高健，趙鼎

風疹病毒結(jié)構蛋白多免疫顯性區(qū)域診斷抗原的制備及其診斷效能評價

高健1,2,3，趙鼎1,2,3

1 鄭州大學附屬兒童醫(yī)院檢驗科，河南 鄭州 450000 2 鄭州兒童醫(yī)院檢驗科，河南 鄭州 450000 3 河南省兒童醫(yī)院檢驗科，河南 鄭州 450000

對串聯(lián)風疹病毒 (Rubella virus，RV) 3個結(jié)構蛋白6個免疫顯性區(qū)域進行制備 (命名為B103)，并將其應用于血清學診斷中。選取RV C aa 1–30 & aa 96–123、E2 aa 31–105和E1 aa 11–39 & aa 154–277 & aa 389–412等6個免疫顯性區(qū)域，將其串聯(lián)并基因合成；將此基因片段插入TRX和His標簽之間構建表達質(zhì)粒；蛋白B103在大腸桿菌BL21(DE3) 中誘導表達，并利用Streamline Chelating親和層析和DEAE陰離子交換層析純化目的蛋白，Sephadex G-25分子篩分析其折疊情況及均一性；利用免疫印跡技術對蛋白B103的抗原性進行鑒定，并建立RV-IgM抗體捕獲法ELISA檢測技術，初步評價此方法對陰陽血清樣本的鑒別能力。蛋白B103以可溶性形式表達，其表達量約占菌體總蛋白的18.57%，經(jīng)純化后蛋白B103濃度為3.026 mg/mL，純度為95.35%；免疫印跡實驗表明蛋白B103能與RV急性期血清發(fā)生反應；對40份RV急性期血清及40份RV陰性血清進行檢測發(fā)現(xiàn)可以很好地鑒別陰陽性血清標本；其靈敏度為92.50%，特異性為95.00%，陽性預測值為94.87%，陰性預測值為92.68%，符合率為93.75%，McNemer檢驗的結(jié)果提示與“金標準”診斷結(jié)果無差異，=0.900，提示兩種方法診斷結(jié)果一致性優(yōu)異。原核表達與層析純化可以獲取抗原性優(yōu)異的RV血清學診斷抗原，可以應用于RV早期診斷中。

免疫顯性區(qū)域，風疹病毒，原核表達，層析純化，血清學診斷

風疹病毒 (Rubella virus，RV) 是風疹或者稱為德國麻疹的病原體[1]。盡管大部分感染僅僅引起輕微的、自限型麻疹樣疾病，但孕婦尤其是妊娠前3個月的感染將會引起嚴重的胎兒畸形甚至流產(chǎn)[2]。因此建立一種簡單靈敏的RV檢測方法具有重大的實際意義[3]。皮疹期RV-IgM在風疹患者中陽性率僅為50%，但皮疹后5 d此抗體在大部分患者中能被檢測到[2]，一般感染后10 d IgM首先被檢測到，感染后4周達到峰值，急性感染后可持續(xù)超過7個月[4]。首次感染早期，IgG親和力很低，3個月內(nèi)才能逐漸成熟[4]。因此RV早期診斷血清學檢測通主要依賴于RV-IgM指標[5]。

RV有3個結(jié)構蛋白，衣殼蛋白 (Capsid protein，C)、2種包膜蛋白 (Envelop protein，E) E2和E1。C富含精氨酸和脯氨酸殘基，尤其在氨基末端，使其帶正凈電荷利于其在核衣殼形成過程中與基因組RNA發(fā)生反應[6-7]。E1和E2作為Ⅰ型膜蛋白，異二聚化后在病毒表面形成棘突復合體[8]。棘突復合體的主要功能為集合宿主細胞受體及介導病毒與宿主細胞膜融合[9]。E1擁有最主要的抗原決定簇，與血凝和中和表位相關[10]。針對E2和C蛋白的抗體也存在，但其表達水平和親和力都很低[11]。研究發(fā)現(xiàn)，E1蛋白上免疫顯性區(qū)域為aa 11–39、aa 154–179、aa 199–239、aa 226–277以及aa 389–412，衣殼蛋白為aa 1–30、aa 96–123，E2為aa 31–105[12]。有研究將不同表位進行串聯(lián)表達，應用于RV-IgM檢測發(fā)現(xiàn)診斷效能優(yōu)異[13-14]。文中將RV的3個結(jié)構蛋白的免疫顯性區(qū)域串聯(lián)表達在一個蛋白上，并借此構建RV-IgM捕獲法ELISA技術。

