行擴大培養(yǎng)[6]。

1.2.2.2 菌體的收集 將培養(yǎng)好的菌液置于離心機中,5000×g 4 ℃條件下離心10 min,棄上清液,用0.85%無菌生理鹽水洗滌菌體兩次后,再以同樣的條件離心即得菌體沉淀。

1.2.2.3 菌體細胞的真空冷凍干燥法制備 保護劑溶液的配制:將大分子保護劑、糖類、聚合物類中的一種或幾種保護劑按一定的濃度用蒸餾水溶解,攪拌均勻,于115 ℃下滅菌15 min,置于4 ℃冰箱中保存?zhèn)溆?維生素C、谷胱甘肽采用膜孔徑為0.22 μm的濾膜過濾除菌。

真空冷凍干燥:在5000×g 4 ℃條件下離心10 min收集菌體沉淀,按菌液(未離心前體積)與保護劑比例(v/v)為1∶1加入不同配方的保護劑溶液,計算初始細胞活菌數(shù)后分裝進行冰箱預凍(-80 ℃,2 h),凍結(jié)完全后將預凍好的樣品放入冷阱溫度為-53.2 ℃,真空度為0.162 mbar的真空冷凍干燥機內(nèi)凍干24 h,然后置于-20 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 單因素實驗

1.2.3.1 凍干保護劑種類的選擇 單一凍干保護劑的選擇:分別選用以下保護劑[7-9]與菌體充分混勻,觀察菌體的存活情況。

大分子保護劑:分別選用脫脂奶粉、酵母粉、可溶性淀粉、麥芽糊精進行試驗,濃度均為10%。

糖類保護劑:分別選用海藻糖、蔗糖、乳糖進行試驗,濃度均為10%。

聚合物類保護劑:分別選用PVP K-30、明膠進行試驗,濃度均為5%。

抗氧化劑類保護劑:分別選用維生素C、GSH進行試驗,濃度均為1%。

1.2.3.2 凍干保護劑濃度的選擇 根據(jù)上述試驗結(jié)果,以凍干菌粉的菌體存活因子為指標,選擇保護效果最好的四種保護劑,分別設(shè)置不同的濃度梯度進行試驗,以確定其加入的最適濃度。其中脫脂奶粉、蔗糖濃度為0、5%、10%、15%、20%;PVP K-30濃度為0、1%、3%、5%、7%、9%;GSH濃度為0、0.4%、0.7%、1.0%、1.3%、1.6%。

1.2.4 復合凍干保護劑濃度的篩選 選擇單因素優(yōu)化后的真空冷凍干燥保護劑及其相應濃度,以存活因子為指標,通過正交試驗L9(34)選出效果最佳的凍干保護劑配方,試驗因素水平如表1。

表1 保護劑正交因素水平表

1.2.5 預冷溫度的確定 取生長到指數(shù)中期的菌液,用無菌生理鹽水洗兩次,重懸于等體積新鮮的MRS肉湯中,分別放置于4、10、15、20 ℃溫度下處理2 h,再置于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至穩(wěn)定期。對照組為培養(yǎng)至穩(wěn)定期的菌液。收集各處理條件下的樣品,按照1.2.2.3進行真空冷凍干燥處理,并計算菌體的存活因子。

1.2.6 真空冷凍干燥保護劑pH的選擇 將篩選出來的復合保護劑用滅菌的乙酸或氨水分別調(diào)pH為5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5,在37 ℃下與菌體平衡20 min后進行真空冷凍干燥,計算出菌體的存活因子。

1.2.7 菌液和保護劑比例的確定 按照上述優(yōu)化的試驗方法,以菌液/保護劑為1∶1、1∶1.5、1∶2、1∶2.5、1∶3 (v/v)的比例,研究其對菌體凍干存活因子的影響。

1.2.8 凍干厚度的確定 在上述菌液和保護劑添加比例的基礎(chǔ)上,對凍干厚度進行研究。將菌泥和保護劑振蕩混勻后,以不同的厚度(0.3、0.4、0.5、0.6、0.7 cm)裝入玻璃平皿中,置于真空冷凍干燥機內(nèi)進行凍干,計算其存活因子,確定出最佳的凍干厚度。

