盧永紅

在各類婦科腫瘤中，卵巢癌的致死率位居首位，只有25%～30%的5年生存率，對女性的健康及生命安全造成了嚴(yán)重威脅[1]。要想將卵巢癌的發(fā)生發(fā)展機(jī)制闡明，關(guān)鍵是要對卵巢癌患者的免疫狀態(tài)進(jìn)行分析[2]。本研究探討了卵巢癌患者組織及外周血CD8+T細(xì)胞中調(diào)節(jié)性T細(xì)胞相關(guān)分子標(biāo)志物的表達(dá)及意義，現(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 一般資料

隨機(jī)選取2016年8月至2018年8月我院卵巢癌患者62例，患者年齡27～72歲，平均(51.2±8.6)歲；在病理類型方面，40例為漿液性腺癌，10例為黏液性腺癌，12例為子宮內(nèi)膜樣腺癌；在國際婦產(chǎn)科聯(lián)盟(FIGO)分期方面[3]，6例為Ⅰ期，8例為Ⅱ期，46例為Ⅲ期，2例為Ⅳ期。另隨機(jī)選取同期我院卵巢良性腫瘤患者62例，患者年齡25～69歲，平均(47.2±7.2)歲；在腫瘤類型方面，24例為黏液性囊腺瘤，18例為漿液性囊腺瘤，14例為畸胎瘤，6例為巧克力囊腫。另隨機(jī)選取同期我院健康體檢人員62例，年齡27～70歲，平均(48.2±8.3)歲。3組人員的一般資料比較差異均不顯著(P>0.05)。

1.2 納入和排除標(biāo)準(zhǔn)

納入標(biāo)準(zhǔn)：①均具有完整的臨床資料；②均知情同意并簽署知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：①接受過免疫抑制劑治療；②接受過化療治療；③接受過外科手術(shù)治療。

1.3 方法

1.3.1 單細(xì)胞懸液制備 首先將新鮮外周血單個核細(xì)胞(PBMC)分離出來，在此過程中將天津?yàn)笊锕旧a(chǎn)的Ficoll液(淋巴細(xì)胞分離液)充分利用起來，PBS重懸細(xì)胞濃度到1×106/l。然后將新鮮切取的卵巢癌、卵巢良性腫瘤組織剪碎，規(guī)格約為1 mm3，之后將消化液加入其中，其含美國Sigma公司生產(chǎn)的谷氨酰胺、透明質(zhì)酸鈉、DNA酶Ⅰ、Ⅳ型膠原酶，將單個細(xì)胞分離出來，途徑為在37 ℃的孵箱中進(jìn)行2 h搖床消化，200目篩網(wǎng)過濾，并將淋巴單核細(xì)胞分離出來，在此過程中將Ficoll液充分利用起來，PBS重懸細(xì)胞濃度到1×106/l。

1.3.2 抗體染色與流式檢測 ①細(xì)胞膜表面抗體檢測。在美國e-Bioscience公司生產(chǎn)的anti-GITR-PE、美國BD公司生產(chǎn)的anti-CD28-APC、anti-CD25-APC、anti-CD8-FITC抗體中加入100 μl上述細(xì)胞懸液，室溫下進(jìn)行20 min的避光孵育，PBS進(jìn)行2次洗滌，將上清棄去，將300 μl PBS加入，上機(jī)檢測；②細(xì)胞內(nèi)抗體檢測。在anti-CD8-FITC抗體中加入100 μl上述細(xì)胞懸液，室溫下進(jìn)行20 min的避光孵育，進(jìn)行2次洗滌，在此過程中將含F(xiàn)BS的破膜緩沖液充分利用起來，將細(xì)胞固定液加入，室溫下進(jìn)行10 min的避光固定，洗滌后將破膜劑加入，室溫下進(jìn)行30 min的孵育，洗滌后將anti-CTLA-4-APC、anti-Foxp3-PE抗體加入，在4 ℃的溫度下進(jìn)行30 min的避光孵育，洗滌后將300 μl PBS重懸加入，檢測過程中采用Beckman Gallios流式細(xì)胞儀。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 卵巢癌、卵巢良性腫瘤患者組織CD8+T細(xì)胞中GITR、GTLA-4、CD28、CD25、Foxp3表達(dá)水平比較

卵巢癌患者組織CD8+T細(xì)胞中GTLA-4、Foxp3表達(dá)水平均顯著高于卵巢良性腫瘤患者(P<0.05)，CD28表達(dá)水平顯著低于卵巢良性腫瘤患者(P<0.05)，但卵巢癌、卵巢良性腫瘤患者組織CD8+T細(xì)胞中GITR、CD25表達(dá)水平之間的差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