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑

DH5α、BL21(DE3)感受態(tài)細胞及TRX載體自備。Ⅰ和Ⅰ限制性內(nèi)切酶以及T4 DNA連接酶購自美國NEB公司。Chelating Sepharose Fast Flow、DEAE Sepharose Fast Flow、Sephadex G-25 Fine層析介質(zhì)購自美國GE公司。鼠抗人IgM二抗、鼠抗人IgM–HRP酶標物購自美國Thermo Fisher公司。商品化風疹病毒IgM診斷試劑盒為CFDA認證的診斷試劑盒。RV急性期陽性血清40份分別來自河南省兒童醫(yī)院 (26份)、鄭州大學附屬兒童醫(yī)院 (6份) 及鄭州兒童醫(yī)院(8份)，陰性血清40份由鄭州兒童醫(yī)院提供，陰陽性血清樣本都經(jīng)過臨床和實驗室確診，以風疹表現(xiàn) (出現(xiàn)紅色斑丘疹等) 及核酸檢測陽性為金標準。3個月內(nèi)接種風疹病毒疫苗婦女血清樣本14份來自河南省兒童醫(yī)院。

1.2 表達質(zhì)粒B103的構建

根據(jù)參考文獻[12,15-16]，將RV C aa 1–30 & aa 96–123、E2 aa 31–105及E1 aa 11–39 & aa 154–277 & aa 389–412等6個免疫顯性區(qū)域用GGGSGGGS連接臂進行串聯(lián)，然后根據(jù)基因序列二級結(jié)構及其編碼蛋白親疏水特性優(yōu)化基因并在5′端添加Ⅰ，3′端添加Ⅰ酶切位點，最后交由北京擎科新業(yè)生物技術有限公司合成 (將基因片段命名為B103F)。用Ⅰ和Ⅰ處理全基因合成產(chǎn)物將B103F雙酶切下來，切膠回收后連接到相同酶切處理的TRX表達載體上，轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細胞。次日挑取單克隆菌落培養(yǎng)后提取質(zhì)粒進行測序和雙酶切鑒定[17]。鑒定正確的質(zhì)粒命名為B103質(zhì)粒。

1.3 蛋白B103的制備

目的蛋白的表達與純化參考蘇秋東等發(fā)表的文獻[17]。將轉(zhuǎn)化B103質(zhì)粒的BL21(DE3)接種于含氨芐霉素 (50 μg/mL) 的LB培養(yǎng)基(10 g/L 蛋白胨，5 g/L 酵母提取液，10 g/L NaCl) 中，進行小量 (1.5 mL) 和大量 (3 L) 表達。離心收集表達菌 (4 000 r/min，8 min，10 ℃)。小量表達菌體經(jīng)處理后進行SDS-PAGE分析。大量表達菌體用緩沖液A (10 mmol/L Tris-HCl，0.5% Triton X-100，pH 8.0) 重懸后用超聲儀破碎 (功率250 W，超聲工作時間10 s，間歇時間20 s，共40個循環(huán))，離心 (12 000 r/min，8 min，10 ℃) 收集上清。將此上清補加終濃度為500 mmol/L的NaCl后上樣于用緩沖液B平衡 (10 mmol/L Tris-HCl，500 mmol/L NaCl，pH 8.0) 的Chelating Sepharose Fast Flow層析介質(zhì)中[17]。分別用60 mmol/L、300 mmol/L咪唑 (溶于緩沖液B中) 進行梯度洗脫。取300 mmol/L洗脫液于緩沖液C (10 mmol/L Tris-HCl，pH 8.0) 中進行透析去掉咪唑和NaCl成分。DEAE Sepharose Fast Flow層析介質(zhì)用緩沖液C平衡后上樣，分別用0、100、200、400 mmol/L NaCl (溶于緩沖液C中) 進行梯度洗脫并收集相應洗脫液。分別取樣進行SDS-PAGE分析，觀察目的蛋白的含量以及分布情況[17]。將SDS-PAGE分析評價優(yōu)異的洗脫液于PBS (137 mmol/L NaCl，2.7 mmol/L KCl，10 mmol/L Na2HPO4，2 mmol/L KH2PO4，pH 7.4)中透析，并于4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

