居 鑫,陳 沁,陳景斌,陳華濤,薛晨晨,袁星星,李 娜,蘇娜娜,崔 瑾,*,陳 新,*

(1.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,江蘇南京 210095;2.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院經(jīng)濟作物研究所,江蘇南京 210014;3.江蘇省高效園藝作物遺傳改良實驗室，江蘇南京 210014)

小豆(VignaangularisL.),又稱紅小豆、飯豆,俗稱紅豆,為豆科植物,原產(chǎn)地為中國[1],小豆的營養(yǎng)價值很高,在7種豆類中,它的類黃酮和單體種類及含量都是最高的,約0.501 mg/g[2]。小豆芽是一種口感鮮嫩、營養(yǎng)豐富的芽菜,等到芽苗長到3～15 cm左右高時采割食用[3]。小豆芽苗菜也富含類黃酮等物質(zhì),類黃酮是植物中具有營養(yǎng)功能的次生代謝產(chǎn)物,具有抗癌和抗腫瘤等藥理作用[4],槲皮素和蘆丁是最典型的類黃酮單體[5]。類黃酮又稱黃酮類物質(zhì)。研究如何提高小豆芽苗菜中黃酮類化合物含量具有重要意義。

近年來,光質(zhì)和光周期對植物次生代謝的影響及其機理研究引起國內(nèi)外學(xué)者的廣泛關(guān)注。不同光質(zhì)通過特定光受體傳導(dǎo)影響植物適應(yīng)環(huán)境能力和發(fā)育進程,調(diào)控植物光形態(tài)建成,光質(zhì)在光環(huán)境調(diào)控植物生長發(fā)育過程中扮演著至關(guān)重要的角色[6]。有研究表明,適當(dāng)?shù)腢V-B處理可以誘導(dǎo)酚類物質(zhì)及黃酮類物質(zhì)的生物合成和積累,例如UV-B光處理可提高苦蕎麥芽花青苷和蘆丁的含量[7];UV-B處理可以提高大豆異黃酮、花青苷和蘆丁等[8-9]含量;UV-B處理顯著提高了總酚物質(zhì)尤其是丁香酸、對-香豆酸和阿魏酸三種單體含量[10]。目前關(guān)于UV-B 誘導(dǎo)小豆芽苗菜黃酮類物質(zhì)積累及其合成機理尚不明確。

本試驗以小豆(VignaangularisL.)為試驗材料,根據(jù)文獻選用適宜光質(zhì),探索出最適宜的光質(zhì)和光周期,為工廠化生產(chǎn)光環(huán)境調(diào)控設(shè)施提供重要的科學(xué)依據(jù),并且較為系統(tǒng)地研究了不同光質(zhì)對小豆芽苗菜生長發(fā)育和營養(yǎng)品質(zhì)等的影響,初步探索了UV-B對小豆芽苗菜光形態(tài)建成和黃酮類物質(zhì)合成機理。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

供試小豆(珍珠粒小豆) 北京農(nóng)林科學(xué)院;乙腈和甲醇 色譜純,天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司;蘆丁、槲皮素和山奈酚 純度≥ 98%,源葉生物公司;其余試劑 均為分析純。

Agilent 1100型高效液相色譜儀(G1311A四元泵,G1379A真空再線脫氣機,G1315 DAD檢測器,G1316A柱溫箱) 美國Agilent公司;GXZ型智能光照培養(yǎng)箱 寧波江南儀器廠;GLZ-A型光量子計 浙江托普儀器有限公司;T8 LED燈管 荷蘭飛利浦公司;T5 UV-A燈管 日本東芝公司;G15T8E UV-B燈管 日本SANKYO公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 芽苗菜的培養(yǎng) 用人工清洗的方法,剔除蟲蛀、殘破、畸形、霉變的種子及雜質(zhì),用水浸泡8～10 h,去除漂浮的種子和種皮上的粘液,瀝去多余水分。然后取出種子瀝干水分,均勻灑在底部鋪有4層潮濕紗布的白瓷盤中,并在種子上覆蓋2層潮濕紗布,催芽12～18 h。待種子發(fā)芽近0.5～1 cm時,將種子播種到鋪有蛭石的育苗盤中,培養(yǎng)60 h后置于不同光質(zhì)條件下培養(yǎng),測定各項指標。

