祁寒松，吳紅霞，仇華吉，孫元

α皰疹病毒的神經(jīng)傳導(dǎo)——軸突上的“穿梭”

祁寒松，吳紅霞，仇華吉，孫元

中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所 獸醫(yī)生物技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江 哈爾濱 150069

α皰疹病毒經(jīng)過長期的進(jìn)化與宿主形成了良好的相互適應(yīng)關(guān)系。其中部分α皰疹病毒具有典型的嗜神經(jīng)特性，受到廣泛的關(guān)注和深入的研究。嗜神經(jīng)性α皰疹病毒能突破宿主屏障而感染神經(jīng)元，并在其胞體內(nèi)大量繁殖進(jìn)而完成進(jìn)一步的擴(kuò)散或在胞體中建立潛伏感染。病毒無論是感染神經(jīng)元還是在進(jìn)一步擴(kuò)散的過程中都會(huì)經(jīng)歷沿軸突或樹突的傳導(dǎo)過程，所以此過程是病毒生命周期中不可或缺的一部分，同時(shí)也是影響病毒入侵神經(jīng)系統(tǒng)的關(guān)鍵因素。對(duì)嗜神經(jīng)性α皰疹病毒在神經(jīng)元內(nèi)傳導(dǎo)過程的研究不僅能深入地了解病毒，而且還能針對(duì)性地研發(fā)相應(yīng)的疫苗或靶向性治療藥物，同時(shí)還可利用其神經(jīng)嗜性將病毒作為解析神經(jīng)環(huán)路的有力工具。文中主要對(duì)α皰疹病毒在軸突中的傳導(dǎo)機(jī)制進(jìn)行了綜述，并提出病毒在軸突中傳導(dǎo)的研究發(fā)展方向和應(yīng)用價(jià)值，可為防控α皰疹病毒感染提供參考。

α皰疹病毒，神經(jīng)元，軸突，傳導(dǎo)

α皰疹病毒 (Alphaherpesviruses) 是哺乳動(dòng)物重要的嗜神經(jīng)性病原體。近年來隨著超高分辨率顯微技術(shù)的發(fā)展和熒光標(biāo)記技術(shù)的廣泛應(yīng)用，進(jìn)一步解析了α皰疹病毒粒子及其亞單位結(jié)構(gòu)在細(xì)胞內(nèi)的行為方式。對(duì)嗜神經(jīng)性α皰疹病毒的研究主要集中于病毒在神經(jīng)系統(tǒng)中的潛伏感染和病毒粒子在神經(jīng)元內(nèi)的運(yùn)行等方面。這些研究對(duì)于解析α皰疹病毒的生物學(xué)特性和致病機(jī)制都起著至關(guān)重要的作用。尤其體現(xiàn)在病毒粒子在軸突中的傳導(dǎo)情況，目前針對(duì)病毒在軸突中的傳導(dǎo)過程研發(fā)了安全高效的疫苗和靶向藥物。文中主要對(duì)α皰疹病毒在神經(jīng)元中定向傳導(dǎo)的研究進(jìn)展及其應(yīng)用進(jìn)行了闡述和剖析。

1 α皰疹病毒與神經(jīng)系統(tǒng)

1.1 α皰疹病毒的分類及特征

皰疹病毒科分為3個(gè)亞科：α、β和γ皰疹病毒亞科 (圖1)。α皰疹病毒為雙鏈DNA病毒，其病毒粒子大小為200–250 nm，由核酸、衣殼、基質(zhì)和囊膜組成[1]。部分α皰疹病毒的宿主譜非常廣，能夠在多種宿主中建立潛伏感染[2]。人類α皰疹病毒包括單純皰疹病毒1型 (Herpes simplex virus type 1，HSV-1) 和單純皰疹病毒2型 (Herpes simplex virus type 2，HSV-2) 及水痘-帶狀皰疹病毒 (Varicella-zoster virus，VZV)。除此之外，還包括動(dòng)物皰疹病毒如牛皰疹病毒1型 (Bovine herpesviruses type 1，BHV-1)、馬皰疹病毒Ⅰ型 (Equine herpesviruses type 1，EHV-1)、偽狂犬病病毒 (Pseudorabies virus，PRV)、馬立克氏病病毒 (Marek’s disease virus，MDV)和禽傳染性喉氣管炎病毒 (Avian infectious laryngotracheitis virus，AILTV) 等。目前已對(duì)多數(shù)具有神經(jīng)嗜性的α皰疹病毒進(jìn)行了深入的研究，包括HSV、VZV、PRV、BHV-1，但常作為模式病毒來研究的主要是PRV和HSV-1。這類病毒具有廣泛的組織嗜性和神經(jīng)侵襲力，病毒一旦進(jìn)入外周或中樞神經(jīng)系統(tǒng)，就會(huì)在神經(jīng)元間進(jìn)行跨突觸傳播，并對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)造成損傷或在感覺神經(jīng)元胞體中建立終身潛伏感染[3]。

1.2 神經(jīng)元的結(jié)構(gòu)

神經(jīng)元是高度分化的細(xì)胞，是神經(jīng)系統(tǒng)最基本的結(jié)構(gòu)和功能單位。神經(jīng)元通常由突起和胞體組成，突起分為軸突和樹突兩種。樹突短而分枝多，直接由胞體擴(kuò)張突出形成樹枝狀，其作用是接受其他神經(jīng)元軸突傳來的沖動(dòng)并傳給胞體。軸突長而分枝少，為粗細(xì)均勻的細(xì)長突起，常起于軸丘，其作用是接受外來刺激再由胞體傳出。軸突除分出側(cè)枝外，其末端形成樹枝樣的神經(jīng)末梢，分布于某些組織器官內(nèi)形成各種神經(jīng)末梢裝置。根據(jù)胞體發(fā)出突起的多少將神經(jīng)元分為3類：假單極神經(jīng)元、雙極神經(jīng)元和多極神經(jīng)元。α皰疹病毒粒子在軸突和樹突中的雙向傳導(dǎo)是病毒在宿主體內(nèi)和宿主間傳播必不可少的[4]。

