王 翠,李 萍,朱華平,2,*,李 超,楊強(qiáng)強(qiáng),隨寶斌

(1.天津科技大學(xué)食品工程與生物技術(shù)學(xué)院,省部共建食品營(yíng)養(yǎng)與安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,天津 300457;2.中國(guó)農(nóng)村技術(shù)開(kāi)發(fā)中心,北京 100045)

異硫氰酸芐酯(Benzyl isothiocyanate)是一種廣泛存在于十字花科蔬菜中的有機(jī)硫化合物,由異硫氰酸基團(tuán)(-N=C=S)、亞甲基和苯環(huán)構(gòu)成,屬于典型的異硫氰酸酯類(Isothiocyanates,ITCs)[1]。ITCs是植物中次級(jí)代謝產(chǎn)物硫代葡萄糖苷(Glucosinolate,GS)的酶解產(chǎn)物,十字花科植物在被外力破壞時(shí)會(huì)激活其細(xì)胞內(nèi)硫代葡萄糖苷酶(芥子酶)的活性,從而使GS水解為ITCs[2]。異硫氰酸芐酯對(duì)許多腫瘤系細(xì)胞都具有較強(qiáng)的抑制作用,如肝癌[3]、皮膚癌[4]、前列腺癌[5]、乳腺癌[6]等。除此之外,異硫氰酸芐酯具有廣譜抑菌性,如對(duì)產(chǎn)氣莢膜梭菌[7]、副溶血性弧菌[8]、空腸彎曲桿菌[9]、大腸桿菌[10]等均有不同程度的抑制活性。

異硫氰酸芐酯常見(jiàn)的結(jié)構(gòu)類似物有異氰酸芐酯、異硫氰酸苯酯、異硫氰酸苯乙酯、異硫氰酸乙酯等(結(jié)構(gòu)見(jiàn)圖1),其中異氰酸芐酯是合成生物素中常用的關(guān)環(huán)試劑[11],對(duì)于優(yōu)化工藝有重要的意義;異硫氰酸苯酯和異硫氰酸苯乙酯的結(jié)構(gòu)與異硫氰酸芐酯相似,主要差異在于亞甲基的個(gè)數(shù)不同,具有一定的抑菌性能[8,12];異硫氰酸乙酯也是一種典型的異硫氰酸酯類,但與異硫氰酸芐酯相比缺少苯環(huán),可用于果蔬灰霉病和擴(kuò)張性青霉感染的防治,在農(nóng)業(yè)及制藥行業(yè)中承擔(dān)著重要的角色[13]。

圖1 異硫氰酸芐酯及其類似物的結(jié)構(gòu)

國(guó)內(nèi)外對(duì)異硫氰酸芐酯的抗癌、抑菌的研究主要集中在其作用機(jī)理及其作用范圍方面,對(duì)其抑菌活性的相關(guān)基團(tuán)的研究鮮有報(bào)道。因此,本研究選取了異硫氰酸芐酯及其常見(jiàn)的4種結(jié)構(gòu)類似物質(zhì)(異氰酸芐酯、異硫氰酸苯酯、異硫氰酸苯乙酯、異硫氰酸乙酯),通過(guò)初步研究其對(duì)革蘭氏陰性菌(大腸桿菌)以及革蘭氏陽(yáng)性菌(金黃色葡萄球菌)抑菌活性,闡明異硫氰酸芐酯的抑菌活性基團(tuán)及抑菌機(jī)理,為異硫氰酸芐酯的臨床應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

異氰酸芐酯(98%)、異硫氰酸苯酯(98%)、異硫氰酸苯乙酯(99%)、異硫氰酸乙酯(95%)、異硫氰酸芐酯(98%)、羅丹明123、二甲基亞砜(DMSO) 美國(guó)Sigma公司;大腸桿菌ATCC 10305(E.coliATCC 10305)、金黃色葡萄球菌ATCC 25923(S.aureusATCC 25923) 天津科技大學(xué)菌種庫(kù);胰蛋白胨、酵母浸取物、瓊脂、葡萄糖 英國(guó)OXOID公司;己糖激酶(HK)測(cè)試盒、丙酮酸激酶(PK)測(cè)試盒、果糖磷酸激酶(PFK)測(cè)試盒、超微量總ATP酶測(cè)試盒 南京建成生物工程研究所;LB液體培養(yǎng)基:胰蛋白胨2.0 g,酵母膏1.0 g,氯化鈉2.0 g,去離子水200 mL,121 ℃下高壓滅菌15 min,備用;LB固體培養(yǎng)基:胰蛋白胨2.0 g,酵母膏1.0 g,氯化鈉2.0 g,瓊脂3.0 g,去離子水200 mL,121 ℃下滅菌15 min,傾注于無(wú)菌培養(yǎng)皿中冷卻,備用;羅丹明123試劑:配制濃度為5 μg/mL,溶劑為DMSO,備用。