取蛋白B103樣品進行凝膠過濾層析分析蛋白的折疊情況及均一性。分子篩介質(zhì)為Sephadex G-25 Fine，裝柱體積為20 mL，緩沖體系為20 mmol/L 磷酸鈉緩沖液，150 mmol/L NaCl，pH 7.0。實時監(jiān)測Time-280數(shù)據(jù)并以此繪圖。

1.4 蛋白B103的Western blotting分析

5 μL蛋白B103溶液進行SDS-PAGE (恒流40 mA，40 min)，而后轉(zhuǎn)膜至硝酸纖維素(NC) 膜上 (恒壓15 V，30 min)。室溫，用封閉液 (5%脫脂奶粉溶于PBST中[17]) 處理NC膜1 h。分別加入封閉液稀釋的RV急性期陽性血清 (1∶20)、RV陰性血清 (1∶20)，室溫孵育1 h后用PBST洗膜5次。一抗都為鼠抗人IgM-HRP酶標物 (1∶3 000)，室溫孵育1 h后洗膜，最后1次用PBS洗膜后DAB顯色，清水終止顯色。

1.5 蛋白B103-HRP酶標物的制備及其診斷效能評價

B103與HRP的偶聯(lián)參考HRP conjugation Kit說明書 (Abcam，UK)。簡言之，每10 μL蛋白B103中加入1 μL Modifier reagent后與HRP Mix充分混勻 (B103∶HRP=1∶1)。室溫避光靜置3 h后，每10 μL蛋白B103加入1 μL Quencher reagent并充分混勻后加入等倍體積預冷甘油于?20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

利用蛋白B103-HRP酶標物建立血清RV-IgM抗體捕獲法ELISA檢測試劑盒，并對“金標準”確診的血清樣本以及風疹疫苗接種婦女血清樣本進行檢測，評價試劑盒對陰陽性血清標本的鑒別能力[17]。簡言之，碳酸鹽緩沖液稀釋鼠抗人IgM二抗至終濃度25 ng/mL，100 μL/孔加入板條孔后37 ℃水浴孵育1 h，而后用封閉液37 ℃再孵育1 h，最后用PBST洗板5次，冷藏備用；室溫平衡板條后加待測血清 (1∶10)，37 ℃孵育1 h后洗滌；加入B103-HRP酶標物 (1∶5 000)，37 ℃孵育1 h后洗滌；加A/B液顯色，用酶標儀測定吸光度值 (450值)。

利用商品化RV-IgM檢測試劑盒同樣檢測這些血清樣本，具體操作步驟參見廠家說明書，最后用酶標儀測定吸光度值 (450值)。

1.6 統(tǒng)計學分析

運用GraphPad Prism 7.00軟件繪制2組血清IgM抗體水平散點圖并對兩組血清450值均數(shù)進行檢驗。根據(jù)經(jīng)驗選取陰性血清450值均值2.1倍作為臨界值，并以此計算新型檢測試劑盒的靈敏度和特異性。兩個樣本均數(shù)比較應用獨立樣本的檢驗；多個樣本兩兩比較，先應用方差分析 (ANOVA)，再應用Dunnett’s檢驗。用McNemer檢驗及一致性檢驗評價兩種檢測方法的一致性。實驗數(shù)據(jù)采用SPSS22.0軟件進行統(tǒng)計學分析，<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 原核表達層析純化可獲取高度均質(zhì)的蛋白B103

B103的構建如圖1所示，融合蛋白的氨基端為TRX標簽，緊跟著依次為C aa 1–30 & aa 96–123、E2 aa 31–105及E1 aa 11–39 & aa 154–277 & aa 389–412等6個免疫顯性區(qū)域，羧基端為His標簽，連接臂為GGGSGGGS，以及合適的酶切位點 (如Ⅰ、Ⅰ和Ⅰ等)。B103F基因片段大小約800 bp，構建好的表達質(zhì)粒經(jīng)測序、雙酶切鑒定及小量表達證實構建成功，命名為B103質(zhì)粒。

小量表達SDS-PAGE結(jié)果發(fā)現(xiàn)，目的蛋白分子量與預期相同，約為44 kDa (圖2A)，表明B103蛋白可以在大腸桿菌中有效表達。蛋白B103可溶性表達，占菌體總蛋白的18.57% (圖2B)。經(jīng)親和層析純化后蛋白B103主要存在于300 mmol/L咪唑洗脫液中 (圖2B)，純度為92.76%，濃度為3.286 mg/mL。經(jīng)過陰離子交換層析后，蛋白B103主要分布于200 mmol/L NaCl洗脫液中，純度為95.35%，濃度為3.026 mg/mL (圖2B)。