表1 卵巢癌、卵巢良性腫瘤患者組織CD8+T細(xì)胞中GITR、GTLA-4、CD28、CD25、Foxp3表達(dá)水平比較

2.2 3組人員外周血CD8+T細(xì)胞中GITR、GTLA-4、CD28、CD25、Foxp3表達(dá)水平比較

卵巢癌患者外周血CD8+T細(xì)胞中GTLA-4、CD25、Foxp3表達(dá)水平均顯著高于卵巢良性腫瘤患者、健康體檢人員(P<0.05)，CD28表達(dá)水平顯著低于卵巢良性腫瘤患者、健康體檢人員(P<0.05)；但卵巢良性腫瘤患者、健康體檢人員外周血CD8+T細(xì)胞中GTLA-4、CD28、CD25、Foxp3表達(dá)水平之間的差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，卵巢癌、卵巢良性腫瘤患者、健康體檢人員外周血CD8+T細(xì)胞中GITR表達(dá)水平之間的差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

表2 3組人員外周血CD8+T細(xì)胞中GITR、GTLA-4、CD28、CD25、Foxp3表達(dá)率比較

2.3 卵巢癌患者外周血CD8+T細(xì)胞中GTLA-4、CD28、CD25、Foxp3表達(dá)水平和臨床病理參數(shù)的相關(guān)性分析

卵巢癌不同年齡、組織學(xué)分型、病理學(xué)分級、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者外周血CD8+T細(xì)胞中GTLA-4、CD25表達(dá)水平之間的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；組織學(xué)分型黏液性腺癌、子宮內(nèi)膜樣腺癌、漿液腺腺癌患者外周血CD8+T細(xì)胞中CD28表達(dá)水平逐漸降低(P<0.05)，但不同年齡、病理學(xué)分級、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者外周血CD8+T細(xì)胞中CD28表達(dá)水平之間的差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；TNM分期Ⅲ/Ⅳ期、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者外周血CD8+T細(xì)胞中Foxp3表達(dá)水平顯著高于Ⅰ/Ⅱ期、無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者(P<0.05)，但不同年齡、組織學(xué)分型、病理學(xué)分級患者外周血CD8+T細(xì)胞中GTLA-4、CD28、CD25表達(dá)水平之間的差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表3。

表3 卵巢癌患者外周血CD8+T細(xì)胞中GTLA-4、CD28、CD25、Foxp3表達(dá)率和臨床病理參數(shù)的相關(guān)性分析

3 討論

調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg)在機(jī)體腫瘤免疫中將重要作用發(fā)揮了出來，是成熟T細(xì)胞亞群，具有免疫抑制功能[4]?，F(xiàn)階段，CD4+Treg是Treg研究的主要方向，但是CD8+Treg在Treg研究中卻較為少見[5]。近年來，越來越多的相關(guān)醫(yī)學(xué)研究表明[6-10]，在腫瘤、自身免疫性疾病等中，CD8+Treg具有重要的免疫調(diào)節(jié)作用。相關(guān)醫(yī)學(xué)研究表明[11-13]，與健康人、卵巢良性腫瘤患者相比，卵巢癌患者具有顯著較高的組織、外周血CD8+Treg比例，同時，CD8+T 細(xì)胞中Foxp3表達(dá)率可能能夠?qū)⒁欢ㄒ罁?jù)提供給臨床對卵巢癌進(jìn)展?fàn)顩r的了解。本研究結(jié)果表明，卵巢癌患者組織CD8+T細(xì)胞中GTLA-4、Foxp3表達(dá)率均顯著高于卵巢良性腫瘤患者(P<0.05)，CD28表達(dá)率顯著低于卵巢良性腫瘤患者(P<0.05)。卵巢癌患者外周血CD8+T細(xì)胞中GTLA-4、CD25、Foxp3表達(dá)率均顯著高于卵巢良性腫瘤患者、健康體檢人員(P<0.05)，CD28表達(dá)率顯著低于卵巢良性腫瘤患者、健康體檢人員(P<0.05)。卵巢癌組織學(xué)分型黏液性腺癌、子宮內(nèi)膜樣腺癌、漿液腺腺癌患者外周血CD8+T細(xì)胞中CD28表達(dá)率逐漸降低(P<0.05)；TNM分期Ⅲ/Ⅳ期、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者外周血CD8+T細(xì)胞中Foxp3表達(dá)率顯著高于Ⅰ/Ⅱ期、無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者(P<0.05)，和上述相關(guān)醫(yī)學(xué)研究結(jié)果一致。

總之，卵巢癌患者組織及外周血CD8+T細(xì)胞中調(diào)節(jié)性T細(xì)胞相關(guān)分子標(biāo)志物表達(dá)異常，能夠?qū)⒁欢ㄒ罁?jù)提供給臨床對卵巢癌進(jìn)展?fàn)顩r的了解，值得臨床充分重視。