王 宏 李 星 蔚曉勇 郭秀春

隨著人們飲食和生活習慣的改變，我國結(jié)直腸癌的發(fā)病率呈上升趨勢。早期結(jié)直腸癌癥狀不典型甚至無癥狀，患者不易察覺，隨著瘤體增大而表現(xiàn)排便習慣、性狀的改變、便血、局部腹痛等癥狀，此時多已進展到中晚期[1]。目前，結(jié)直腸癌的主要篩查手段包括直腸指診、乙狀結(jié)腸鏡或纖維結(jié)腸鏡檢查，但因上述檢查均為侵入式，導(dǎo)致人們不愿定期篩查[2]。癌胚抗原(carcinoembryonic antigen，CEA)被認為與多種惡性腫瘤有關(guān)，但對結(jié)直腸癌診斷的靈敏度及特異度均較低[3]。環(huán)狀RNA(circular RNA，circRNA)與癌癥的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，是近年研究的熱點[4]。本研究通過比較結(jié)直腸癌患者、結(jié)直腸良性疾病患者與健康人群血清circRNA-HIPK3、circRNA-001569、CEA、癌抗原19-9(cancer antigen 19-9，CA19-9)水平，旨在探究聯(lián)合四者對結(jié)直腸癌的臨床價值。

1 材料與方法

1.1 研究對象的納入

選取本院2016年2月到2018年2月確診的結(jié)直腸癌患者80例作為病例組，患者均為首次住院且經(jīng)內(nèi)鏡組織學檢查確診。結(jié)腸癌的分期依據(jù)美國國立綜合癌癥網(wǎng)絡(luò)(National Comprehensive Cancer Network，NCCN)指南2013年第3版[5]，其中早期患者27例，中晚期患者53例；腺癌71例，鱗狀上皮癌5例，黏液癌4例；高分化癌31例，中分化癌39例，低分化癌10例。同期選取80例結(jié)直腸良性疾病(平滑肌瘤15例、纖維瘤19例、脂肪瘤27例及血管瘤19例)患者為良性病變組。選取同期在我院行健康體檢的健康人群80例作為對照組。納入標準：①語言表達能力正常，能與調(diào)查人員進行正常的溝通；②研究對象自愿參與本研究。排除標準：①既往有其他腫瘤疾病史者；②排除腦卒中、老年癡呆等神經(jīng)系統(tǒng)疾病導(dǎo)致的無法采集相關(guān)信息和精神分裂癥的患者。樣本例數(shù)計算的統(tǒng)計學依據(jù)為：n=2(μα+μβ)2γ2/δ2，其中μα為一類錯誤概率μ的值，本次研究規(guī)定α=0.05，查表得μα；μβ為二類錯誤概率μ的值，本次研究規(guī)定β=0.10，查表得μβ值；γ2為總體方差，通過文獻查閱獲得；δ為觀察組與對照組的患病率之差，通過文獻查閱獲得。本研究的開展經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準，所有納入對象均簽署了項目知情同意書。

1.2 臨床資料與樣本的采集

由研究人員記錄患者的年齡、性別、吸煙史、飲酒史等基本信息。使用促凝采血管收集經(jīng)禁食10 h以上結(jié)直腸癌和結(jié)直腸良性疾病患者接受治療前及健康對照者入院體檢時的靜脈血5 ml。收集的標本在1 h內(nèi)于4 ℃條件下以3 500 g離心力(離心半徑為10 cm)離心10 min，收集上層血清，并放入-80 ℃冰箱保存?zhèn)錂z測。

1.3 血清CEA與CA19-9水平的檢測

血清CEA和CA19-9的檢測均采用化學發(fā)光法，試劑由上海百蕊生物科技有限公司提供。質(zhì)控品采用英國朗道公司腫瘤高、低值質(zhì)控品，質(zhì)控判斷標準為Westgard多規(guī)則分析。同時計算血清CEA和CA19-9檢測的批內(nèi)、批間變異系數(shù)(coefficient of variation，CV)，以評估實驗的重復(fù)性和精確度。