1.2.2 不同光質(zhì)處理 LED冷光源培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)小豆芽苗菜,設(shè)置黑暗(Dark,D)和各光質(zhì)處理(圖1),相對濕度為80%左右,溫度為(25±2) ℃,光周期為12 h·d-1。箱內(nèi)頂置LED光源,包括白光(White Light,W)、藍光(Blue Light,B),紫外光A(Ultraviolet A,UV-A,波長320～400 nm)和紫外光B(Ultraviolet B,UV-B,280～320 nm)(由于目前國內(nèi)市場中LED產(chǎn)品中UV-B價格昂貴且不易購買,故用UV-B紫外窄譜燈管替代)。調(diào)節(jié)電流、占空比以及光源與植株的距離,使用光量子計測量光量,使光量均為30 mol·m-2·s-1左右。紫外光(UV-A、UV-B)輻射度為5 W/m2。以W為對照,待小豆芽苗菜培養(yǎng)48 h后采收備用。

圖1 光源小區(qū)示意圖

1.2.3 UV-B處理時長研究 在LED冷光源培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)小豆芽苗菜,設(shè)置不同UV-B時長處理,相對濕度為80%左右,溫度為(25±2) ℃,光周期為12 h·d-1(即12 h光照后12 h黑暗)。以 W為對照,將UV-B光照時長設(shè)置為2、4、6、8、12 h,補充W光照時長對應(yīng)為10、8、6、4、0 h(光照總時長為12 h),依次表示為“UV-B 2 h”、“UV-B 4 h”、“UV-B 6 h”、“UV-B 8 h”、“UV-B 12 h”。測定生長指標和類黃酮含量。

1.2.4 UV-B光照時間進程處理 UV-B光照時間進程處理在LED冷光源培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng),相對濕度為80%左右,溫度為(25±2) ℃,光周期為12 h·d-1。

每隔12 h取一次樣,測定12～120 h類黃酮含量;測定12～60 h類黃酮合成關(guān)鍵酶活性。

1.2.5 生長指標測定 隨機取樣,不同處理分別取15株,用直尺測量株高和根長;另外,不同處理分別取15株,用萬分之一天平測定不含根的可食鮮質(zhì)量和全株鮮質(zhì)量,然后105 ℃殺青15 min,85 ℃烘至恒質(zhì)量,測定可食干質(zhì)量和全株干質(zhì)量,3次重復(fù)。

可食率(%)=可食鮮質(zhì)量×100/全株鮮質(zhì)量

含水率(%)=(全株鮮質(zhì)量-全株干質(zhì)量)×100/全株鮮質(zhì)量

1.2.6 生理生化指標測定

1.2.6.1 總酚類物質(zhì)和類黃酮含量測定 隨機取樣,稱取1 g小豆芽苗菜莖部,總酚類物質(zhì)含量采用Folin-Ciocalteu比色法測定[11],繪制總酚類物質(zhì)含量標準曲線為A=0.0004C+0.0008,相關(guān)系數(shù)r=0.9994;類黃酮含量采用氯化鋁-亞硝酸鈉比色法[12],繪制類黃酮含量標準曲線為A=0.0007C+0.1985,r=0.9977。

1.2.6.2 類黃酮單體測定 類黃酮單體蘆丁(rutin)、槲皮素(quercetin)、山奈酚(kaempferol)含量采用高效液相色譜(HPLC)進行定性定量分析。提取方法及色譜條件參考文獻[13],標樣為蘆丁、槲皮素、山奈酚。色譜條件:色譜柱:Agilent ZORBAX SB-C18(4.6 mm×250 mm,5 μm);流動相乙腈(A)-0.1%磷酸水溶液(B)進行梯度洗脫(0～7 min,A相20%→32%;7～10 min時,A相32%;10～25 min,A相32%→55%;體積質(zhì)量1.0 mL/min;柱溫為室溫;檢測波長365 nm;進樣量20 μL。所有指標設(shè)置3次重復(fù)。

