李 筱 張 靜 向慧敏

食管癌是全球發(fā)病率較高且預(yù)后較差的腫瘤之一。我國(guó)是食管癌高發(fā)國(guó)家，部分地區(qū)的發(fā)病率高達(dá)29.81/10萬(wàn)[1]。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，長(zhǎng)鏈非編碼RNA(long non-coding RNA，lncRNA)與食管癌的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[2]。LncRNA是1類長(zhǎng)約200 nt的非編碼RNA，通過(guò)表觀遺傳調(diào)控參與各種生理病理過(guò)程，已被證實(shí)在胃癌、結(jié)直腸癌、肝癌等消化系統(tǒng)腫瘤中具有較大診斷價(jià)值[3-4]?；|(zhì)金屬蛋白酶-1(Matrix metalloproteinase-1，MMP-1)是1類重要的水解細(xì)胞外基質(zhì)的蛋白水解酶，參與到腫瘤的生長(zhǎng)與轉(zhuǎn)移過(guò)程。血清淀粉樣蛋白A(serum amyloid protein A，SAA)是體內(nèi)重要的急性時(shí)相反應(yīng)蛋白，他的升高常提示機(jī)體處于炎癥狀態(tài)。近年來(lái)關(guān)于SAA在多發(fā)性骨髓瘤[5]、直腸癌[6]等腫瘤的分化、增殖、轉(zhuǎn)移及預(yù)后中發(fā)揮作用也均有報(bào)道。本研究通過(guò)比較食管癌患者與健康人群的lncRNA ATB、MMP-1與SAA水平，旨在探究三者對(duì)食管癌的診斷價(jià)值，并分析三者與食管癌分化程度、TNM分期的相關(guān)性，以期為食管癌的臨床診療提供新思路。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象的納入

收集本院2016年3月至2017年12月確診的食管癌患者135例作為病例組，包括男性98例，女性37例，平均年齡(54.1±4.7)歲。其中上段食管癌25例，中段食管癌68例，下段食管癌42例；早期食管癌患者26例，中晚期患者109例；鱗癌113例，腺癌15例，腺鱗癌7例；高分化癌37例，中分化癌85例，低分化癌13例。患者均為首次住院且經(jīng)內(nèi)鏡組織學(xué)檢查確診為食管癌。根據(jù)病理學(xué)資料判斷食管癌的分化程度。食管癌的分期根據(jù)臨床表現(xiàn)、影像學(xué)檢查及內(nèi)鏡下表現(xiàn)等資料等進(jìn)行。對(duì)照組為同期在我院行健康體檢的健康人群150例，包括男性102例，女性48例，平均年齡(53.9±3.4)歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：①意識(shí)清楚，語(yǔ)言表達(dá)能力正常，能與調(diào)查人員進(jìn)行正常的溝通；②與研究者進(jìn)行研究目的溝通后，研究對(duì)象自愿參與本研究。排除標(biāo)準(zhǔn)：①腎小球腎炎、腎盂腎炎、高血壓病、結(jié)締組織病等其他疾病引起的腎臟損害與糖尿病其他并發(fā)癥；②其他惡性腫瘤、嚴(yán)重心腦血管疾病、自身免疫性疾病等；③患者或其家屬不愿意簽署知情同意書者。本課題的開(kāi)展經(jīng)過(guò)院倫理會(huì)批準(zhǔn)，研究對(duì)象均簽署知情同意書。

1.2 臨床資料采集

由專業(yè)人員對(duì)所有納入對(duì)象的臨床資料[年齡、吸煙史、飲酒史、體重指數(shù)(body Mass Index，BMI)等]進(jìn)行采集，BMI計(jì)算方法為體重/身高2(kg/m2)。

1.3 lncRNA ATB表達(dá)水平的檢測(cè)

