張小康，張雪麗，熊秋芳,2

（1.武漢市農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所，湖北 武漢 430345；2.武漢蔬博農(nóng)業(yè)科技有限公司，湖北 武漢 430060）

【研究意義】葉片是植物進(jìn)行光合作用、呼吸作用和蒸騰作用的主要器官，影響植物的光合效率、產(chǎn)量及品質(zhì)等［1］。植物葉片形態(tài)由葉形、葉尖、葉基及葉緣等組成，其中葉緣具有全緣、鋸齒、裂刻、波浪等形狀。葉緣的適度裂刻可改變植株株型，提高群體的通風(fēng)性、透光性及整個(gè)植株的光能利用率，同時(shí)在一定程度上抑制病蟲害發(fā)生，且有利于植物對(duì)高溫、干旱等逆境的適應(yīng)性［2］?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】蘿卜（Raphanus sativus L.）為十字花科蘿卜屬一、二年生草本植物，是重要的蔬菜作物。植物葉緣裂刻目的性狀的定位方面，主要集中在擬南芥和番茄等植物上，而對(duì)十字花科蘿卜屬植物中葉緣裂刻性狀的研究還較少［3］?；蓰渹b等［4］利用cDNA-AFLP技術(shù)，開發(fā)了一條與裂刻緊密連鎖的SCAR標(biāo)記用于裂葉純合和雜合的分子輔助選擇。鄧杰等［5］通過構(gòu)建白葉緣裂刻BC2DH群體，發(fā)現(xiàn)在A03和A10上各存在一個(gè)與白菜葉緣裂刻相關(guān)的QTL。【本研究切入點(diǎn)】目前關(guān)于蘿卜葉緣裂刻的分子標(biāo)記及利用分子標(biāo)記輔助選擇對(duì)蘿卜葉緣裂刻的育種選擇方面均未見報(bào)道?！緮M解決的關(guān)鍵問題】本試驗(yàn)通過對(duì)蘿卜裂葉性狀的世代調(diào)查與統(tǒng)計(jì)，研究其遺傳規(guī)律。同時(shí)利用集團(tuán)混合法（BSA）與AFLP技術(shù)相結(jié)合篩選與蘿卜葉緣裂刻基因緊密連鎖的分子標(biāo)記［6-8］，以此作為蘿卜雜交種純度篩選及其他性狀輔助選擇的工具之一。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

以淺裂材料“武青一號(hào)”為母本，全裂葉材料“新洲花葉”為父本雜交得到F1，將F1分別套袋自交和回交，產(chǎn)生F2和BC1。

1.2 性狀調(diào)查

出苗后30 d左右運(yùn)用目測法，根據(jù)葉型評(píng)判標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)全部單株的葉形表型進(jìn)行調(diào)查記載并統(tǒng)計(jì)好各類葉形的單株數(shù)目。由于F2組合中植株葉形存在較多中間過渡類型，故將全為裂葉的記錄為全裂葉，缺刻少或淺、不明顯的記錄為葉淺裂。

葉型評(píng)判標(biāo)準(zhǔn)：葉淺裂單個(gè)葉片面積大，缺刻很少或淺；葉全裂，葉緣呈鋸齒狀。利用卡方測驗(yàn)分析（χ2）葉緣裂刻遺傳規(guī)律。

1.3 基因組DNA的提取

采用常用的CTAB方法提取基因組DNA，具體制備方法參照李佳等［9］方法進(jìn)行。

1.4 基因池的構(gòu)建

采用集團(tuán)混合法（Bulked Segregation Analysis，簡稱BSA［10］），在F2群體中，根據(jù)表型分析結(jié)果，分別取10個(gè)葉淺裂單株和10個(gè)葉全裂單株的基因組DNA，將其DNA進(jìn)行等量混合，構(gòu)建成葉淺裂DNA池和葉全裂DNA。

1.5 標(biāo)記篩選

利用AFLP引物組合（EA/MC和EA/MG組合），AFLP接頭和引物序列設(shè)計(jì)均按照VOS等［11］方法進(jìn)行，引物由武漢天一輝遠(yuǎn)生物有限公司合成，在親本與兩個(gè)基因池間進(jìn)行篩選。引物組合的序列如表1所示。