1.2.9 預凍方式的選擇 按照上述優(yōu)化的試驗方法,將樣品分別置于-20 ℃冷凍2 h,-80 ℃冷凍2 h,-196 ℃冷凍15 min,然后真空冷凍干燥24 h,測菌體存活因子[10-11]。

1.2.10 菌粉電鏡觀察 將未添加保護劑組菌粉和添加復合保護劑組菌粉粘貼在樣品臺上,采用E-1010型離子濺射鍍膜儀鍍一層厚度約為150 ?的金屬鉑膜,使用S-3400N型掃描電鏡進行觀察并拍照。

1.2.11 測定方法 副干酪乳桿菌活菌數(shù)測定:將凍干前副干酪乳桿菌菌液及凍干后復水恢復活性的樣品進行10倍梯度連續(xù)稀釋,取10-6、10-7、10-8之間稀釋梯度進行平板涂布,37 ℃培養(yǎng)48 h,選擇菌落數(shù)在30～300 CFU/mL之間的培養(yǎng)皿進行計數(shù)。

凍干存活因子的測定:用上述平板計數(shù)法分別測定凍干前和凍干后的活菌數(shù),計算菌體的凍干存活因子[12]。凍干前活菌數(shù)為菌液中的活菌數(shù);凍干后活菌數(shù)為凍干菌粉懸浮于10%的蔗糖溶液中,于37 ℃復水30 min后,恢復活性后的活菌數(shù)。

凍干存活因子=[1-(lg凍干前活菌數(shù)-lg凍干后活菌數(shù))/lg凍干前活菌數(shù)]

凍干前活菌數(shù)(CFU)=凍干前菌濃(CFU/mL)×v

凍干后活菌數(shù)(CFU)=凍干后菌濃(CFU/g)×m

式中:v代表凍干前菌液體積,mL; m代表凍干后菌粉質(zhì)量,g。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2010(Microsoft office 2010)軟件處理試驗數(shù)據(jù),結(jié)果表示為平均值±標準差。采用SPSS statistic 20.0軟件對數(shù)據(jù)進行單因素方差分析(ANOVA)。

2 結(jié)果與分析

2.1 副干酪乳桿菌生長曲線的繪制

由圖1可知,副干酪乳桿菌生長過程中,0～4 h為延遲期,4～16 h為對數(shù)期,16～24 h為穩(wěn)定期。菌體進入穩(wěn)定期,結(jié)構(gòu)和生理都發(fā)生了很大變化,包括應激蛋白、膜組成和細胞壁結(jié)構(gòu)的表達水平的變化,使菌抗性增加[7],因此,選擇16 h為收獲期。

圖1 副干酪乳桿菌生長曲線

2.2 凍干保護劑的優(yōu)化

2.2.1 不同類型保護劑對副干酪乳桿菌的凍干保護 圖2為不同種類保護劑對副干酪乳桿菌凍干存活因子的影響，從圖2可以看出,所選擇的大分子物質(zhì)能夠顯著(p<0.05)提高菌體的存活因子,但不同的保護劑保護效果不同。其中脫脂奶粉的保護效果最好,顯著(p<0.05)高于酵母粉、可溶性淀粉和麥芽糊精的保護作用。這可能是因為脫脂奶粉不僅像其它大分子物質(zhì)一樣在菌體表面形成保護層,并且脫脂奶粉中的乳清蛋白在菌體外形成蛋白膜,對細胞加以保護,并可以固定凍干的酶類,防止由于細胞壁蛋白質(zhì)損傷而引起的胞內(nèi)物質(zhì)滲漏[6];同時,乳中其他成分(乳糖、鈣、磷等)也可以起到保護作用[12-13]。因此,本試驗選擇脫脂奶粉為大分子保護劑。