酶標(biāo)儀、熒光分光光度計(jì)、搖床、恒溫培養(yǎng)箱 美國(guó)Thermo公司;電導(dǎo)率儀 上海雷磁創(chuàng)益儀表有限公司;紫外分光光度計(jì) 德國(guó)Eppendorf公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 抑菌定性實(shí)驗(yàn) 采用打孔法[14]對(duì)異硫氰酸芐酯、異氰酸芐酯、異硫氰酸苯酯、異硫氰酸苯乙酯及異硫氰酸乙酯進(jìn)行抑菌定性實(shí)驗(yàn)。取1 mL濃度為106cfu/mL的菌液均勻涂布于LB固體培養(yǎng)基上,置于無(wú)菌操作臺(tái)中吹干,打孔器打孔(直徑為6 mm),加入等體積同濃度(均用DMSO配制成20 μg/mL)的5種試劑,DMSO作為陰性對(duì)照。最后將培養(yǎng)皿密封后置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h,測(cè)量抑菌圈直徑。抑菌圈直徑≥7 mm,則認(rèn)為該物質(zhì)具有抑菌性能[15]。

1.2.2 最低抑菌濃度(MIC)及最低殺菌濃度(MBC)的測(cè)定 采用2倍稀釋法[16]對(duì)具有抑菌活性的物質(zhì)測(cè)定MIC和MBC。使用96孔板進(jìn)行實(shí)驗(yàn),96孔板從左至右分別標(biāo)記為A1～A12,所用菌液濃度為106cfu/mL。

在A1列中加入160 μL菌液、40 μL抑菌物質(zhì)(使A1終濃度為8000 μg/L),在A2～A10列內(nèi)加入100 μL菌液,在A11列中加入100 μL LB培養(yǎng)液作為陰性對(duì)照,在A12列中加入100 μL菌液作為陽(yáng)性對(duì)照。從A1中吸取混合液100 μL至A2,再?gòu)腁2吸取100 μL至A3,依次吸取直至A10,完成2倍稀釋(A1～A10中抑菌物質(zhì)濃度分別為8000、4000、2000、1000、250、125、62.5、31.25、15.625、7.8125 μg/L)。將96孔板置于37 ℃搖床中培養(yǎng)5～6 h后,用酶標(biāo)儀測(cè)定吸光度,確定MIC。在此基礎(chǔ)上,從每孔中取10 μL混合液涂布到LB培養(yǎng)基上,37 ℃培養(yǎng)24 h后,觀察菌落生長(zhǎng)情況。未見(jiàn)菌落生長(zhǎng)時(shí)的抑菌劑最低添加濃度即為MBC。

通過(guò)下式計(jì)算抑菌率:

注:其中陰性對(duì)照為L(zhǎng)B的吸光度值,陽(yáng)性對(duì)照為未添加抑菌物質(zhì)的正常菌液,本實(shí)驗(yàn)中將抑菌率達(dá)到60%以上的濃度定義為MIC。

1.2.3 抑菌生長(zhǎng)曲線的測(cè)定 采用比濁法測(cè)定微生物的抑菌生長(zhǎng)曲線。取單菌落至LB液體培養(yǎng)基中,搖床(37 ℃,200 r/min)搖菌,以獲取106cfu/mL菌液,在菌液中添加抑菌物質(zhì)(使抑菌物質(zhì)終濃度均為抑菌作用最強(qiáng)的抑菌物質(zhì)的MIC值),搖床(37 ℃,200 r/min)培養(yǎng)12 h,每隔1 h取菌液,于波長(zhǎng)600 nm處測(cè)定OD值。以時(shí)間為橫坐標(biāo),以O(shè)D600值為縱坐標(biāo),繪制抑菌生長(zhǎng)曲線。