1.2.6.3 類黃酮合成關(guān)鍵酶活測定 查爾酮合成酶(chalcone synthase,CHS)、黃酮醇合酶(flavonol synthase,FLS)粗酶液提取:隨機取樣,稱取1 g小豆芽苗菜莖部,加入一定量的PBS,pH7.4。用液氮迅速冷凍保存?zhèn)溆?。樣品融化后仍然保?～8 ℃的溫度。加入一定量的PBS(pH7.4),或組織蛋白萃取試劑,用手工或勻漿器將標本勻漿化。離心20 min左右(2000～3000 r/min)。仔細收集上清。分裝后,一份待檢測,其余保存在-70 ℃冷凍備用。樣品設(shè)置3次重復(fù)。

查爾酮合成酶(CHS)活性測定參照Li等[14]的方法;黃酮醇合酶(FLS)活性測定參照Li等[15]的方法。

1.2.7 類黃酮合成關(guān)鍵酶基因相對表達量測定 關(guān)鍵酶基因相對表達量測定:苯丙氨酸解氨酶基因(phenylalanine ammonia-lyase class,PALclass2)、查爾酮合成酶基因(chalcone synthase 17-like,CHS17like)、查耳酮異構(gòu)酶基因(chalcone--flavonone isomerase-like,CHIlike)、黃酮醇合酶基因(flavonol synthase/flavanone 3-hydroxylase,FLS)、黃酮糖基轉(zhuǎn)移酶基因(flavonoid 3-O-glucosyltransferase-like,UGT78D1like)相對表達量測定:總RNA采用Trizol法[16]提取,瓊脂糖凝膠電泳驗證后使用Thermo公司反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA,-20 ℃保存。采用DBI?Bioscience試劑盒,使用三步法進行PCR反應(yīng)。PCR引物設(shè)計均依據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫Primer designing tool設(shè)計(表1)。以小豆Actin作為內(nèi)參基因?qū)υ囼灲Y(jié)果進行標準化,目標基因相對表達量采用比較閾值法即2-ΔΔCT法。

表1 RT-qPCR引物表

1.3 數(shù)據(jù)處理

每個樣品設(shè)置3次重復(fù),采用Excel 2007軟件進行數(shù)據(jù)整理,采用SPSS 20.0軟件進行方差分析,采用Duncan’s新復(fù)極差法進行顯著性檢驗,p<0.05。采用Origin 8軟件進行柱形圖和曲線圖繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同光質(zhì)對小豆芽苗菜生長的影響

由圖2可以直觀的看出,黑暗處理的小豆芽苗菜為黃化型芽苗菜,而光質(zhì)處理的小豆芽苗菜為綠化型芽苗菜,光照處理降低了植物的株高。不同處理間的根長沒有明顯的變化。

圖2 光質(zhì)對小豆芽苗菜生長的影響

由表2可知,與W相比,B、UV-A和UV-B均顯著降低(p<0.05)小豆芽苗菜株高,而且UV-B降低程度最大。不同光質(zhì)之間小豆芽苗菜的根長和莖粗都無顯著差異(p>0.05),即光質(zhì)對小豆芽苗菜的根長和莖粗沒有顯著影響。另外,光照降低小豆芽苗菜可食鮮重,與W相比,B和UV-A均可小幅降低其可食鮮重,但不顯著(p>0.05),UV-B可顯著降低其可食鮮重(p<0.05)，B和UV-B增加小豆芽苗菜可食干重,UV-A降低其可食干重,但不同光質(zhì)處理之間均沒有顯著差異(p>0.05)。與W比,UV-A提高含水率,但差異不顯著(p>0.05),而UV-B顯著降低含水率(p<0.05)?？傊甎V-B顯著降低了小豆芽苗菜株高、可食鮮重和含水率,其可食干重并未發(fā)生變化。