圖1 α皰疹病毒的分類[4]

1.3 α皰疹病毒在神經(jīng)元之間的傳播

α皰疹病毒在神經(jīng)系統(tǒng)中的擴(kuò)散包括病毒在相鄰神經(jīng)元之間長距離的跨突觸傳播[5-6]。在入侵神經(jīng)系統(tǒng)之前，α皰疹病毒通常感染體細(xì)胞，如上皮細(xì)胞。病毒在這些細(xì)胞中復(fù)制后，通過入侵分布于組織中的神經(jīng)末梢而進(jìn)入神經(jīng)元。為了進(jìn)一步入侵宿主的神經(jīng)系統(tǒng)，病毒粒子進(jìn)入神經(jīng)末梢后逆向傳導(dǎo)進(jìn)入胞體，并在感覺神經(jīng)元胞體中建立終身的潛伏感染[7]。但在天然宿主中建立潛伏感染是基于入侵神經(jīng)系統(tǒng)的病毒量較少，若大量病毒粒子入侵神經(jīng)元，則會(huì)在胞體中進(jìn)行復(fù)制并進(jìn)一步傳導(dǎo)[8]。當(dāng)宿主處于應(yīng)激或某種特殊狀態(tài)時(shí)潛伏感染可被再激活，再激活后新合成的病毒粒子通過依賴于軸突分選的方式正向傳導(dǎo)至外周，通常可引起宿主上皮組織的病變 (圖2)[9]。例如HSV-1和HSV-2感染導(dǎo)致的復(fù)發(fā)性表皮病變(冷瘡)。病毒再激活后偶爾會(huì)傳播至中樞神經(jīng)系統(tǒng)，而這與α皰疹病毒感染導(dǎo)致的致死性后果具有很大關(guān)系，如PRV感染引起豬只的腦炎[10]。有報(bào)道稱，PRV引起豬只的死亡也與其誘導(dǎo)的系統(tǒng)性炎癥因子有關(guān)，其中包括神經(jīng)系統(tǒng)的炎癥因子風(fēng)暴[11]。雖然目前對(duì)α皰疹病毒粒子在神經(jīng)元中的定向傳導(dǎo)了解甚少，但它是α皰疹病毒完整生命周期的重要組成部分。

2 α皰疹病毒在神經(jīng)元中的復(fù)制周期

2.1 病毒粒子的吸附和入侵

α皰疹病毒入侵神經(jīng)系統(tǒng)是從感染外周神經(jīng)元開始的，而病毒感染宿主是由成熟的病毒粒子所發(fā)起的，其具有復(fù)雜的多層結(jié)構(gòu)，這些結(jié)構(gòu)在所有皰疹病毒中都是保守的[3]。HSV-1的感染過程，首先是糖蛋白gC和gB介導(dǎo)病毒粒子吸附于細(xì)胞表面的硫酸乙酰肝素蛋白聚糖受體，進(jìn)一步的入侵依賴于糖蛋白gD，它與細(xì)胞膜表面的受體結(jié)合，其中包括Nectin-1、皰疹病毒入侵因子(Herpesvirus entry mediator，HVEM) 和3--硫酸化乙酰肝素(3--sulfated heparan sulfate)[12-15]。對(duì)于PRV，gD介導(dǎo)病毒粒子穿過細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞中，但不參與細(xì)胞間的傳播和神經(jīng)侵襲[16]。而VZV gE在感染初期可能通過與胰島素降解酶(Insulin- degrading enzyme，IDE) 結(jié)合發(fā)揮與gD類似的功能，因此認(rèn)為IDE是VZV的一種受體[17]。病毒粒子結(jié)合后由糖蛋白gB、gH和gL介導(dǎo)病毒囊膜與細(xì)胞膜的融合[18-19]。

病毒粒子通過膜融合進(jìn)入細(xì)胞后會(huì)經(jīng)歷一個(gè)基質(zhì)蛋白解聚的過程，促使大部分病毒基質(zhì)蛋白進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)中。然而，某些特定的基質(zhì)蛋白(UL14、UL16、UL21、UL36、UL37、US3和ICP0) 在進(jìn)入細(xì)胞后仍附著在衣殼上 (圖3)[20]。這些衣殼基質(zhì)復(fù)合體會(huì)逆向沿軸突向胞體運(yùn)輸，最終進(jìn)入核周域與核孔對(duì)接。利用活細(xì)胞成像和電子顯微鏡技術(shù)發(fā)現(xiàn)3種蛋白(UL36、UL37和US3) 與胞內(nèi)的PRV衣殼粒子共轉(zhuǎn)運(yùn)[21]。最近的研究主要集中在基質(zhì)蛋白UL36和UL37在病毒入侵過程中的作用。UL36和UL37在感染期間具有多種功能，其中UL37在病毒粒子進(jìn)入神經(jīng)元后參與了病毒極早期基因的表達(dá)調(diào)控以及病毒在軸突中的逆向傳導(dǎo)[22]；UL36的功能包括運(yùn)輸衣殼至細(xì)胞核，使衣殼對(duì)接到核孔并釋放病毒基因組至核內(nèi)。

圖2 α皰疹病毒在軸突中傳導(dǎo)模式圖[9]