圖2 不同類型保護劑對副干酪乳桿菌凍干菌粉存活因子的影響

糖類保護劑也能顯著提高菌體的存活因子,其中蔗糖保護效果最優(yōu)。在凍干過程中,蔗糖可以形成高粘度、低流動性的玻璃態(tài)基質(zhì),將蛋白質(zhì)分子支撐起來,使之不易變性[14]。蔗糖分子的多個羥基,在凍干過程中可取代水分子與菌體表面的自由基聯(lián)結(jié)或與菌體蛋白質(zhì)形成氫鍵,從而對細菌的細胞膜和蛋白質(zhì)的完整性起到保護作用[15]。此外蔗糖可以促進菌體分散,還可以作為細胞今后生長用的碳源[16]。

聚合物類保護劑在凍結(jié)過程中優(yōu)先析出,可以提高溶液的粘度,抑制pH的降低。在聚合物類保護劑中PVP K-30保護效果最好。作為國家批準的新型安全食品添加劑,PVP K-30可以用作保護劑、分散劑、粘合劑和給藥劑等[17]。在真空冷凍干燥過程中,PVP K-30可以提高蛋白質(zhì)和氨基酸的穩(wěn)定性。同時,它也是一種非滲透性保護劑,可以與糖類間氫鍵作用,抑制糖類從玻璃態(tài)轉(zhuǎn)變成結(jié)晶態(tài),從而增加糖的物理穩(wěn)定性[18]。

抗氧化劑類保護劑在凍干過程中可以通過自身氧化而消耗環(huán)境中的氧,減少乳酸菌與氧的接觸,防止樣品氧化[19]。試驗中GSH的保護效果較好。有研究表明,GSH作為凍干保護劑在保護細胞的同時減少了飽和脂肪酸的鏈長,進而保持細胞流動性。同時GSH減少細胞膜脂肪酸被氧化,并促使細菌有效地適應凍干過程[20]。

綜上所述,本試驗的單一保護劑確定為脫脂奶粉、蔗糖、PVP K-30和GSH。

2.2.2 凍干保護劑濃度篩選 分別考察了脫脂奶粉、蔗糖、PVP K-30、GSH 4種保護劑不同濃度對菌體凍干后細胞存活因子的影響,結(jié)果如圖3所示。

圖3 不同濃度保護劑對乳酸菌凍干活力的影響

由圖3a可以看出,脫脂奶粉的添加提高了副干酪乳桿菌凍干菌粉的存活因子,其中濃度為15%時凍干效果最好,存活因子最高,繼續(xù)增大脫脂奶粉的濃度,保護效果逐漸減少。由圖3b可知,隨著蔗糖濃度的增加,菌體凍干存活因子也提高,但蔗糖濃度高于15%時,凍干菌的存活因子出現(xiàn)下降趨勢,因此蔗糖濃度為15%時存活因子最高,菌的活性最好。由圖3c可以看出,當PVP K-30濃度低于7%時,隨著PVP K-30濃度的增加,凍干菌體的存活因子也呈上升趨勢,當PVP K-30濃度為7%時,保護效果最好。由圖3d可以看出,當GSH濃度為0.4%～1.0%時,凍干菌的存活因子隨濃度的增加而上升,當GSH濃度為1.0%～1.6%時,凍干菌的存活因子隨濃度的增加而下降,因此GSH濃度為1%時存活因子最高。由此可以看出,副干酪乳桿菌凍干存活因子與各保護劑濃度之間并不是線性增長關(guān)系,其趨勢為先升高后下降。保護劑濃度較低時,隨著濃度的升高,細胞活力不斷提高,但到一定濃度后,隨著保護劑質(zhì)量濃度的增加,細胞活力反而下降。出現(xiàn)這一現(xiàn)象的原因可能是當保護劑濃度過高時,細胞內(nèi)蛋白質(zhì)聚合程度加劇,形成較強的玻璃化結(jié)構(gòu),對凍干菌粉的低溫儲藏不利,導致復水效果差[21]。因此,據(jù)圖中結(jié)果可知保護劑脫脂奶粉15%、蔗糖15%、PVP K-30 7%、GSH 1%為最佳濃度,以此作為正交試驗的依據(jù)。

2.2.3 凍干保護劑正交試驗 單獨使用某種保護劑的效果并不理想,為進一步提高菌體存活因子,需對凍干保護劑進行復配試驗。以上試驗已確定4種最佳保護劑及其濃度,采用正交試驗的優(yōu)化方式,進行保護劑配方的確定。