1.4 circRNA-HIPK3、circRNA-001569表達水平的檢測

按照血清RNA提取試劑盒說明書步驟進行血清總RNA提取。取上述提取的RNA，使用去除基因組逆轉(zhuǎn)錄試劑盒逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，進行實時熒光定量PCR(Quantitative Real-time PCR，RT-PCR)。RT-PCR按照SYBR GREEN說明書進行，反應(yīng)體系為：Mix 10 μl，上下游引物各0.8 μl，cDNA 2 μl，DEPC水6.4 μl。熒光定量PCR循環(huán)條件：95 ℃變性5 min；95 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，45個循環(huán)，每組設(shè)置3個復(fù)孔。應(yīng)用PrimerPremier 5.0進行PCR引物設(shè)計，使用的circRNA-HIPK3、circRNA-001569與GAPDH引物序列見表1，引物合成由北京賽百盛基因技術(shù)有限公司提供。采用2-ΔΔCt法計算circRNAs的相對表達量，△Ct值=樣本Ct值-GAPDH Ct值。同時計算血清circRNA-HIPK3和circRNA-001569檢測的批內(nèi)、批間CV值，以評估實驗的重復(fù)性和精確度。

表1 circRNA-HIPK3、circRNA-001569與GAPDH的引物序列

1.5 統(tǒng)計學分析

2 結(jié)果

2.1 研究對象的基本臨床特征與血清circRNA-HIPK3、circRNA-001569、CEA與CA19-9水平

3組在性別組成、年齡、吸煙史、飲酒史等方面均無統(tǒng)計學差異(P>0.05)。單因素方差分析結(jié)果顯示，3組間血清circRNA-HIPK3、circRNA-001569、CEA與CA19-9水平差異均具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。兩兩比較結(jié)果顯示，與良性病變組和對照組相比，病例組血清circRNA-HIPK3、circRNA-001569、CEA與CA19-9表達水平顯著升高，且差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見表2。血清circRNA-HIPK3、circRNA-001569、CEA與CA19-9檢測的批內(nèi)CV值分別為3.1%、2.2%、1.3%、0.9%，批間CV值分別為4.0%、2.8%、1.6%、1.0%，均小于5%，提示本實驗樣本檢測具有良好的重復(fù)性和精確度。

表2 研究對象的臨床基本特征與血清circRNA-HIPK3、circRNA-001569、CEA與CA19-9表達水平

注：a為與病例組比較，P<0.05。

2.2 血清circRNA-HIPK3、circRNA-001569、CEA和CA19-9水平與結(jié)直腸癌臨床病理特征的關(guān)系

血清circRNA-HIPK3、circRNA-001569、CEA和CA19-9水平與結(jié)直腸癌患者的年齡、性別、吸煙史、飲酒史、組織學類型等均無明顯關(guān)系(P>0.05)，而與結(jié)直腸癌的分期和分化程度顯著相關(guān)(P<0.05)。且circRNA-HIPK3、circRNA-001569、CEA和CA19-9在中晚期結(jié)直腸癌及低分化結(jié)直腸癌患者中的水平增高最為顯著，見表3。

2.3 ROC曲線分析

血清circRNA-HIPK3、circRNA-001569、CEA和CA19-9區(qū)分結(jié)直腸癌與良性病變組和對照組的AUC分別為：0.927(95%CI：0.861～0.990，P<0.001)、0.881(95%CI：0.820～0.951，P<0.001)、0.856(95%CI：0.742～0.903，P<0.001)和0.683(95%CI：0.588～0.790，P<0.001)；在各指標約登指數(shù)為最大值時對應(yīng)的靈敏度及特異度分別為：84.2%/89.0%、91.2%/73.9%、63.1%/79.4%、66.2%/61.7%；對應(yīng)的臨界值分別為：30.3(-log)、8.8(-log)、7.1 ng/ml和28.2 U/ml(圖1-A)。當聯(lián)合circRNA-HIPK3、circRNA-001569、CEA和CA19-9時，運用logistics回歸模型將上述4個指標(變量)擬合后得到的新的變量-“PRE-1值”，而后將“PRE-1值”帶入ROC曲線進行分析，發(fā)現(xiàn)聯(lián)合4種指標在區(qū)分結(jié)直腸癌與良性病變組和對照組的AUC為0.962(95%CI：0.914～0.999，P<0.001，圖1-B)，靈敏度為96.1%，特異度為88.4%。