由專業(yè)醫(yī)護(hù)人員使用EDTA抗凝采血管抽取研究對(duì)象靜脈血2 ml。血漿RNA的提?。喊凑昭獫{RNA提取試劑盒說(shuō)明書步驟進(jìn)行總血漿RNA提取。取上述提取的RNA，使用去除基因組逆轉(zhuǎn)錄試劑盒逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR(Quantitative Real-time PCR，RT-PCR)。RT-PCR按照SYBR GREEN說(shuō)明書進(jìn)行，反應(yīng)體系為：Mix 10 μl，上下游引物各0.8 μl，cDNA 2 μl，DEPC水6.4 μl。熒光定量PCR循環(huán)條件：95 ℃變性5 min；95 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，45個(gè)循環(huán)，每組設(shè)置2個(gè)復(fù)孔。使用的引物序列為：lncRNA ATB上游：5'-TTCATTTTAACAGTCCAGAA-3'，下游：5'-CTCCTCCGTTGAATCCAT-3'；GAPDH上游：5'-AGAAGGCTGGGGCTCATTTG-3'，下游：5'-GCAGGAGGCATTGCTGATGAT-3'。采用2-ΔΔCt法計(jì)算lncRNA的相對(duì)表達(dá)量，△Ct值=樣本Ct值-GAPDH Ct值。

1.4 血清MMP-1與SAA水平的檢測(cè)

采用酶聯(lián)免疫吸附法(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)檢測(cè)每組對(duì)象血清MMP-1水平，試劑盒由武漢博士德生物工程公司提供，檢測(cè)過(guò)程嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明說(shuō)進(jìn)行，簡(jiǎn)明步驟如下：所有標(biāo)本經(jīng)稀釋(1∶100)后依次加入微孔板中與抗體室溫孵育40 min(同時(shí)加入MMP-1濃度為200 pg/ml、20 pg/ml、2 pg/ml的3個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品、陽(yáng)性和陰性對(duì)照)，洗板5次，在避光條件下加入酶標(biāo)記的單抗室溫孵育40 min，再洗板5次，加入底物反應(yīng)15 min后終止反應(yīng)，于Nanodrop ND2000分析儀(美國(guó)賽默飛世爾公司)上檢測(cè)吸光值(A)。血清SAA的檢測(cè)采用化學(xué)發(fā)光法，試劑由上海百蕊生物科技有限公司提供，采用美國(guó)貝克曼庫(kù)爾特公司UniCel DxI 800分析儀進(jìn)行檢測(cè)。質(zhì)控品采用英國(guó)朗道公司腫瘤高、低值質(zhì)控品，質(zhì)控判斷標(biāo)準(zhǔn)為Westgard多規(guī)則分析。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 兩組研究對(duì)象的基本臨床信息及l(fā)ncRNA ATB、MMP-1和SAA水平的比較

兩組研究對(duì)象的基本臨床信息及l(fā)ncRNA ATB、MMP-1和SAA水平見(jiàn)表1。如表所示，病例組的lncRNA ATB、MMP-1和SAA水平均顯著高于對(duì)照組，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。兩組研究對(duì)象在年齡、性別組成、BMI、吸煙與否、飲酒與否等方面的差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

表1 兩組研究對(duì)象的基本臨床信息及l(fā)ncRNA ATB、MMP-1和SAA水平的比較

2.2 lncRNA ATB、MMP-1和SAA水平與食管癌患者臨床病理特征的關(guān)系

如表2所示，lncRNA ATB、MMP-1和SAA水平與食管癌患者的年齡、性別、吸煙史、飲酒史、腫瘤部位等因素均無(wú)明顯關(guān)系(P>0.05)，而與食管癌的分期、分化程度及組織學(xué)類型顯著相關(guān)(P<0.05)。lncRNA ATB、MMP-1和SAA水平在中晚期食管癌、食管腺鱗癌與低分化食管癌患者中的增高最為顯著。