由表2可知，四種保護劑對副干酪乳桿菌的極差R的大小順序為RA>RD>RC>RB,由直觀分析可知,凍干存活因子最高的保護劑組合為A2B3C2D3,即脫脂奶粉15%,蔗糖20%,PVP-K30 7%,GSH 1.3%。為了驗證由正交試驗得到的最佳保護劑是否能得到最高的存活因子,按照直觀分析得到的保護劑組合(A2B3C2D3)進行了驗證試驗,副干酪乳桿菌的凍干存活因子為(0.977±0.002),高于正交試驗中得到的結(jié)果,因此認為正交試驗優(yōu)化結(jié)果有效[22]。

表2 副干酪乳桿菌凍干保護劑正交試驗結(jié)果

2.3 預冷溫度對副干酪乳桿菌凍干活力的影響

國內(nèi)外研究表明,影響乳酸菌凍干存活的因素有很多,如菌株間的差異,培養(yǎng)方式的不同,凍干前的預處理,保護劑的選擇等都會影響乳酸菌活力。在凍干之前,對乳酸菌進行脅迫處理,可以提高其對環(huán)境的抗性。各種脅迫包括溫度脅迫(熱脅迫和冷脅迫)、滲透壓脅迫、酸脅迫和饑餓脅迫等[23]。乳酸菌在生長過程中受到脅迫,會引起細胞的某種生理變化,這些變化可以促進乳酸菌提前產(chǎn)生抵御冷凍干燥的細胞機制,適應不良環(huán)境,從而提高干燥的活力。Shao等[24]通過冷脅迫提高了德氏乳桿菌亞種保加利亞乳桿菌ND02的凍干活性。Zhang等[25]發(fā)現(xiàn),在冷凍干燥之前,對酒類酒球菌進行冷脅迫、乙醇脅迫和酸脅迫后,菌體細胞膜不飽和脂肪酸/飽和脂肪酸的比例上升,環(huán)丙烯脂肪酸含量增加,增強細胞應激能力,提高了酒類酒球菌的冷凍干燥活性。

由圖4可以看出,經(jīng)過預冷處理后的細胞,真空冷凍干燥后存活因子都普遍升高。當冷脅迫溫度為4 ℃時,與未處理組相比,菌體存活因子升高幅度不大?？赡苁窃? ℃下,細胞的代謝遲緩,不會或很少產(chǎn)生應激反應。10 ℃冷激的菌體細胞存活因子較對照組提高0.003,效果比4 ℃稍好。15 ℃冷激效果最佳,菌體細胞凍干后存活因子達到0.984,但20 ℃時冷激產(chǎn)生效果有所下降,可能是預冷溫度升高,乳酸菌受到的刺激減小,從而產(chǎn)生抗冷凍干燥的物質(zhì)減少所造成的。所以選擇15 ℃ 2 h作為預冷處理。

圖4 不同預冷條件對副干酪乳桿菌凍干存活因子的影響

2.4 復合保護劑pH的選擇

保護劑的pH對乳酸菌的凍干存活有一定的影響,適宜的pH有利于菌體在凍干過程中保持較高活力[26]。如圖5所示,在pH為6.5時,菌體凍干后存活因子最高,pH過低時不利于菌體保持活力,當pH高于6.5時,菌體存活因子下降,可能是因為偏離乳酸菌生長的最適pH,不利于菌體冷凍干燥,所以最終選擇保護劑pH為6.5。

圖5 保護劑pH對副干酪乳桿菌凍干存活的影響

2.5 菌液和保護劑比例對菌體凍干存活的影響

菌液和凍干保護劑比例會影響乳酸菌的凍干活性。由圖6可知,當菌液和保護劑比例為1∶1.5 (v/v)時,菌體的凍干存活因子最大,隨著保護劑比例的增加,菌體存活因子下降,一方面可能是因為保護劑濃度過高,細胞的通透性下降,水分揮發(fā)受阻,導致較多冰晶生成,從而造成細胞死亡率增大;另一方面可能是因為保護劑過多,單位體積或質(zhì)量菌粉活菌數(shù)減少。因此,選擇菌液和保護劑比例為1∶1.5 (v/v)時為最佳配比。