在PAGE膠上回收在雙親中產(chǎn)生的AFLP差異片段，放入0.5 mL離心管中，加入20 μL dd H2O，并用一次性無菌槍頭搗碎，在95 ℃保溫10 min自然冷卻，離心后取2 μL上清液為模板重新進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增所用引物及反應(yīng)條件與AFLP相同。取20 μL PCR產(chǎn)物在1.0%瓊脂糖凝膠上檢測，將擴(kuò)增出的目標(biāo)片段用UNIQ-10柱式DNA膠回收試劑盒（上海生工生物工程技術(shù)公司）進(jìn)行回收。操作程序參照該試劑盒說明書。

將兩親本間有差異的引物對(duì)，在兩個(gè)基因池進(jìn)行PCR擴(kuò)增，選擇在兩個(gè)基因池中表現(xiàn)有差異的引物組合EA1/MC8、EA3/MC4、EA4/MC4，進(jìn)一步對(duì)基因池間各單株的基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增和電泳檢測，確定篩選出的引物組合EA1/MC8為葉緣裂刻性狀的連鎖標(biāo)記，再對(duì)F2分離群體的DNA樣品進(jìn)行PCR擴(kuò)增和電泳檢測；篩選到與蘿卜葉緣缺刻性狀緊密連鎖的AFLP標(biāo)記引物組合EA1/MC8的片段進(jìn)行回收、克隆、測序，其中：EA1/MC8引物組合的序列如下：

EA1：5’-GAC TGC GTA CCA ATT CAA A-3’，

MC8：5’-GAT GAG TCC TGA GTA ACT G-3’。

將回收的目標(biāo)片段連接在pMDT-18 載體上（購自寶生物工程大連有限公司，即TaKaRa）。操作程序按試劑盒說明書。選8份轉(zhuǎn)化成功的菌液各吸取100 μL送至武漢天一輝遠(yuǎn)生物有限公司進(jìn)行序列測定。剩余400 μL渾濁菌液加400 μL50%無菌甘油在2 mL無菌離心管中于-70℃編號(hào)保存。

根據(jù)測序得到DNA片段的核苷酸序列，利用Primer Premier5.0軟件（http：// www.PremierBiosoft.com）設(shè)計(jì)引物，引物設(shè)計(jì)原則為：GC含量為40%～70%，Tm值為60～70，引物內(nèi)無二級(jí)結(jié)構(gòu)，引物間不能相互配對(duì)，SCAR引物的正反兩個(gè)方向長度26 bp，由武漢天一輝遠(yuǎn)生物有限公司合成，引物DNA序列如下所示。

表1 AFLP引物序列Table 1 List of AFLP primer sequence

正向引物：5’-ACTGGTTATCTTGTGGTGAT GGAAAC-3’，

反向引物：5’-AAGTCGGTTTGGATAAGCA TAGGGGG-3’。

1.6 SCAR標(biāo)記分析

將轉(zhuǎn)化成功的SCAR標(biāo)記首先在雙親和兩個(gè)基因池中進(jìn)行PCR擴(kuò)增，發(fā)現(xiàn)該引物表型出多態(tài)性，表明該標(biāo)記已發(fā)展成一個(gè)顯性的SCAR標(biāo)記。

2 結(jié)果與分析

2.1 裂葉性狀的遺傳規(guī)律

對(duì)各個(gè)世代的植株葉形觀察、統(tǒng)計(jì)，結(jié)果表明，“武青一號(hào)”ד新洲花葉” F1與親本“武青一號(hào)”回交產(chǎn)生的BC1群體中，42株為葉淺裂，39株為葉全裂，x2檢驗(yàn)其分離比符合1∶1。F1與親本“新洲花葉”回交產(chǎn)生的BC1后代87個(gè)單株全部為葉全裂（圖1）。F1自交獲得的F2群體，總株數(shù)為241株，其中葉形表現(xiàn)為葉全裂的有185株，表現(xiàn)為葉淺裂有56株，x2檢驗(yàn)其分離比符合3∶1（表2）。說明蘿卜葉緣裂刻的表型符合顯性單基因遺傳模式。

2.2 BSA與AFLP相結(jié)合分子標(biāo)記的篩選

從20對(duì)AFLP引物中篩選出3對(duì)在兩個(gè)基因池間表現(xiàn)出多態(tài)性。將篩選出具有多態(tài)性的引物在組成葉淺裂DNA池和葉全裂DNA池的20個(gè)單株基因組DNA中進(jìn)行驗(yàn)證，進(jìn)一步分析表明，AFLP引物組合EA1/MC8具有較好穩(wěn)定性和重現(xiàn)性，該引物組合擴(kuò)增產(chǎn)生片段大小為251 bp，與蘿卜葉緣裂刻基因緊密連鎖。