1.2.4 抑菌機(jī)理研究

1.2.4.1 菌體膜電位的測(cè)定 使用羅丹明123染色試劑來(lái)檢測(cè)細(xì)菌膜電位的變化[17],以此反映菌體的代謝活力。在106cfu/mL的菌液中加入一定量羅丹明123儲(chǔ)備液,使終濃度為10 μg/mL,搖床培養(yǎng)10 min,以PBS洗菌,重懸于LB培養(yǎng)液中,分管后分別加入不同的抑菌物質(zhì)(終濃度為各抑菌物質(zhì)的MIC值),37 ℃搖床搖菌 60 min后檢測(cè)其熒光強(qiáng)度,未加入任何抑菌物質(zhì)的樣品為空白對(duì)照。

1.2.4.2 能量代謝相關(guān)酶活的測(cè)定 利用高壓破壁(大腸桿菌)及反復(fù)凍融(金黃色葡萄球菌)的方法對(duì)過(guò)夜菌液進(jìn)行破壁處理,獲得粗酶液后用不同抑菌劑處理30 min,按試劑盒相關(guān)操作步驟,對(duì)處理前后粗酶液中的ATP酶、HK酶、PK酶及PFK酶的酶活進(jìn)行檢測(cè)。

1.3 數(shù)據(jù)處理

每個(gè)實(shí)驗(yàn)均進(jìn)行3次以上重復(fù),數(shù)據(jù)由Origin 8.0軟件進(jìn)行分析,并以平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示,組間比較采用單因素方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 抑菌活性基團(tuán)探究

2.1.1 抑菌定性實(shí)驗(yàn) 由表1、圖2可看出,5種物質(zhì)對(duì)E.coli及S.aureus均具有不同程度的抑菌活性,且S.aureus對(duì)抑菌物質(zhì)更敏感。異硫氰酸芐酯及異氰酸芐酯在固體培養(yǎng)基上產(chǎn)生的抑菌圈較大,其次為異硫氰酸苯酯,但由于本實(shí)驗(yàn)中所用的5種物質(zhì)均為脂溶性物質(zhì),可能會(huì)造成在固體培養(yǎng)基上的擴(kuò)散性不一致,進(jìn)而會(huì)導(dǎo)致其抑菌圈大小與實(shí)際抑菌效果強(qiáng)弱的偏差,因此需要在液體培養(yǎng)基中進(jìn)一步抑菌實(shí)驗(yàn)。

表1 不同物質(zhì)的抑菌圈直徑(mm)

圖2 大腸桿菌(左圖)和金黃色葡萄球菌(右圖)的抑菌定性實(shí)驗(yàn)

2.1.2 最低抑菌濃度及最小殺菌濃度的測(cè)定 表2與表3分別是5種物質(zhì)對(duì)兩種致病菌的MIC及MBC。根據(jù)數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析可知,5種抑菌物質(zhì)對(duì)E.coli和S.aureus均存在較強(qiáng)的抑菌性,但在作用效果上也存在一定的差異。其中,異硫氰酸芐酯、異硫氰酸苯酯以及異硫氰酸乙酯抑菌效果突出,表2中異硫氰酸苯酯對(duì)E.coli的MIC為500 μg/L、MBC為2000 μg/L,表3可以看出，異硫氰酸乙酯MIC則為500 μg/L、MBC為1000 μg/L,異硫氰酸芐酯為1000 μg/L、MBC為2000 μg/L;異硫氰酸芐酯以及異硫氰酸苯酯對(duì)S.aureus的MIC為500 μg/L、MBC為2000 μg/L,異硫氰酸乙酯MIC則為250 μg/L、MBC為1000 μg/L。整體上,MBC與MIC濃度變化呈現(xiàn)一致性,并且S.aureus對(duì)抑菌物質(zhì)呈現(xiàn)高的敏感性,這與抑菌圈定性實(shí)驗(yàn)的結(jié)果相一致。