表2 光質(zhì)對小豆芽苗菜生長的影響

2.2 不同光質(zhì)對小豆芽苗菜總酚和類黃酮及其單體含量的影響

由圖3A可知,與D對比,所有光質(zhì)處理都顯著(p<0.05)提高了小豆芽苗菜總酚的含量。與對照W相比,UV-B顯著(p<0.05)提高小豆芽苗菜總酚含量。由圖3B可知,與D相比,四種光質(zhì)處理均顯著提高小豆芽苗菜類黃酮含量。與W相比,不同單色光質(zhì)處理均顯著提高小豆芽苗菜類黃酮含量,其中UV-B提高程度最大,其次為B,最后為UV-A。這與張曉燕等[8]使用UV-B提高大豆芽苗菜下胚軸中大豆異黃酮含量、齊學(xué)會等[10]使用UV-B顯著提高下胚軸中總酚類物質(zhì)含量的結(jié)果類似。

圖3 光質(zhì)對小豆芽苗菜總酚和類黃酮物質(zhì)含量的影響

對不同光質(zhì)下不同類黃酮單體含量進行分析(表3),發(fā)現(xiàn)UV-B下蘆丁和山奈酚的含量最高,和D以及其他光質(zhì)相比有顯著性差異(p<0.05),其他光質(zhì)之間的蘆丁含量沒有顯著性差異;與D相比,W山奈酚含量顯著提高(p<0.05),與B、UV-A相比差異不顯著(p>0.05)。槲皮素的含量在D處理下最高,其次依次是W、UV-A、B,最后是UV-B。說明UV-B顯著提高了蘆丁和山柰酚,降低了槲皮素的含量。

表3 光處理下小豆芽苗菜中類黃酮單體含量

2.3 UV-B光照時長對小豆芽苗菜生長和類黃酮含量的影響

由圖4可以發(fā)現(xiàn),與W相比,隨著UV-B光照時間的增加,小豆芽苗菜的生長逐漸受到抑制,在12 h時抑制最為嚴重。

由表4可以發(fā)現(xiàn),隨著UV-B時間增加,株高逐漸降低(12 h除外，但均低于W),并且都與對照(W)有顯著差異(p<0.05);不同UV-B處理時間下的莖粗并沒有顯著差異;與W相比,2 h UV-B處理的可食鮮重沒有顯著下降,4 h及以上UV-B處理顯著下降;2和4 h處理小豆芽苗菜可食干重增加,6、8和12 h處理則下降,但差異不顯著(p>0.05);不同UV-B處理時長都降低了其含水率,4 h及以上顯著降低。說明UV-B通過降低含水率減少小豆芽苗菜可食鮮重,因此2 h和4 h的UV-B處理是比較利于小豆芽苗菜生長的條件。

表4 UV-B處理時長對小豆芽苗菜生長的影響

由圖5可知,與W相比,UV-B不同時間光照均顯著提高了類黃酮含量(p<0.05),其中12 h處理最高,其次是4 h。說明在一定范圍內(nèi),UV-B光照時間越久,類黃酮含量呈上升趨勢。這與齊學(xué)會等[9]在UV-B光下8 h·d-1和12 h·d-1顯著提高大豆芽苗菜下胚軸中總含量結(jié)果類似。本實驗中4和12 h UV-B處理最好,這可能是由于品種差異。結(jié)合UV-B光照時長對小豆芽苗菜生長的影響結(jié)果,可以發(fā)現(xiàn)4 h的UV-B處理是比較適合小豆芽苗菜營養(yǎng)和生長的條件。