圖1 B103表達質(zhì)粒示意圖

圖2 蛋白B103小量表達 (A)、大量表達及純化結(jié)果(B)

經(jīng)過凝膠過濾層析發(fā)現(xiàn) (圖3)，純化后的蛋白B103存在于單一洗脫峰中，峰尖而且分布優(yōu)異表明其成分均一性優(yōu)異，折疊成熟，可以作為檢測抗原應用于ELISA檢測中。

2.2 蛋白B103可以與RV急性期血清發(fā)生特異性反應

利用免疫印跡技術，初步鑒定蛋白B103的抗原性。結(jié)果顯示，RV急性期血清作為一抗，鼠抗人IgM-HRP酶標物作為二抗，在蛋白分子量約44 kDa處有明顯條帶 (圖4A)；而RV陰性血清作為一抗，在NC膜上相應位置沒有出現(xiàn)條帶。并且無論是用RV相關陽性血清還是陰性血清，無蛋白B103表達菌都未見明顯條帶 (圖4B)，表明蛋白B103可以與RV陽性血清發(fā)生特異性反應。

圖3 蛋白B103凝膠過濾分析

2.3 基于蛋白B103的捕獲法ELISA技術可以很好地鑒別RV陰陽性血清標本

圖4 蛋白B103的Western blotting分析

圖5 蛋白B103在RV感染血清學診斷效果評價

商品化試劑盒檢測血清結(jié)果發(fā)現(xiàn)，陽性結(jié)果34份 (34/40)，陰性結(jié)果37份 (37/40)，根據(jù)金標準計算出靈敏度為85.00%，特異性為92.50%，陽性預測值為91.89%，陰性預測值為88.10%，符合率為88.75%。與新型試劑盒進行比較見表1，進行卡方檢驗發(fā)現(xiàn)，0.799，高度一致性，說明新型試劑盒與此商品化試劑盒之間的差異不存在統(tǒng)計學意義，但相比于“金標準”，究其上述指標，新型試劑盒的診斷性能要更好。

表1 新型試劑盒與商品化試劑盒比較

3 討論

僅依靠臨床癥狀診斷風疹疾病是不可靠的，因為多數(shù)患者癥狀輕微，甚至多達50%的感染是亞臨床的[2]。因此需要必要的實驗室檢測作為輔助。RV-IgG抗體可以持續(xù)存在于患者體內(nèi)，而IgM一般在感染后2個月逐漸消失，因此檢測IgM意義更大[18]。RV-IgM抗體檢測是公認的風疹實驗室檢測方法[11]。目前監(jiān)測RV抗體的診斷抗原大多為細胞培養(yǎng)抗原，其制備過程繁瑣耗時耗力耗資，且抗原成分不均一，試劑盒的靈敏度和特異性不理想，給臨床診斷帶來干擾[19]。文中獲取抗原性優(yōu)異的診斷抗原來構建捕獲法ELISA檢測血清RV-IgM抗體水平。

大部分RV抗原決定簇 (包括主要的抗原決定簇) 都定位在E1蛋白[10]，文中選取E1蛋白的3個免疫顯性表位aa 11–39、aa 154–277和aa 389–412，涵蓋了文獻所驗證的中和抗體表位[17,20]。E2的抗原位點由于與E1相互作用而被遮蓋，但有證據(jù)顯示E2包含獨立特異性抗原[21]，且中和抗體在體外也能中和病毒感染[22]。文中選取了E2蛋白的1個免疫顯性區(qū)域aa 31–105。C蛋白是病毒中含量最高的病毒抗原[23]，文中選取了C蛋白的2個免疫顯性區(qū)域aa 1–30 & aa 96–123。融合蛋白的氨基端還添加了TRX前導肽，一是為了增加目的蛋白的表達，二是為了蛋白的折疊[24]。實驗證實，蛋白B103以可溶性形式表達，且含量占菌體總蛋白的18.57% (圖2B)。羧基端His-tag的存在，使之可以利用親和層析有效純化[25]，進一步離子層析后，得到了濃度高純度高 (圖2B) 且構象高度均一 (圖3) 的目的蛋白。