2.2 病毒基因組的復(fù)制

病毒在入侵神經(jīng)元后經(jīng)過基質(zhì)蛋白的解聚、軸突的逆向傳導(dǎo)、衣殼與核孔的對(duì)接最終將病毒基因組釋放入核。基因組進(jìn)入細(xì)胞核后，線性病毒基因組開始環(huán)化，環(huán)形DNA作為模板進(jìn)行病毒基因組的復(fù)制。最初為θ型復(fù)制，然后轉(zhuǎn)換為滾環(huán)復(fù)制，最終合成的線性基因組包裝進(jìn)入衣殼[1-2]。病毒基因組進(jìn)入細(xì)胞核還啟動(dòng)了高度時(shí)序性的病毒基因轉(zhuǎn)錄級(jí)聯(lián)反應(yīng)，這是皰疹病毒感染的特征。病毒基因可以被細(xì)分為3類依次表達(dá)的轉(zhuǎn)錄物：立即早期基因、早期基因和晚期基因。對(duì)于PRV來說，基因轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)是通過表達(dá)立即早期基因(HSV同源物)開始的，IE180是一種有效的轉(zhuǎn)錄激活因子，可誘導(dǎo)病毒早期基因的表 達(dá)[1]。早期基因主要編碼與核苷酸代謝有關(guān)的酶，而晚期基因編碼基因組包裝和組裝新合成病毒粒子所必需的結(jié)構(gòu)成分。

2.3 病毒粒子的組裝和釋放

新復(fù)制的病毒基因組在細(xì)胞核內(nèi)被包裝到衣殼中，這一過程涉及復(fù)制形成的多聚DNA被切割成單體線性基因組，隨后包裝進(jìn)入衣殼。包裝后，PRV核衣殼從細(xì)胞核中穿過核膜進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)。目前的研究表明，出核過程開始于核衣殼通過出芽的方式，跨過內(nèi)核膜進(jìn)入核周質(zhì)，這個(gè)過程使衣殼被內(nèi)核膜包裹，這是第一次獲得囊膜。隨后囊泡與外核膜融合將核衣殼釋放到細(xì)胞質(zhì)中。皰疹病毒核衣殼的出核依賴于病毒蛋白UL31、UL34和US3[23]。但最近的研究表明，其他的病毒基質(zhì)蛋白和核膜糖蛋白也與病毒粒子第一次獲得囊膜有關(guān)，但這些蛋白在出核過程中的作用仍不清楚。

圖3 α皰疹病毒早期入侵過程[4]

病毒粒子出核之后在細(xì)胞質(zhì)中經(jīng)歷組裝和成熟，在胞質(zhì)中它們獲得了基質(zhì)蛋白并出芽到囊泡中獲得最終的囊膜[24]。獲得基質(zhì)蛋白后的病毒粒子在運(yùn)輸囊泡中第二次獲得囊膜。盡管用于二次囊膜裝配的膜結(jié)構(gòu)其確切細(xì)胞起源仍然未知，但這些膜結(jié)構(gòu)包含一些病毒和細(xì)胞的蛋白，有利于病毒粒子的組裝和釋放。關(guān)于嗜神經(jīng)性α皰疹病毒在軸突正向傳導(dǎo)前病毒粒子的組裝狀態(tài)共有兩種模型。其中“匹配模型”認(rèn)為，在軸突分選和運(yùn)輸?shù)郊?xì)胞膜上釋放位點(diǎn)之前，病毒粒子在胞體中發(fā)生組裝和二次囊膜的裝配[25]。相反，“分離模型”認(rèn)為，裸衣殼(核衣殼與部分基質(zhì)蛋白組裝，但還未獲得囊膜) 和用于二次囊膜裝配的組分分別進(jìn)行軸突分選和運(yùn)輸，這些組分最終在釋放位點(diǎn)或靠近釋放位點(diǎn)處進(jìn)行組裝[26-27]。目前研究結(jié)果表明，PRV感染后的組裝過程符合匹配模型[28]。

病毒粒子的出胞是通過運(yùn)輸囊泡膜與細(xì)胞膜融合將病毒粒子釋放到細(xì)胞外。該過程的詳細(xì)分子機(jī)制尚不清楚，但可能是依賴于介導(dǎo)細(xì)胞囊泡胞吐的可溶性N-乙基馬來酰亞胺附著蛋白受體(Soluble N-ethylmaleimide attachment protein receptor，SNARE) 蛋白來完成的[29-30]。在神經(jīng)元中病毒的出胞過程有兩種方式，一種是病毒粒子經(jīng)軸突正向傳導(dǎo)出胞進(jìn)入外周組織，另一種是沿樹突或軸突正向傳導(dǎo)出胞，并通過跨突觸傳播進(jìn)入更高級(jí)的神經(jīng)元及入侵中樞神經(jīng)系統(tǒng)，通過軸突正向傳導(dǎo)進(jìn)入中樞神經(jīng)系統(tǒng)的神經(jīng)元一般為假單極神經(jīng)元。但關(guān)于樹突傳導(dǎo)的研究較少，大部分的研究都集中在軸突的傳導(dǎo)上，因?yàn)檩S突中的傳導(dǎo)在病毒入侵細(xì)胞和釋放病毒的過程中均起著重要的作用。

3 α皰疹病毒在神經(jīng)元中的定向傳導(dǎo)

3.1 細(xì)胞骨架的組成與功能

細(xì)胞骨架作為細(xì)胞結(jié)構(gòu)的重要組成部分，在細(xì)胞生命周期中起著重要的作用，它們不僅參與維持細(xì)胞形態(tài)還參與胞內(nèi)物質(zhì)的運(yùn)輸，其主要由微絲、微管和中間纖維組成。包括PRV和HSV在內(nèi)的許多α皰疹病毒依賴于病毒與宿主細(xì)胞骨架間的相互作用來進(jìn)行有效的傳播和轉(zhuǎn)運(yùn)。其中，微絲和微管骨架在α皰疹病毒感染過程中起著非常重要的作用。微絲主要由肌動(dòng)蛋白組成，其中肌動(dòng)蛋白絲(F肌動(dòng)蛋白) 在短距離物質(zhì)運(yùn)輸中起著至關(guān)重要的作用。蛋白絲由G肌動(dòng)蛋白(球形肌動(dòng)蛋白) 單體亞基組成，形成兩個(gè)相互纏繞的原絲。肌動(dòng)蛋白絲直徑在5–9 nm之間，通常在細(xì)胞內(nèi)形成三維網(wǎng)絡(luò)，但集中在細(xì)胞皮層。細(xì)胞中物質(zhì)的定向轉(zhuǎn)運(yùn)是由動(dòng)力蛋白中肌球蛋白超家族介導(dǎo)的，已證實(shí)動(dòng)力蛋白家族的幾個(gè)成員參與了蛋白在軸突中的靶向運(yùn)輸過程[31-32]。