表3 血清circRNA-HIPK3、circRNA-001569、CEA和CA19-9水平與結(jié)直腸癌患者臨床病理特征的關(guān)系

圖1 血清circRNA-HIPK3、circRNA-001569、CEA和CA19-9對結(jié)直腸癌鑒別診斷的ROC曲線分析

2.4 血清circRNA-HIPK3、circRNA-001569、CEA和CA19-9水平對結(jié)直腸癌發(fā)生風險的預(yù)測價值

單因素分析結(jié)果顯示，高circRNA-HIPK3和高circRNA-001569水平是結(jié)直腸癌發(fā)病的危險因素。多因素分析顯示，在校正年齡、性別、吸煙、飲酒等因素影響后，高circRNA-HIPK3和高circRNA-001569水平仍是結(jié)直腸癌發(fā)病的獨立危險因素。見表4。

表4 circRNA-HIPK3、circRNA-001569、CEA和CA19-9水平與結(jié)直腸癌發(fā)生風險的預(yù)測價值

注：a為校正年齡、性別、吸煙、飲酒等因素。

3 討論

雖然近年來關(guān)于結(jié)直腸癌的臨床診療技術(shù)得到了顯著提高，但其患者的5年生存率仍維持在較低水平[6]。目前，結(jié)直腸癌篩查手段在臨床開展中仍存在諸多不足，例如，指診及內(nèi)鏡檢查的技術(shù)含量高，對臨床醫(yī)生的技能要求也較高；其次，該檢測的敏感性低，漏診率較高；更重要的是這些檢測具有一定侵入性，使得多數(shù)患者不愿意配合檢查，阻礙了技術(shù)在人群中推廣使用。因而，篩選出更多可靠的生物學標志物對結(jié)直腸癌的早期干預(yù)具有重要意義。

CEA和CA19-9是結(jié)直腸癌輔助診斷的重要指標，對結(jié)直腸癌的早期診斷有較大價值。韓潞等[7]發(fā)現(xiàn)CEA和CA19-9蛋白在結(jié)直腸癌組織中呈高表達；楊華等[8]通過對382例結(jié)直腸癌患者血清CEA和 CA19-9水平檢測發(fā)現(xiàn)，CEA和CA19-9陽性率分別為42.9%和18.6%，聯(lián)合兩者檢測的陽性率為48.4%。在本次研究中，與良性病變組和對照組相比，血清CEA與CA19-9表達水平在結(jié)直腸癌患者中顯著升高，且CEA和CA19-9區(qū)分結(jié)直腸癌患者與良性病變組和對照組的敏感性/特異性為63.1%/79.4%、66.2%/61.7%，與前期報道基本相符[7-8]。但CEA和CA19-9作為結(jié)直腸癌診斷的傳統(tǒng)指標，尚存在敏感性不足，特異性較低等問題。