相對于單一抗原在抗體識別上的差異和局限，重組多表位抗原在對抗原成分選擇上具有靈活廣泛性[8]。每個表位之間加入了連接臂GGGSGGGS，使表位之間可以靈活轉(zhuǎn)動，方便表位的展示及與抗體結(jié)合，大大提高了目的蛋白的抗原性[26]。Western blotting (圖4) 及ELISA分析 (圖5) 發(fā)現(xiàn)，蛋白B103抗原性優(yōu)異，可以在體外與相應抗體發(fā)生反應。多個表位的存在同時增加了識別抗體的數(shù)量，大大提高了檢測的靈敏度。

文中是對RV-IgM診斷抗原的初步研究，還存在著很多的不足：一是樣本量偏小，由于筆者所在醫(yī)院主要針對兒童人群，兒童人群中RV-IgM陽性率極低 (約占1.9%[27])，且主要分布于9月齡和10月齡嬰兒 (共約占61.7%[27])，因此陽性血清樣本的收集難度大，后續(xù)實驗將加大檢測樣本量；二是風疹IgM診斷常見的假陽性來自Rh因子，由于文中假陽性樣本量太小，后續(xù)實驗將查明此試劑盒對Rh因子陽性血清的檢測結(jié)果；三是針對疫苗接種后IgM的動力學分析的研究意義重大，但具體操作繁瑣困難，也將在后續(xù)實驗中實施；四是還未使用中國食品藥品檢定研究院提供的系列風疹血清作為監(jiān)測，后續(xù)實驗將引進系列血清盤，并制備相應的血清參考品。

蛋白B103集合了RV主要的免疫顯性區(qū)域，經(jīng)過原核表達和層析純化后以可溶性形式存在，以此構建的RV-IgM捕獲法ELISA可以很好地鑒別RV急性期陰陽性血清，為RV感染的早期診斷治療以及防控工作提供有效的血清學依據(jù)。

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Design of a chimeric antigen containing multiple immunodominant epitopes and its use in detection of IgM antibodies against Rubella virus

Jian Gao1,2,3, and Ding Zhao1,2,3

1 Department of Laboratory Medicine, Children’s Hospital Affiliated of Zhengzhou University,Zhengzhou 450000, Henan,China 2 Department of Laboratory Medicine, Zhengzhou Children’s Hospital,Zhengzhou 450000, Henan,China 3 Department of Laboratory Medicine Henan Children’s Hospital,Zhengzhou 450000, Henan,China

A chimeric antigen designated B103 containing six immunodominant regions derived from three structural proteins of Rubella virus (RV) was designed and its utility in serological diagnosis was assessed. Protein B103 is comprised of aa 1–30 & aa 96–123 of C protein, aa 31–105 of E2 protein, as well as aa 11–39, aa 154–277 & aa 389–412 of E1 protein. In addition, it contains thioredoxin (TRX) at the N-terminal and His tag at the C-terminal. B103 was expressed inBL21(DE3) and purified by Streamline Chelating affinity and DEAE anion exchange chromatography. Based on the antigenicity of B103 as verified by Western blotting analysis, we constructed and evaluated a novel capture ELISA for RV-IgM detection. B103 was expressed in a soluble form, accounting for 18.57% of the total bacterial proteins. After purification, the concentration and purity of protein B103 were 3.026 mg/mL and 95.35%, respectively. Western blotting analysis demonstrated that protein B103 could react with acute-phase serum of RV. By ELISA, 40 negative sera and 40 RV-acute phase sera were detected. The sensitivity, specificity, positive predictive value, negative predictive value and coincidence rate of the ELISA were 92.50%, 95.00%, 94.87%, 92.68% and 93.75%, respectively. The McNemer analysis suggested that there was no statistical difference between the ‘Gold standard’ and the novel ELISA with acoefficient of 0.900, indicating excellent consistency. B103 chimeric protein with excellent antigenicity obtained from prokaryotic expression followed by chromatography purification could prove useful for early diagnosis of RV infection.

immunodominant region, Rubella virus, prokaryotic expression, chromatography purification, serological diagnosis

January 15, 2019;

March 13, 2019

Ding Zhao. Tel/Fax: +86-371-85515776; E-mail: zhaoding_henan@126.com

2019-03-20

http://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1998.Q.20190319.1146.001.html

高健, 趙鼎. 風疹病毒結(jié)構蛋白多免疫顯性區(qū)域診斷抗原的制備及其診斷效能評價. 生物工程學報, 2019, 35(8): 1529–1536.Gao J, Zhao D. Design of a chimeric antigen containing multiple immunodominant epitopes and its use in detection of IgM antibodies against Rubella virus. Chin J Biotech, 2019, 35(8): 1529–1536.

(本文責編 陳宏宇)