微管與微絲細(xì)胞骨架相反，其主要促進(jìn)胞內(nèi)物質(zhì)的長距離運(yùn)輸。微管是由α微管蛋白和β微管蛋白異二聚體亞基組成的剛性圓柱體，它們通過頭尾結(jié)合形成原絲。通常13條這種原絲結(jié)合形成中空的微管，其外直徑為25 nm。由于微管絲具有固定結(jié)構(gòu)極性，所以微管具有高度動(dòng)態(tài)的“正”極(通常朝向細(xì)胞外圍) 以及相對(duì)穩(wěn)定的“負(fù)”極[朝向微管組織中心 (Microtubule organizing center，MTOC)][33]。這也是病毒在神經(jīng)元中傳導(dǎo)方向的標(biāo)識(shí)。在神經(jīng)元中，微管的排布是高度特異性的，軸突中的微管幾乎都只定向于軸突末端的正極，而樹突中包含混合極性的微管，這種組織模式維持了不同神經(jīng)元分室間的特性[32-33]。有兩類分子馬達(dá)蛋白介導(dǎo)了微管依賴性的定向運(yùn)輸，動(dòng)力蛋白馬達(dá)促進(jìn)逆向運(yùn)輸(朝向微管負(fù)極)，而驅(qū)動(dòng)蛋白家族馬達(dá)促進(jìn)順向運(yùn)輸(朝向微管正極)[35]。實(shí)質(zhì)上驅(qū)動(dòng)蛋白家族的分子馬達(dá)更加多樣化；哺乳動(dòng)物基因組可編碼多達(dá)45種不同的驅(qū)動(dòng)蛋白馬達(dá)，它們被分成14個(gè)不同的亞家族[36]。肌動(dòng)蛋白和微管細(xì)胞骨架通常協(xié)同作用以維持穩(wěn)定的細(xì)胞極性和促進(jìn)其動(dòng)力學(xué)的改變。

3.2 病毒入侵過程中的逆向傳導(dǎo)機(jī)制

為了進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)，入侵的病毒粒子必須經(jīng)過皮層肌動(dòng)蛋白層。雖然病毒粒子結(jié)合細(xì)胞膜表面受體誘發(fā)肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架的重塑，但這個(gè)過程對(duì)于病毒入侵神經(jīng)元的重要性目前尚不清楚[37-38]。用肌動(dòng)蛋白解聚劑細(xì)胞松弛素D對(duì)細(xì)胞進(jìn)行預(yù)處理不影響病毒入侵中的動(dòng)態(tài)變化。相比之下，用微管解聚劑諾可達(dá)唑 (Nocodazole) 或秋水仙素 (Colchicine) 預(yù)處理細(xì)胞，可終斷病毒衣殼粒子向細(xì)胞核的逆向轉(zhuǎn)運(yùn)，這表明在病毒入侵過程中微管細(xì)胞骨架起主要作用[22]。熒光標(biāo)記的PRV和HSV-1衣殼在培養(yǎng)神經(jīng)元軸突中的活細(xì)胞成像表明，逆向轉(zhuǎn)運(yùn)是一個(gè)以約1 μm/s的速率發(fā)生的穩(wěn)定過程，該速度與逆行性動(dòng)力蛋白的快速軸突運(yùn)輸速度一致[39]。此外，衣殼在軸突中的運(yùn)輸雖具有逆行傾向性但仍具有雙向性，即病毒在軸突中進(jìn)行轉(zhuǎn)運(yùn)時(shí)不是單純的逆向運(yùn)輸，而是同時(shí)具有短暫的正向運(yùn)輸過程，但正向運(yùn)輸在病毒通過軸突入侵細(xì)胞的過程中僅占極少部分，所以病毒通過軸突入侵胞體的過程具有逆行傾向性。同時(shí)這也表明驅(qū)動(dòng)蛋白可能也參與了該過程?，F(xiàn)已證實(shí)，存在于胞漿提取物中的驅(qū)動(dòng)蛋白-1和驅(qū)動(dòng)蛋白-2與病毒粒子入侵細(xì)胞后形成帶有部分基質(zhì)蛋白的衣殼粒子相互作用[40]。

目前對(duì)于病毒粒子在軸突中的逆向轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制仍處于探索階段，其詳細(xì)的機(jī)制尚不明確。在這個(gè)過程中，病毒利用宿主的動(dòng)力蛋白馬達(dá)來牽引其核衣殼沿著軸突進(jìn)行逆向轉(zhuǎn)運(yùn)，同時(shí)在軸突中的轉(zhuǎn)運(yùn)受到宿主蛋白的調(diào)控。據(jù)報(bào)道，一小部分病毒衣殼蛋白和基質(zhì)蛋白招募分子馬達(dá)來促進(jìn)逆向運(yùn)輸，其中包括UL36、UL37和VP26 (UL35)[41]。之前認(rèn)為，UL36為病毒直接招募動(dòng)力蛋白的主要蛋白，而UL37或VP26在該過程中并沒有起到關(guān)鍵性作用。因?yàn)閁L36突變的病毒或注射UL36的抗體均可阻斷衣殼粒子向細(xì)胞核的傳遞，與此相反，UL37或VP26的缺失或突變似乎不具有相同的特性[42]。除此之外，近期的研究發(fā)現(xiàn)，UL36在參與軸突傳導(dǎo)過程中招募動(dòng)力蛋白和動(dòng)力蛋白激活蛋白來促進(jìn)病毒粒子的運(yùn)輸，其在該過程中直接與動(dòng)力蛋白的亞基DIC (Dynein intermediate chain) 和動(dòng)力蛋白激活蛋白的亞基p150和p50相互作用，并且UL36中的S區(qū)域在該過程中起到關(guān)鍵作用[43]。最新的研究表明，在UL37蛋白R(shí)2區(qū)域中突變5個(gè)氨基酸后病毒也喪失了逆向傳導(dǎo)能力，導(dǎo)致病毒衣殼不能進(jìn)入胞體，同時(shí)在該過程中突變體病毒失去了逆行傾向性，在軸突中的正向傳導(dǎo)過程增加而逆向傳導(dǎo)過程減少，最終在軸突中的總位移幾乎為零[22]。該研究證明了UL37在逆向傳導(dǎo)過程中的重要性，并且可能是通過調(diào)控病毒衣殼粒子與驅(qū)動(dòng)蛋白的相互作用來發(fā)揮其功能。