圖1 親本及F1、F2代葉片部生物學(xué)表型Fig.1 Leaf phenotypes of parents, F1 and F2 generations

表2 蘿卜葉緣裂刻分離群體的表型鑒定Table 2 Phenotypic identification of split population in leaf edge of radish

2.3 SCAR標(biāo)記驗(yàn)證及分析

將轉(zhuǎn)化成功的SCAR標(biāo)記首先在雙親和兩個(gè)基因池中進(jìn)行PCR擴(kuò)增，發(fā)現(xiàn)該引物表型出多態(tài)性，表明該標(biāo)記已發(fā)展成一個(gè)顯性的SCAR標(biāo)記，將其命名為HY-18。HY-18標(biāo)記的特征見表3。

表3 SCAR標(biāo)記引物對(duì)核苷酸序列Table 3 SCAR marker primer pair nucleotide sequence

用SCAR標(biāo)記引物HY-18對(duì)F2群體中241個(gè)單株進(jìn)行擴(kuò)增，結(jié)果185個(gè)葉全裂單株中有179個(gè)都能觀察到此特異帶，而6個(gè)沒有出現(xiàn)該特異帶；56個(gè)葉淺裂單株中，54個(gè)單株不能擴(kuò)增出該特異帶，而2個(gè)單株能夠擴(kuò)增出此帶（圖2）。

表4表明，制備的SCAR標(biāo)記引物HY-18與蘿卜葉緣裂刻基因緊密連鎖，可以成功應(yīng)用于蘿卜葉緣裂刻材料的鑒定等輔助選擇中。

3 討論

3.1 裂葉遺傳規(guī)律

圖2 SCAR 標(biāo)記引物HY-18 擴(kuò)增結(jié)果Fig.2 Amplification results of SCAR Maker primer HY-18

裂葉是作物育種中理想用于性狀篩選的形態(tài)標(biāo)記性狀，油菜及大白菜方面的研究較多［12-14］。多年來，國內(nèi)外研究者對(duì)白菜、油菜、擬南芥、番茄等其他物種的葉緣裂刻性狀遺傳進(jìn)行了研究，蘿卜中主要針對(duì)肉質(zhì)根及F1代純度開展了研究和應(yīng)用［15-19］。部分研究表明，裂葉性狀受1～2對(duì)主效基因控制，遺傳關(guān)系相對(duì)簡單。因此通過鑒定親本及F1各單株的苗期葉形就很容易辨別真假雜種，能夠提高大田種子純度，為雜種優(yōu)勢利用提供方便。本試驗(yàn)通過目測法，對(duì)蘿卜裂葉性狀的遺傳規(guī)律進(jìn)行研究，通過多個(gè)世代的綜合分析表明蘿卜葉緣裂刻的表型符合顯性基因遺傳模式，蘿卜葉緣缺裂受單個(gè)遺傳位點(diǎn)控制，全裂葉為顯性，葉淺裂為隱性。這與十字花科其他作物研究結(jié)果類似［20］。

3.2 裂葉性狀的利用途徑

傳統(tǒng)的蘿卜葉形主要分為全緣葉和羽狀裂葉，而葉緣裂刻全裂的蘿卜葉形是蘿卜種質(zhì)資源多樣性的表現(xiàn)，由于全裂葉對(duì)全緣葉為顯性表現(xiàn)，可以作為蘿卜雜交育種中假雜種篩選的輔助性狀進(jìn)行利用。與傳統(tǒng)表型選擇相比，可在植物生長任何時(shí)期不受環(huán)境條件影響，且可以排除等位基因互作而造成的干擾，具有快速、經(jīng)濟(jì)、高效、準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn)。

4 結(jié)論

本研究結(jié)果表明，通過BSA與AFLP技術(shù)相結(jié)合篩選與蘿卜葉緣裂刻基因緊密連鎖的分子標(biāo)記，制備的SCAR標(biāo)記引物HY-18與蘿卜葉緣裂刻基因緊密連鎖，可以成功應(yīng)用于蘿卜葉緣裂刻材料的鑒定等輔助選擇中。因此，下一步工作是將與蘿卜裂葉性狀相關(guān)的基因進(jìn)行精細(xì)定位和圖位克隆，對(duì)于揭示蘿卜裂葉機(jī)理及應(yīng)用于純度鑒定和性狀篩選都具有重要意義。