表2 不同抑菌物質(zhì)對(duì)大腸桿菌的MIC及MBC

表3 不同抑菌物質(zhì)對(duì)金黃色葡萄球菌的最低抑菌濃度(MIC)

2.1.3 抑菌生長(zhǎng)曲線的測(cè)定 選取抑菌性能最強(qiáng)的抑菌物質(zhì)(異硫氰酸乙酯)的MIC作為抑菌生長(zhǎng)曲線測(cè)定中抑菌劑的添加濃度。E.coli的抑菌劑添加濃度為500 μg/L,由圖3可以發(fā)現(xiàn),添加異硫氰酸苯乙酯、異氰酸芐酯以及異硫氰酸芐酯的菌液分別在1、2和3 h出現(xiàn)生長(zhǎng)現(xiàn)象,并且在后期生長(zhǎng)狀態(tài)與原菌液相似,而添加異硫氰酸乙酯與異硫氰酸苯酯的樣品直至實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí),細(xì)菌的OD值基本未發(fā)生改變;S.aureus抑菌劑添加濃度為250 μg/L。結(jié)果表明,添加異硫氰酸苯乙酯的菌液與原菌液基本無(wú)差異,添加異氰酸芐酯、異硫氰酸芐酯及異硫氰酸苯酯的菌液分別在2、3以及6 h出現(xiàn)生長(zhǎng)現(xiàn)象,添加異硫氰酸乙酯的菌液OD值未發(fā)生明顯改變。

圖3 大腸桿菌(左)和金黃色葡萄球菌(右)的抑菌生長(zhǎng)曲線

2.1.4 抑菌活性基團(tuán)的探討 通過(guò)對(duì)抑菌圈大小、MIC、MBC和抑菌生長(zhǎng)曲線的測(cè)定,可知異硫氰酸芐酯及4種結(jié)構(gòu)類似物質(zhì)均具有抑菌性,尤其對(duì)S.aureus的抑制作用更強(qiáng)。抑制作用強(qiáng)弱順序依次為異硫氰酸乙酯>異硫氰酸苯酯>異硫氰酸芐酯>異氰酸芐酯>異硫氰酸苯乙酯。

表4 5種物質(zhì)的結(jié)構(gòu)差異及抑菌活性比較

結(jié)合物質(zhì)結(jié)構(gòu)分析可知,對(duì)于R-(CH2)n-NCS結(jié)構(gòu)的異硫氰酸酯類,隨著n值的增加,物質(zhì)的抑菌活性逐漸減弱,這與王巖等[18]的研究結(jié)果相一致;對(duì)于缺失苯環(huán)的異硫氰酸酯類(如異硫氰酸乙酯)而言,抑菌活性仍然很強(qiáng),甚至高于異硫氰酸芐酯;對(duì)于異硫氰酸基團(tuán)殘缺但具有苯環(huán)的物質(zhì)(如異氰酸芐酯)抑菌活性明顯降低。因此,可以初步推斷異硫氰酸芐酯的抑菌活性并不是某個(gè)基團(tuán)獨(dú)立的作用,而是其苯環(huán)、異硫氰酸基團(tuán)及亞甲基三者協(xié)同作用的結(jié)果,并且三者中異硫氰酸基團(tuán)對(duì)其抑菌活性的決定性作用最大、亞甲基次之、苯環(huán)最弱,且苯環(huán)的存在可能對(duì)其抑菌作用存在抑制作用。

2.2 抑菌機(jī)理初步研究

2.2.1 菌體膜電位的測(cè)定 研究表明,異硫氰酸芐酯在發(fā)揮抗癌作用時(shí)功能相關(guān)部位造成影響[19],膜電位能反應(yīng)細(xì)胞代謝活性,因此本實(shí)驗(yàn)中選用了羅丹明123作為熒光指示劑,測(cè)定菌體膜電位,結(jié)果見(jiàn)圖4。