病毒粒子在軸突中的逆向運(yùn)輸過程雖然主要由動(dòng)力蛋白介導(dǎo)完成，但該過程仍需要多種軸突蛋白的參與，其中包括LIS1、Anxa2和Prph等。已有研究結(jié)果證實(shí)，敲低LIS1、Anxa2和Prph能顯著降低PRV病毒粒子入侵神經(jīng)胞體的效率，并且LIS1和Anxa2都是在PRV入侵神經(jīng)細(xì)胞后經(jīng)歷軸突逆向傳導(dǎo)過程中新合成的[44]。這些軸突蛋白可能作為該過程的調(diào)控元件來影響PRV在軸突中逆向傳導(dǎo)，但這種作用方式究竟是PRV特異性的，還是宿主物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)所固有的調(diào)控機(jī)制，還有待進(jìn)一步的探究。除了宿主蛋白分子的調(diào)控外，還包括病毒蛋白的化學(xué)修飾對(duì)傳導(dǎo)過程的調(diào)控。已有研究表明，PRV UL36蛋白動(dòng)態(tài)泛素化修飾的過程顯著影響了病毒入侵神經(jīng)元，泛素化和去泛素化的動(dòng)態(tài)變化直接參與了PRV突破宿主屏障從體細(xì)胞入侵到神經(jīng)系統(tǒng)和在神經(jīng)元中沿軸突傳導(dǎo)的過程。其中，UL36的去泛素化協(xié)助病毒突破宿主屏障進(jìn)入神經(jīng)系統(tǒng)，而泛素化過程驅(qū)使了病毒粒子沿軸突轉(zhuǎn)運(yùn)的過程，且其泛素化關(guān)鍵位點(diǎn)為第442位賴氨酸[45]。雖然UL36上關(guān)鍵賴氨酸位點(diǎn)的動(dòng)態(tài)泛素化修飾顯著影響了病毒在軸突中的傳導(dǎo)過程，但泛素化和去泛素化的動(dòng)態(tài)過程是如何被調(diào)控的仍需要進(jìn)一步研究，其極有可能是通過對(duì)UL36上核定位信號(hào)中關(guān)鍵賴氨酸位點(diǎn)的泛素化來調(diào)控病毒沿軸突入核的過程。

目前對(duì)于α皰疹病毒逆向傳導(dǎo)機(jī)制的認(rèn)識(shí)僅限于病毒基質(zhì)蛋白UL36與動(dòng)力蛋白和動(dòng)力蛋白激活蛋白相互作用，促使病毒核衣殼沿著微管移動(dòng)至核周域。該過程中還涉及到UL37與宿主蛋白的相互作用及LIS1、Anxa2和Prph等蛋白與病毒粒子或動(dòng)力蛋白間的相互作用，但其中具體的機(jī)制和作用方式及調(diào)控模式都未知。雖然已有證據(jù)表明動(dòng)力蛋白和動(dòng)力蛋白激活蛋白與UL36相互作用，但仍不能排除其他蛋白也與動(dòng)力蛋白復(fù)合體相互作用的可能性。有研究表明，在缺失UL37之后病毒粒子在軸突中正向傳導(dǎo)的比例明顯變高，且總位移幾乎為零[22]。這暗示著UL37蛋白也可能與動(dòng)力蛋白復(fù)合體或驅(qū)動(dòng)蛋白存在相互作用，且作為病毒粒子沿微管移動(dòng)的“方向盤”或是動(dòng)力馬達(dá)分子間的轉(zhuǎn)換器。在缺失UL37后病毒傳導(dǎo)方向的變化呈隨機(jī)分布，最終正向傳導(dǎo)和逆向傳導(dǎo)的比例幾乎相等 (圖4)。

3.3 病毒的正向傳導(dǎo)和軸突分選機(jī)制

α皰疹病毒經(jīng)逆向傳導(dǎo)進(jìn)入神經(jīng)元胞體內(nèi)進(jìn)行復(fù)制后，將會(huì)經(jīng)歷在神經(jīng)元內(nèi)的正向傳導(dǎo)，而在感染神經(jīng)元期間的正向傳導(dǎo)取決于軸突分選和病毒粒子的長距離運(yùn)輸。病毒粒子的正向傳導(dǎo)對(duì)于潛伏感染再激活之后病毒再次感染受神經(jīng)支配的組織及在宿主之間的有效傳播是必不可少的[3]。α皰疹病毒的正向傳導(dǎo)過程主要分為兩個(gè)過程：首先是病毒粒子逆向傳導(dǎo)至胞體進(jìn)行復(fù)制，然后沿著軸突正向傳導(dǎo)回到受神經(jīng)支配的上皮組織。另一個(gè)過程則是病毒在胞體中復(fù)制后沿著軸突或樹突向更高級(jí)的神經(jīng)元正向傳導(dǎo)，最終通過跨突觸傳播到達(dá)更高級(jí)的神經(jīng)元。但這其中的具體分子機(jī)制仍然不清楚，還需要進(jìn)一步的探索。