表2 lncRNA ATB、MMP-1和SAA水平與食管癌患者臨床病理特征的關(guān)系

2.3 lncRNA ATB、MMP-1和SAA對(duì)食管癌鑒別診斷的ROC曲線分析

ROC曲線分析顯示，血清lncRNA ATB、MMP-1和SAA在區(qū)分食管癌與對(duì)照組的AUC分別為：0.841(95% CI：0.771～ 0.911，P<0.001)、0.861(95% CI：0.800～ 0.922，P<0.001)和0.667(95% CI：0.578～ 0.755，P=0.001)；靈敏度/特異度分別為：85.9%/74.6%、80.3%/77.5%和69.0%/63.4%；診斷界值分別為：9.6(-log)、45.6 pg/ml和26.8mg/l。見(jiàn)圖1A。聯(lián)合lncRNA ATB、MMP-1和SAA在區(qū)分食管癌與對(duì)照組的AUC為0.887(95% CI：0.822 ～ 0.951，P<0.001)，靈敏度79.7%，特異度92.8%，見(jiàn)圖1B。

A為lncRNA ATB、MMP-1和SAA區(qū)分食管癌與對(duì)照組；B為聯(lián)合lncRNA ATB、MMP-1和SAA區(qū)分食管癌與對(duì)照組

2.4 lncRNA ATB、MMP-1和SAA水平對(duì)食管癌的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估

lncRNA ATB、MMP-1和SAA水平與食管癌的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的單因素與多因素分析結(jié)果見(jiàn)表3。單因素分析結(jié)果顯示，高lncRNA ATB、MMP-1和SAA水平是食管癌發(fā)病的危險(xiǎn)因素。多因素分析結(jié)果表明，在校正年齡、性別、BMI、吸煙、飲酒等因素影響后，高lncRNA ATB、MMP-1和SAA水平仍是食管癌發(fā)病的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。

表3 lncRNA ATB、MMP-1和SAA水平與食管癌的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估

3 討論

食管癌是世界上最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，對(duì)人類健康構(gòu)成了巨大的威脅[7]。雖然近年來(lái)食管癌的治療技術(shù)有所提高，但其五年生存率仍維持在較低水平[8]。早期食管癌癥狀不典型甚至無(wú)癥狀，患者不易察覺(jué)，當(dāng)出現(xiàn)進(jìn)行性吞咽困難等典型癥狀時(shí)，病情多已進(jìn)展到中晚期[9-10]。目前，食管癌的主要篩查手段是食管脫落細(xì)胞學(xué)檢查(食管拉網(wǎng))，但由于其技術(shù)含量相對(duì)較高，且敏感性和特異性均較低，無(wú)法在人群中推廣使用[11]。因而，篩選出更多可靠的生物學(xué)標(biāo)志物已成為當(dāng)下食管癌的研究熱點(diǎn)，對(duì)食管癌的早期干預(yù)具有重要意義。

近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，多種lncRNA在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中扮演著重要角色，且在腫瘤發(fā)生早期其表達(dá)量即發(fā)生改變，這些lncRNA包括ATB、H19、ROR、XLOC005009、MEG3、HOTAIR等。Saito等[12]的研究發(fā)現(xiàn)，lncRNA ATB可能通過(guò)表皮生長(zhǎng)因子受體依耐性信號(hào)通路促進(jìn)胃癌細(xì)胞生長(zhǎng)以及侵襲-轉(zhuǎn)移級(jí)聯(lián)反應(yīng)，且在胃癌組織中的表達(dá)顯著高于正常組織。Qu 等[13]的研究表明，lncRNA ATB可通過(guò)介導(dǎo)上皮細(xì)胞-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化的發(fā)生，從而促進(jìn)胰腺癌侵襲和轉(zhuǎn)移，并提示lncRNA ATB的高表達(dá)與腫瘤的不良預(yù)后相關(guān)。以上研究結(jié)果表明，lncRNA可通過(guò)多種途徑參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展過(guò)程，具有成為早期腫瘤診斷標(biāo)志物的潛力。本研究結(jié)果顯示，血漿lncRNA ATB對(duì)食管癌的診斷具有重要價(jià)值，且血漿高lncRNA ATB水平是食管癌發(fā)病的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，與前期研究基本相符[12-13]。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)，血漿lncRNA ATB水平在中晚期食管癌、食管腺鱗癌與低分化食管癌患者中的升高最為顯著，提示三者與食管癌的不良預(yù)后密切相關(guān)。