圖5 不同UV-B時長對小豆芽苗菜類黃酮含量的影響

2.4 光照時間進程對小豆芽苗菜類黃酮含量的影響

每12 h取一次樣,可以發(fā)現(xiàn)12～24 h,W處理的小豆類黃酮含量高于UV-B處理的類黃酮含量,并且都稍有下降。在36 h之后,UV-B處理的小豆類黃酮含量顯著高于W處理的類黃酮含量(p<0.05),并且一直延續(xù)到120 h。另外,36 h之后,W處理的小豆類黃酮含量變化不大,UV-B處理的小豆類黃酮含量基本處于上升趨勢(圖6)。說明UV-B對小豆芽苗菜類黃酮物質(zhì)含量的影響是持續(xù)且穩(wěn)定的。

圖6 UV-B光照時間進程對小豆芽苗菜類黃酮物質(zhì)含量的影響

2.5 光照時間進程對小豆芽苗菜類黃酮關(guān)鍵酶活性的影響

由圖7可知,UV-B光下,CHS和FLS的酶活在60 h之內(nèi)均高于W處理。兩種光下,兩種酶的趨勢保持一致,CHS酶在12～60 h中呈現(xiàn)先上升后下降,再上升繼而緩慢下降的趨勢;FLS酶則呈現(xiàn)先上升后下降,進而持續(xù)上升的趨勢。說明光照能夠促進相關(guān)酶活性提高,并且UV-B對CHS和FLS酶活的影響更為顯著。

圖7 光照時間進程對小豆芽苗菜類黃酮合成途徑關(guān)鍵酶的影響

2.6 光照時間進程對小豆芽苗菜黃酮類物質(zhì)關(guān)鍵酶基因表達量的影響

由表5可知,UV-B光下,PALclass2、CHS17like、FLS和UGT78D1like的酶基因表達量在60 h之內(nèi)基本處于上升的趨勢。其中PALclass2和CHS17like在48和60 h顯著高于W(p<0.05),FLS在24 h和48 h顯著高于W(p<0.05),UGT78D1like在48 h顯著高于W(p<0.05)。兩種光下,CHIlike的酶基因表達量都處于下降的趨勢,且在60 h UV-B大于60 h W的酶基因表達量。說明光照促進PALclass2、CHS17like、FLS和UGT78D1like基因的表達,UV-B的效果高于W。W促進CHIlike基因的表達,UV-B抑制CHIlike基因的表達。

表5 光照時間對小豆芽苗菜類黃酮合成途徑關(guān)鍵酶的影響

3 討論

3.1 光質(zhì)對小豆芽苗菜生長的影響

在本實驗室的其他研究中,通過B連續(xù)光照,可以提高大豆芽苗菜的異黃酮含量,同時也抑制了下胚軸的生長[17];短波長紫外光對植物生長有一定的危害,在齊學(xué)會等[10]的研究中,UV-B顯著抑制大豆芽苗菜下胚軸長。本實驗中,光照降低了小豆芽苗菜的株高和鮮重,主要是通過降低其含水量,對其干重質(zhì)量沒有影響。說明通過單色光質(zhì)提高小豆芽苗菜營養(yǎng)品質(zhì)的生產(chǎn)方式是可行的。

3.2 光質(zhì)對小豆芽苗菜總酚、類黃酮及主要類黃酮單體含量的影響

本實驗利用W、B、UV-A和UV-B四種光質(zhì)對小豆芽苗菜進行處理,以W作為對照,B、UV-A和UV-B提高了其總酚和類黃酮含量,其中UV-B顯著增加了類黃酮及其單體蘆丁和山奈酚的含量。與研究者[7,18-19]利用B、紅光提高苦蕎芽苗菜類黃酮及其單體含量的思路一致,B提高苦蕎芽苗菜的單體含量最高。UV-B處理下類黃酮含量基本持續(xù)上升,但是其槲皮素含量卻下降了,這是因為槲皮素是蘆丁的前體,因此UV-B可能促進槲皮素轉(zhuǎn)化為蘆丁以及其他單體,增加類黃酮單體種類的多樣化[20]。