目前認(rèn)為病毒粒子的軸突正向傳導(dǎo)主要由病毒相關(guān)蛋白與驅(qū)動(dòng)蛋白相互作用有關(guān)，驅(qū)動(dòng)蛋白攜帶病毒粒子沿微管移動(dòng)來完成正向傳導(dǎo)過程。三種病毒膜蛋白(gE、gI和US9)是其在體內(nèi)神經(jīng)回路中正向傳播所必需的蛋白[47]。單獨(dú)缺失、或基因的突變體在體外表型差異較大。基因缺失的突變體完全喪失了正向跨神經(jīng)元傳播的能力[48]。US9是一種小的(106個(gè)氨基酸) Ⅱ型尾錨定膜蛋白 (Type Ⅱ tail-anchored membrane protein)，其表達(dá)具有晚期動(dòng)力學(xué)效應(yīng)，且富含抗洗滌劑膜微結(jié)構(gòu)域，稱為脂筏[49]。在沒有US9的情況下，病毒粒子能在胞體中組裝但不能分選到軸突，但基因缺失的突變株具有神經(jīng)元特異性。研究表明，US9與KIF1A存在相互作用，而KIF1A是驅(qū)動(dòng)蛋白3 (Kinesin-3) 家族中的微管依賴性分子馬達(dá)[50]。KIF1A也是軸突分選和病毒粒子在軸突中病毒向釋放位點(diǎn)長距離運(yùn)輸所必需的。KIF1A已知的多種功能與其在介導(dǎo)病毒粒子軸突分選和轉(zhuǎn)運(yùn)中的作用一致[51]。雖然介導(dǎo)該過程的病毒蛋白和宿主蛋白仍不太清楚，但Kinesin-1是一個(gè)極佳的候選蛋白，因?yàn)樗谵D(zhuǎn)運(yùn)多種胞內(nèi)物質(zhì)方面發(fā)揮著重要的功能，且在幾乎所有哺乳動(dòng)物細(xì)胞類型中廣泛表達(dá)。盡管如此，仍然不能排除其他細(xì)胞蛋白也可能介導(dǎo)募集kinesin-1或其他分子馬達(dá)到囊膜化病毒粒子上。

圖4 軸突逆向傳導(dǎo)模型(改自O(shè)rkide等[46])

對(duì)于PRV和基因缺失的突變體雖然能夠進(jìn)行正向傳播，但與野生型相比其傳導(dǎo)能力降低[52]。gE/gI都是Ⅰ型膜蛋白，其在內(nèi)質(zhì)網(wǎng) (Endoplasmic reticulum，ER) 中形成異源二聚體，在離開內(nèi)質(zhì)網(wǎng)后gE/gI主要定位于高爾基體、細(xì)胞質(zhì)囊泡和細(xì)胞膜[53]。已有研究通過對(duì)細(xì)胞表面蛋白的生物素標(biāo)記或使用特異性抗體證明了gE/gI從細(xì)胞膜上進(jìn)行內(nèi)吞并積聚在較大的囊泡中[53]。對(duì)于PRV來說，gE/gI復(fù)合物在體內(nèi)的跨神經(jīng)元傳播中是非必需的。但缺失gE的細(xì)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域或全長蛋白則導(dǎo)致病毒在非神經(jīng)元細(xì)胞中形成的空斑變小，這表明其參與了在不同類型細(xì)胞間的傳播。相反，US9缺失突變體形成的空斑與野生型PRV形成的大小一致[54]?？傮w而言，這些結(jié)果意味著gE/gI和US9在調(diào)節(jié)正向跨神經(jīng)元的傳播中具有不同的功能。

目前對(duì)于軸突正向轉(zhuǎn)運(yùn)調(diào)控方面的研究相對(duì)匱乏，仍需不斷摸索。有研究表明，在病毒入侵神經(jīng)元后，軸突轉(zhuǎn)運(yùn)過程中UL36的442位賴氨酸泛素化使其正向傳導(dǎo)速度明顯降低，在傳導(dǎo)過程中靜止的時(shí)間也明顯增多，但這并沒有影響病毒入侵時(shí)逆向傳導(dǎo)的過程。反而是1 613位賴氨酸的泛素化雖不影響正向傳導(dǎo)的速度和靜止時(shí)間，但明顯縮短了逆向傳導(dǎo)的時(shí)間，這可能是1 613位氨基酸泛素化后加快了逆向傳導(dǎo)速度或增加了逆向運(yùn)輸在傳導(dǎo)過程所占的比例[45]。與此同時(shí)，最近的研究結(jié)果顯示PRV UL37 R2突變體在軸突逆向傳導(dǎo)過程中顯著增加了正向傳導(dǎo)所占的比例[22]。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果更加體現(xiàn)出α皰疹病毒在軸突中傳導(dǎo)過程的復(fù)雜性，并不是單一的正向傳導(dǎo)或是逆向傳導(dǎo)，而是一個(gè)精細(xì)的動(dòng)態(tài)化過程 (圖5)。

圖5 軸突正向傳導(dǎo)模型(改自O(shè)rkide等[46])