近年來的研究表明，circRNA可通過與DNA、RNA或蛋白質(zhì)結(jié)合，在轉(zhuǎn)錄或轉(zhuǎn)錄后水平，以順勢調(diào)控或反式調(diào)控的方式，調(diào)節(jié)基因的表達，參與幾乎人類所有的生理及病理性生物學過程[9]。關(guān)于circRNA與結(jié)直腸癌國內(nèi)外已有多個研究報道。Hsiao等[10]發(fā)現(xiàn)circRNA-CCDC66在結(jié)直腸癌細胞中的表達顯著上調(diào)，且在circRNA-CCDC66被沉默抑制后結(jié)直腸癌細胞的增殖和侵襲能力明顯降低，而circRNA-CCDC66因此被認為是一種新的結(jié)直腸癌生物標志物。Xu等[11]通過對76例結(jié)直腸癌患者癌和癌旁組織中hsa_circ_000984表達水平的檢測發(fā)現(xiàn)，hsa_circ_000984基因的表達在癌組織中顯著上調(diào)，進一步的機制研究發(fā)現(xiàn)hsa_circ_000984能夠通過“海綿作用”抑制miR-106b表達，進而抑制癌細胞的凋亡。上述研究提示，circRNA的差異表達參與了結(jié)直腸癌的發(fā)生、發(fā)展過程。值得注意的是，Long[12]和Liu等[13]利用基因芯片技術(shù)與生物信息學分析，分別篩選出了可能調(diào)控骨肉瘤和肝癌發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵circRNA-circRNA-HIPK3與circRNA-001569。circRNA-HIPK3在骨肉瘤患者中顯著高表達，且在骨肉瘤細胞株中過表達circRNA-HIPK3后，細胞的增殖活性及克隆形成能力明顯增強、凋亡率顯著降低[12]；circRNA-001569通過“海綿作用”抑制miR-411-5p和miR-432-5p表達，促進肝癌細胞的增殖與侵襲[13]。而關(guān)于circRNA-HIPK3與circRNA-001569在結(jié)直腸癌中的表達情況未見報道，其是否具有成為早期腫瘤診斷標志物的潛力是本次研究需要探討的。本研究通過對80例結(jié)直腸癌患者血清學的分析發(fā)現(xiàn)，血清circRNA-HIPK3與circRNA-001569在結(jié)直腸癌中顯著增高，此外，血清circRNA-HIPK3與circRNA-001569水平與結(jié)直腸癌分期和分化程度顯著相關(guān)，兩者在中晚期結(jié)直腸癌及低分化結(jié)直腸癌患者中的水平增高最為顯著，提示兩者與結(jié)直腸癌的不良預(yù)后密切相關(guān)，該部分結(jié)果與前期研究基本相符[12-13]。

ROC曲線分析顯示，血清circRNA-HIPK3、circRNA-001569、CEA和CA19-9在區(qū)分結(jié)直腸癌與良性病變組和對照組時具有一定的價值，當聯(lián)合circRNA-HIPK3、circRNA-001569、CEA和CA19-9時在區(qū)分結(jié)直腸癌與良性病變組和對照組的靈敏度達到96.1%，提示聯(lián)合上述4種血清標志物具有較高的臨床應(yīng)用價值。多因素分析顯示，在校正年齡、性別、吸煙、飲酒等因素影響后，高circRNA-HIPK3和高circRNA-001569水平是結(jié)直腸癌發(fā)病的獨立危險因素。然而，本次研究仍有如下不足：①本研究納入80例結(jié)直腸癌患者，納入的例數(shù)仍然是有限的，后期需要更大樣本量的研究來證實circRNA-HIPK3、circRNA-001569、CEA和CA19-9在我國結(jié)直腸癌患者中的臨床價值；②本次研究中采用的circRNA-HIPK3、circRNA-001569、CEA和CA19-9多個指標的聯(lián)合模型雖然較各單獨指標有較高的臨床價值，但該模型的應(yīng)用仍有待進一步的驗證；③所有研究對象均來源于我院，這可能會造成潛在的選擇偏倚，因此本次研究結(jié)果有待多中心的前瞻性隊列研究進一步驗證。

綜上所述，本次研究發(fā)現(xiàn)聯(lián)合circRNA-HIPK3、circRNA-001569、CEA和CA19-9對結(jié)直腸癌的潛在診斷價值，有望為結(jié)直腸癌的臨床診療提供新的途徑。