圖4 5種物質(zhì)對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌細(xì)胞膜電位的影響

圖4表明,抑菌物質(zhì)處理后的樣品,其熒光強(qiáng)度均發(fā)生了不同程度的極顯著(p<00.1)上升,即不同抑菌劑均造成了菌體膜電位的改變,對(duì)細(xì)菌代謝活性產(chǎn)生了影響,從而抑制了其生長(zhǎng)。此外,由圖4可以看出,異氰酸芐酯(具有-N=C=O)作用于菌體后其熒光強(qiáng)度上升最為明顯,這可能是由于氧原子比硫原子更加活潑,因此導(dǎo)致異氰酸芐酯對(duì)菌體代謝活性的影響更加顯著;其余4種異硫氰酸酯類抑菌物質(zhì)中,異硫氰酸乙酯(無(wú)苯環(huán))對(duì)膜電位的影響較大,同時(shí)具有苯環(huán)及異硫氰酸基團(tuán)的3種物質(zhì)對(duì)膜電位的影響較小,這說(shuō)明苯環(huán)的存在可能抑制了抑菌物質(zhì)對(duì)膜電位的影響。

2.2.2 能量代謝相關(guān)酶活的測(cè)定 ATP酶是一種跨膜的氧化磷酸化途徑關(guān)鍵酶,HK酶、PK酶以及PFK酶是糖酵解途徑的3種關(guān)鍵酶,這4種酶與菌體的能量代謝息息相關(guān)。因此,通過(guò)對(duì)這4種典型酶類酶活的測(cè)定,進(jìn)一步檢測(cè)5種抑菌物質(zhì)對(duì)細(xì)菌能量代謝的影響。結(jié)果如圖5所示,5種抑菌物質(zhì)對(duì)ATP酶的活性均產(chǎn)生不同程度的抑制作用,其中異氰酸芐酯(-N=C=O)對(duì)ATP酶活的影響最為顯著,可使S.aureus中的ATP酶基本失活;異硫氰酸乙酯(無(wú)苯環(huán))對(duì)ATP酶的作用次之,但比同時(shí)具有苯環(huán)及異硫氰酸基團(tuán)的異硫氰酸酯類抑菌物質(zhì)作用效果強(qiáng),這與膜電位結(jié)果相一致。對(duì)于HK酶、PK酶及PFK酶而言,異氰酸芐酯與異硫氰酸乙酯的作用規(guī)律呈現(xiàn)一致性,其中異氰酸芐酯作用效果最強(qiáng),異硫氰酸乙酯次之;在S.aureus中,對(duì)于HK酶而言,這種作用效果更強(qiáng)。其余3種同時(shí)具有苯環(huán)及異硫氰酸基團(tuán)的異硫氰酸酯類物質(zhì)對(duì)這3種酶的酶活均不造成顯著性影響,這可能與苯環(huán)的存在有關(guān)。

圖5 5種物質(zhì)對(duì)能量代謝相關(guān)酶活的影響

3 結(jié)論

異硫氰酸芐酯的抑菌活性并不是某一個(gè)基團(tuán)單獨(dú)作用的結(jié)果,而是異硫氰酸基團(tuán)、苯環(huán)以及連接它們的亞甲基協(xié)同作用的結(jié)果,三者中異硫氰酸基團(tuán)對(duì)其抑菌活性的決定性作用最大、亞甲基次之、苯環(huán)最弱,甚至對(duì)其抑菌活性有一定的抑制作用。結(jié)果也表明,5種抑菌物質(zhì)對(duì)細(xì)菌的能量代謝均具有影響,且結(jié)構(gòu)不同的抑菌物質(zhì)對(duì)細(xì)菌的代謝活性以及相關(guān)酶活性的影響不同。其中硫原子被氧原子取代的異氰酸芐酯對(duì)菌體膜電位和能量代謝相關(guān)酶的影響最大,缺失苯環(huán)的異硫氰酸乙酯次之,而具有苯環(huán)的3種異硫氰酸酯類物質(zhì)作用效果更弱,即苯環(huán)在其對(duì)菌體代謝的影響上存在抑制作用。另外,對(duì)能量代謝影響最為明顯的異氰酸芐酯,其抑菌活性并不是最強(qiáng)的,這說(shuō)明這些基團(tuán)對(duì)菌體很可能還存在其他抑制機(jī)理。

異硫氰酸芐酯具有良好的生物活性,在抑菌、抗癌方面具有廣闊的應(yīng)用前景,本研究中關(guān)于其抑菌活性基團(tuán)以及類似物的研究也將為其進(jìn)一步應(yīng)用提供理論依據(jù)。