4 α皰疹病毒定向傳導(dǎo)研究的意義

4.1 神經(jīng)回路的解析

α皰疹病毒在解析神經(jīng)回路方面的應(yīng)用通常與病毒標(biāo)記示蹤技術(shù)相結(jié)合，主要探究外周神經(jīng)系統(tǒng)與中樞神經(jīng)系統(tǒng)間的聯(lián)系和中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)局部環(huán)路兩方面。此外，α皰疹病毒作為解析神經(jīng)回路的有力工具，優(yōu)勢是其能夠在神經(jīng)環(huán)路中復(fù)制，因此可以放大示蹤信號(hào)，增加檢測的靈敏度，同時(shí)使神經(jīng)環(huán)路更好地實(shí)現(xiàn)可視化。PRV通常作為神經(jīng)逆向傳導(dǎo)的示蹤工具揭示傳入神經(jīng)通路[55]。已有研究利用GFP與β半乳糖苷酶 (β-gal)標(biāo)記的PRV對(duì)中樞神經(jīng)中神經(jīng)元的功能進(jìn)行了探究。將GFP-PRV接種入星狀神經(jīng)節(jié)，同時(shí)將β-gal-PRV注射入初級(jí)運(yùn)動(dòng)皮層，通過對(duì)雙標(biāo)記神經(jīng)元的鑒定揭示了中樞神經(jīng)元可能支配的神經(jīng)通路[56]。而HSV-1通常作為順行的神經(jīng)環(huán)路示蹤工具揭示傳出神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)[57-58]。利用細(xì)菌人工染色體 (Bacterial artificial chromosome，BAC) 技術(shù)構(gòu)建了能夠同時(shí)表達(dá)4個(gè)GFP分子的HSV-1 H129株，高熒光強(qiáng)度使其能夠有效標(biāo)記神經(jīng)元并實(shí)現(xiàn)了其形態(tài)的高度可視化，包括對(duì)樹突、棘突和軸突纖維的可視化。將基因敲除后，可實(shí)現(xiàn)對(duì)單個(gè)突觸的示蹤，通過對(duì)神經(jīng)環(huán)路細(xì)節(jié)的可視化以及對(duì)神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的標(biāo)記，有助于提升對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的認(rèn)識(shí)，也為研究神經(jīng)退行性大腦疾病提供了參考和借鑒意義[59]。

4.2 靶向抗病毒藥物的研發(fā)

HSV-1是引起復(fù)發(fā)性口炎和水泡的重要病原，其對(duì)人類健康造成了嚴(yán)重的危害。病原廣泛存在于人體神經(jīng)系統(tǒng)中，因?yàn)樯倭坎《靖腥緳C(jī)體后能在神經(jīng)元胞體中建立終身的潛伏感染。在潛伏感染期間病毒僅表達(dá)極少量的基因且不進(jìn)行復(fù)制，這極大程度上避免了被宿主免疫系統(tǒng)清除，所以即使用疫苗來對(duì)抗該病毒也不能起到良好的控制效果。在這種情況下，靶向神經(jīng)的抗病毒藥物顯得尤為重要。潛伏感染的病毒被再激活后都會(huì)經(jīng)歷軸突或樹突正向運(yùn)輸回到上皮組織或進(jìn)入中樞神經(jīng)系統(tǒng)，引起病理損傷。目前對(duì)于HSV的靶向治療問題，多數(shù)科學(xué)家嘗試通過對(duì)HSV病毒基因的編輯或阻斷病毒在胞體內(nèi)的復(fù)制來解決。例如通過靈長類解旋酶抑制劑靶向抑制靈長類DNA解旋酶的活性從而阻斷病毒的復(fù)制，并探索了其在臨床上應(yīng)用的潛在價(jià)值[60]；再如通過HSV-1 m5核酸內(nèi)切酶識(shí)別HSV-1的基因，并對(duì)其進(jìn)行靶向的切割使病毒的關(guān)鍵基因被破壞而不能存活，從而獲得HSV-1靶向治療效應(yīng)[61]。與此同時(shí)也可通過靶向神經(jīng)的藥物來抑制病毒的傳導(dǎo)過程，從而阻止病毒的傳播。在該過程中可以通過抑制或敲低參與軸突運(yùn)輸病毒蛋白的表達(dá)來抑制病毒傳播的效率，從而對(duì)發(fā)病患者進(jìn)行有效的治療。雖然對(duì)于此類治療策略還未見報(bào)道，但仍然是HSV靶向治療藥物開發(fā)的一個(gè)方向。

4.3 疫苗研發(fā)

在PRV疫苗上應(yīng)用比較廣泛的疫苗株為經(jīng)典的Bartha-K61株，它是PRV強(qiáng)毒株(Becker株)缺失了、、基因的弱毒株。該毒株在神經(jīng)軸突上的傳導(dǎo)能力與Becker株具有明顯的差異，Becker株能在神經(jīng)軸突中雙向傳導(dǎo)，而Bartha-K61株僅能正向傳導(dǎo)[62]。gE蛋白是PRV從視網(wǎng)膜、嗅覺上皮細(xì)胞和三叉神經(jīng)節(jié)侵入中樞神經(jīng)組織所必需的，對(duì)PRV侵襲神經(jīng)和沿著神經(jīng)傳遞起著決定性的作用。其機(jī)制為gE與gI蛋白形成二聚體間接促進(jìn)或穩(wěn)定US9蛋白與驅(qū)動(dòng)蛋白分子KIF1A之間的相互作用，使病毒核衣殼及其他蛋白分選至神經(jīng)軸突中進(jìn)行正向傳導(dǎo)[63]。其中、和三個(gè)基因均是與病毒在神經(jīng)元中傳導(dǎo)相關(guān)的，這也說明了病毒在神經(jīng)元中的傳導(dǎo)過程影響了病毒的神經(jīng)毒力。雖然該疫苗株具有良好的免疫原性和保護(hù)效力，但仍能入侵神經(jīng)元胞體，因而具有潛在的風(fēng)險(xiǎn)。最近報(bào)道的缺失突變株是一個(gè)良好的疫苗候選株，單獨(dú)缺失的突變株喪失了在軸突中逆向傳導(dǎo)的能力，即病毒無法進(jìn)入胞體進(jìn)行復(fù)制和潛伏感染，極大地提高了其作為疫苗株的安全性，同時(shí)在該研究中測試了其免疫原性，結(jié)果顯示其具有良好的免疫原性和安全性[22]。由于HSV感染人多處于潛伏感染狀態(tài)，只有當(dāng)處于應(yīng)激等特定的環(huán)境下才會(huì)發(fā)病，而有效的HSV疫苗仍然處于研究階段，所以靶向治療性的藥物開發(fā)顯得更為重要。