槲皮素是重要的類黃酮單體,其在C3位羥基上結(jié)合糖分子即形成植物中普遍的成分-蕓香苷(蘆丁)。蘆丁是合成曲克蘆丁的主要原料,也可做食品抗氧劑和色素[21]。曲克蘆丁為心腦血管用藥,有防止血栓形成作用。國內(nèi)提取蘆丁的主要原料是槐花和槐米,但是其產(chǎn)量并不能達到要求[22]。本實驗通過UV-B提高小豆芽苗菜蘆丁含量極其顯著,可能為將來蘆丁提取原料的選擇提供根據(jù)。

3.3 UV-B光照時長對小豆芽苗菜生長和類黃酮含量的影響

小豆芽苗菜總酚和類黃酮以及其單體含量在UV-B條件下提高最為顯著(p<0.05),因此UV-B適合小豆芽苗菜營養(yǎng)品質(zhì)改善。為找到適合工廠化生產(chǎn)的UV-B光照時長,減少UV-B光照時長補充W光照至12 h,其中4 h UV-B光照補充8 h W,其鮮重有所下降,但是其干質(zhì)量卻有所增加,并且類黃酮類物質(zhì)最高。因此4 h UV-B光照時長可以作為小豆芽苗菜光環(huán)境調(diào)控的生產(chǎn)依據(jù)。

3.4 UV-B對小豆芽苗菜關(guān)鍵酶活性和基因表達量的影響

在12 h光照之后,類黃酮合成途徑的關(guān)鍵合成酶CHS,其活性在UV-B下顯著(p<0.05)高于W,在隨后12 h的黑暗下立即下降,說明黑暗對其酶活性沒有提高作用;在第二個12 h光照之后,CHS酶活性又迅速增加,并且超過首個光周期的酶活性,隨后在黑暗條件下緩慢下降。說明光照總體增加了CHS酶活性,UV-B更加顯著。類黃酮合成途徑的另一個關(guān)鍵合成酶FLS有類似的趨勢,除了在48 h即第二個周期之后保持繼續(xù)上升的趨勢。并且關(guān)鍵酶活基因表達量呈現(xiàn)類似的趨勢。因此推測這兩個酶與類黃酮以及單體的增加有關(guān)。

UV-B可以通過UVR8受體,調(diào)控HY5進而調(diào)控MYB轉(zhuǎn)錄因子的表達,從而調(diào)控下游類黃酮合成基因的表達[23]。例如,在Pandey等[24]的研究中,AtMYB111可以正向調(diào)控類黃酮合成途徑關(guān)鍵酶基因,從而提高擬南芥中PAL、FLS、CHS、CHI、F3H等酶的活性;在煙草中過表達轉(zhuǎn)錄因子AtMYB12可以提高PAL等酶的活性[24];MYB182可以負調(diào)控氏煙草(Nicotianabenthamiana)中CHS基因表達量[25]。在Yuan等[26]的研究中,LIGHTAREAS1(LAR1)基因?qū)LS的表達正向調(diào)控功能,從而調(diào)節(jié)其酶活,提高其花青苷和黃酮醇類物質(zhì)含量。在Feder等[27]的研究中,包含克爾希結(jié)構(gòu)域的F-Box蛋白AtKFB01、AtKFB2和 AtKFB50,對擬南芥的類黃酮合成途徑關(guān)鍵酶PAL有負調(diào)控作用,并且推測AtKFB50可能與CHS基因表達有關(guān)。至于UV-B提高小豆芽苗菜兩個類黃酮合成關(guān)鍵酶活性的機理需要進一步研究。

4 結(jié)論

綜上所述,B、UV-A和UV-B提高了小豆芽苗菜總酚和類黃酮含量。適當(dāng)?shù)腢V-B輻射可以提高CHS和FLS酶活性,促進PALclass2、CHS17like、FLS和UGT78D1like基因的表達,顯著(p<0.05)提高小豆芽苗菜中黃酮類物質(zhì)含量,尤其是黃酮醇類單體含量。生產(chǎn)上可采用4 h的UV-B補充光照作為小豆芽苗光環(huán)境調(diào)控的培養(yǎng)方式,為利用光照改進芽苗蔬菜的種植方式及改善品質(zhì)提供了試驗依據(jù)。