近年來(lái)國(guó)內(nèi)外多個(gè)研究報(bào)道指出血清MMP-1在重塑腫瘤微環(huán)境、促進(jìn)腫瘤遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、以及在腫瘤診斷及預(yù)后等評(píng)價(jià)中具有積極的價(jià)值[14-16]。早前的研究已顯示，胃癌患者血漿MMP-1基因表達(dá)水平較健康人顯著上調(diào)，并認(rèn)為MMP-1 的上調(diào)參與到胃癌細(xì)胞的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移[14]。Benson等[15]應(yīng)用熒光定量PCR對(duì)乳腺癌患者癌組織和癌旁組織中MMP-1基因表達(dá)水平的比較也發(fā)現(xiàn)，癌組織中MMP-1基因表達(dá)顯著高于癌旁組織。這些研究均提示MMP-1參與腫瘤的發(fā)生與發(fā)展。本次研究，我們首次通過(guò)臨床大樣本檢測(cè)食管癌患者血清中MMP-1的差異表達(dá)，且血清MMP-1水平在中晚期食管癌、食管腺鱗癌與低分化食管癌患者中的升高最為顯著，與前期的相關(guān)研究相互呼應(yīng)[16]。

SAA是1種在多種免疫細(xì)胞中廣泛表達(dá)的多功能細(xì)胞因子，在細(xì)胞的生長(zhǎng)與分化及炎癥反應(yīng)中發(fā)揮重要作用。近年研究發(fā)現(xiàn)，一些腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞可以通過(guò)旁分泌途徑釋放SAA，進(jìn)而重塑腫瘤微環(huán)境，促進(jìn)腫瘤的進(jìn)展。Flores等[17]通過(guò)對(duì)233例骨肉瘤患者的研究發(fā)現(xiàn)，與健康者相比，骨肉瘤患者血清SAA水平顯著升高，且其高表達(dá)與腫瘤的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移相關(guān)。在乳腺癌研究中，Yang等[18]發(fā)現(xiàn)癌組織中SAA基因表達(dá)顯著高于癌旁組織，并指出SAA的表達(dá)參與腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞的活化，是構(gòu)成腫瘤微環(huán)境的重要因素。本研究發(fā)現(xiàn)，食管癌患者血清SAA水平顯著增高；且血清SAA水平在中晚期食管癌、食管腺鱗癌與低分化食管癌患者中的升高最為顯著，與之前的研究結(jié)果相一致[17]。

ROC曲線分析顯示，lncRNA ATB、MMP-1和SAA在區(qū)分食管癌與對(duì)照組時(shí)具有一定的價(jià)值，當(dāng)聯(lián)合lncRNA ATB、MMP-1和SAA等指標(biāo)時(shí)在區(qū)分食管癌與對(duì)照組時(shí)的特異度達(dá)到92.8%，提示聯(lián)合上述3種血清標(biāo)志物具有較高的臨床應(yīng)用價(jià)值。然而，本次研究仍有如下不足：①本次研究納入的患者均來(lái)自于本院，這可能會(huì)對(duì)研究結(jié)果造成一定的偏倚影響，今后需要多中心的隊(duì)列研究來(lái)進(jìn)一步驗(yàn)證我們的結(jié)果；②本研究納入135例食管癌患者，納入的例數(shù)仍然是有限的，后期需要更大樣本量的研究來(lái)證實(shí)lncRNA ATB、MMP-1和SAA在我國(guó)食管癌患者中的臨床價(jià)值；③本次研究中采用的lncRNA ATB、MMP-1和SAA多個(gè)指標(biāo)的聯(lián)合模型雖然較各單獨(dú)指標(biāo)有較高的臨床價(jià)值，但該模型的應(yīng)用仍有待進(jìn)一步的驗(yàn)證。

綜上所述，本次研究發(fā)現(xiàn)了lncRNA ATB、MMP-1和SAA對(duì)食管癌的潛在診斷價(jià)值，并證實(shí)lncRNA ATB、MMP-1和SAA對(duì)食管癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的評(píng)估具有重要意義，這些發(fā)現(xiàn)有望為食管癌的早期診斷提供新的途徑。