5 總結(jié)及展望

α皰疹病毒感染神經(jīng)元后的定向運(yùn)輸對(duì)于病毒在宿主體內(nèi)和宿主之間的復(fù)制和傳播是必不可少的。病毒在神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)外的有效傳播取決于病毒粒子在軸突和樹突中的長距離運(yùn)輸，病毒粒子的運(yùn)輸像其他胞內(nèi)物質(zhì)的運(yùn)輸一樣需要微管依賴的馬達(dá)分子。逆向傳導(dǎo)依賴于入侵病毒的衣殼和基質(zhì)蛋白與動(dòng)力蛋白之間的相互作用。對(duì)于感染的正向傳導(dǎo)需要驅(qū)動(dòng)蛋白促進(jìn)病毒粒子向近膜端的釋放位點(diǎn)運(yùn)動(dòng)。病毒粒子蛋白質(zhì)的組成決定了募集和激活哪些馬達(dá)分子，從而決定了這些病毒粒子在感染細(xì)胞中被運(yùn)輸?shù)降淖罱K位點(diǎn)。

要了解病毒復(fù)合體如何利用宿主蛋白在其宿主體內(nèi)進(jìn)行有效的長距離運(yùn)輸還需深入研究，例如：病毒蛋白如何與動(dòng)力蛋白或驅(qū)動(dòng)蛋白相互作用來行使其功能；病毒粒子在軸突中的傳導(dǎo)如何受軸突中沿途表達(dá)的宿主蛋白分子來調(diào)控傳導(dǎo)過程；α皰疹病毒通過宿主細(xì)胞內(nèi)的馬達(dá)分子來進(jìn)行其在胞內(nèi)的運(yùn)輸是否具有特異性，抑或是軸突宿主蛋白對(duì)病毒傳導(dǎo)過程的調(diào)控是靶向病毒分子還是馬達(dá)分子等。這些都是目前亟待解決的問題，這對(duì)于認(rèn)識(shí)α皰疹病毒在神經(jīng)元軸突中的傳導(dǎo)和宿主內(nèi)在的物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制都十分重要。此外，未來的研究還將探索病毒感染對(duì)細(xì)胞組分排布、動(dòng)力學(xué)和內(nèi)穩(wěn)態(tài)改變的意義，這類研究對(duì)于理解α皰疹病毒在神經(jīng)系統(tǒng)中傳播的特性和發(fā)病機(jī)制都極為重要。

α皰疹病毒作為嗜神經(jīng)病毒中的一員，對(duì)其在神經(jīng)元或神經(jīng)系統(tǒng)中活動(dòng)的深入研究除了探究其生活史和發(fā)病機(jī)理外，還希望能從研究中去探尋其嗜神經(jīng)活動(dòng)的生物學(xué)意義，以期對(duì)嗜神經(jīng)病毒有一個(gè)更深層次的理解和認(rèn)識(shí)。之前關(guān)于α皰疹病毒嗜神經(jīng)的原因歸結(jié)為逃避宿主的免疫系統(tǒng)，以此更好地進(jìn)行病毒的復(fù)制和傳播，但這與病毒在宿主體內(nèi)建立潛伏感染似乎有些矛盾。α皰疹病毒在神經(jīng)元中的潛伏狀態(tài)似乎預(yù)示著這種病毒與宿主機(jī)體間“祥和”的相互作用，驅(qū)使著這兩者未來的共生關(guān)系而不是單純的寄生關(guān)系。α皰疹病毒背后蘊(yùn)含的寶藏還有待深入挖掘。

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Transport of alphaherpesviruses in neurons——axonal “shuttling”

Hansong Qi, Hongxia Wu, Hua-Ji Qiu, and Yuan Sun

State Key Laboratory of Veterinary Biotechnology, Harbin Veterinary Research Institute, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Harbin 150069, Heilongjiang, China

After a long-term co-evolution, alphaherpesviruses have established mutual adaptability with their hosts. Some alphaherpesviruses have typical neurotropic characteristics, which have received extensive attention and in-depth research. Neurotropic alphaherpesviruses can break through the host barrier to infect neurons and multiply in large numbers in the neuron cell body to complete further proliferation or establish latent infection in the cell body. Either in the process of infecting neurons or further spreading, alphaherpesviruses will undergo transmission along axons or dendrites, so this process is an integral part of the life cycle of the viruses, and is also a key factor for the viruses to spread in nervous system. Therefore, studies on transportation of alphaherpesvirusesin neurons will provide new insights of the viruses and promote the development of corresponding vaccines or targeted therapeutic pharmaceuticals. In addition, the neurotropism of alphaherpesviruses is conducive to the analysis of nerve circuits. Herein, the mechanisms of alphaherpesvirus transport in axons were reviewed, and the research direction and application of the transport of alphaherpesviruses in axons were put forward, which can provide reference for the prevention and control of alphaherpesviral infections.

alphaherpesviruses, neuron, axon, transport

January 26, 2019;

March 18, 2019

Supported by: National Natural Science Foundation of China (No. 31570149).

Yuan Sun. Tel/Fax: +86-451-51051709; E-mail: sunyuan@caas.cn

Hua-Ji Qiu. Tel/Fax: +86-451-51051708; E-mail: qiuhuaji@caas.cn

國家自然科學(xué)基金(No. 31570149) 資助。

2019-04-10

http://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1998.q.20190408.1418.002.html

祁寒松, 吳紅霞, 仇華吉, 等. α皰疹病毒的神經(jīng)傳導(dǎo)——軸突上的“穿梭”. 生物工程學(xué)報(bào), 2019, 35(8): 1361–1373.Qi HS, Wu HX, Qiu HJ, et al. Transport of alphaherpesviruses in neurons——axonal “shuttling”. Chin J Biotech, 2019, 35(8): 1361–1373.

(本文責(zé)編 郝麗芳)