圖6 菌液和保護劑比例對副干酪乳桿菌凍干存活的影響

2.6 凍干物料厚度對菌體凍干存活因子的影響

如圖7所示,從凍干厚度來看,隨著厚度的增加,菌體存活因子不斷上升,當厚度達到0.5 cm時,存活因子達到最大值,為(0.994±0.004),但繼續(xù)增加厚度,菌體的凍干活性下降。當物料厚度不足時,冷凍的菌體從低溫冰箱中取出放入真空冷凍干燥機過程中容易融化,再重新凍結(jié)時,造成菌體損傷,而物料厚度足夠厚時,相對不易融化,減少了二次凍結(jié)對菌體的損傷。而當物料厚度過厚時,細胞失去結(jié)合水難度增加,菌粉的水分含量增加,不利于儲存。因此,選擇0.5 cm為最佳凍干厚度。

圖7 物料凍干厚度對菌體存活因子的影響

2.7 預凍方式的確定

預凍溫度是制作凍干菌粉的關(guān)鍵參數(shù)之一,細胞外冰晶的形成可能會破壞細胞膜,從而降低乳酸菌細胞的活力[1]。并且,冷凍速率會影響冰晶的成核,快速冷凍可以產(chǎn)生較小的冰晶,對細胞的不利影響減小[27]。所以,預凍溫度的確定對乳酸菌凍干發(fā)酵劑的制備有重要意義。由圖8結(jié)果顯示,當用液氮預凍時,副干酪乳桿菌的存活因子達到(0.998±0.001),顯著(p<0.05)高于-20 ℃預凍效果,也高于-80 ℃預凍(0.995±0.002)效果。這可能是因為在-20 ℃條件下預凍,形成的冰晶大,在干燥階段,升華速度慢,從而導致菌體活力下降。此外,液氮預凍所需時間比-80 ℃短,因此選擇液氮下處理15 min為最佳預凍方式。

圖8 預凍方式對副干酪乳桿菌存活因子的影響

2.8 凍干菌粉微觀結(jié)構(gòu)的電鏡觀察

通過掃描電鏡圖9可知,未添加保護劑的菌粉部分細胞明顯破裂,變形嚴重,細胞之間相互堆積,胞間有絲狀物相互黏連,這可能是由于細胞變形或破裂后內(nèi)容物泄露所造成的。而添加保護劑的凍干菌粉中保護劑與菌體分布均勻,菌體清晰,形態(tài)飽滿,呈桿狀,菌體均被覆蓋在薄的涂層下,這在一定程度給細胞膜提供了保護效應,減少了與外界的接觸,避免了氧化損傷,從而維持細胞結(jié)構(gòu)的完整性。

圖9 掃描電鏡圖(×200000)

3 結(jié)論

本研究以副干酪乳桿菌為對象,對其凍干菌劑的制備進行探究。單一保護劑因其作用的局限性而不能滿足保護的要求,通過正交試驗,確定了副干酪乳桿菌凍干保護劑最佳配方為:脫脂奶粉15%,蔗糖20%,PVP K-30 7%,GSH 1.3%。單因素試驗確定了副干酪乳桿菌真空冷凍干燥的工藝參數(shù)為:在15 ℃下預冷2 h,保護劑pH為6.5,菌液和保護劑的比例(v/v)為1∶1.5,凍干厚度為0.5 cm,預凍方式采用液氮(-196 ℃)冷凍15 min。在此條件下,副干酪乳桿菌經(jīng)真空冷凍干燥后存活因子達(0.998±0.001),活菌數(shù)為(2.35±0.02)×1011CFU/g。通過掃描電鏡觀察發(fā)現(xiàn),未添加保護劑的菌粉細胞表面褶皺破裂,造成細胞內(nèi)容物泄露,而添加了復合保護劑的細胞經(jīng)過真空冷凍干燥后,細胞仍保持完整結(jié)構(gòu),菌體結(jié)合相對疏松,有利于凍干菌粉復水。