王旭東,劉濤,薛闖,王子璇,孫旭東
基于近紅外光譜實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)乙醇發(fā)酵過(guò)程多組分參數(shù)
王旭東1,劉濤1,薛闖2,王子璇2,孫旭東1
1 大連理工大學(xué) 控制科學(xué)與工程學(xué)院,遼寧 大連 116024 2 大連理工大學(xué) 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院,遼寧 大連 116024
生物量、葡萄糖濃度和乙醇濃度是乙醇發(fā)酵過(guò)程的重要參數(shù),傳統(tǒng)的方法通常對(duì)發(fā)酵液取樣作離線測(cè)量,不僅需要采用多種儀器進(jìn)行測(cè)試分析,而且耗時(shí)耗力,成為實(shí)時(shí)過(guò)程調(diào)控和優(yōu)化的障礙。文中針對(duì)這些重要過(guò)程參數(shù)提出了一個(gè)基于近紅外光譜技術(shù)的原位實(shí)時(shí)檢測(cè)方法。通過(guò)采用浸入式近紅外光譜儀對(duì)發(fā)酵溶液進(jìn)行原位測(cè)量,基于多輸出最小二乘支持向量機(jī)回歸(MLS-SVR) 方法建立了利用近紅外光譜同時(shí)分析葡萄糖濃度、生物量和乙醇濃度的多輸出預(yù)測(cè)模型。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,該方法能實(shí)時(shí)準(zhǔn)確地檢測(cè)乙醇發(fā)酵過(guò)程中的葡萄糖濃度、生物量和乙醇濃度,而且相對(duì)于現(xiàn)有的偏最小二乘法(PLS) 分別對(duì)各組分建模和預(yù)測(cè),能明顯提高測(cè)量準(zhǔn)確性和可靠性。
乙醇發(fā)酵過(guò)程,近紅外光譜技術(shù),乙醇濃度,在線監(jiān)測(cè),多組分檢測(cè)
發(fā)酵工程廣泛用于生物質(zhì)轉(zhuǎn)化、食品、醫(yī)藥等生物制造行業(yè)[1-2]。發(fā)酵過(guò)程的參數(shù)主要分為化學(xué)參數(shù)(如pH值、溶解氧濃度等)、物理參數(shù)(如發(fā)酵溫度、攪拌轉(zhuǎn)速等) 和生物參數(shù)(基質(zhì)濃度、生物質(zhì)濃度和產(chǎn)物濃度等)。工程應(yīng)用中主要通過(guò)調(diào)控這些參數(shù)對(duì)發(fā)酵過(guò)程進(jìn)行控制和優(yōu)化。目前多數(shù)發(fā)酵過(guò)程主要對(duì)一些化學(xué)參數(shù)和物理參數(shù)可以實(shí)現(xiàn)在線測(cè)量,然而對(duì)于生物參數(shù)仍主要采用離線的測(cè)量技術(shù),耗時(shí)較長(zhǎng),難以進(jìn)行實(shí)時(shí)調(diào)控優(yōu)化[3-4]。
近紅外光譜技術(shù)具有對(duì)不同物質(zhì)組分的敏感性較好、非侵入檢測(cè)等優(yōu)點(diǎn),近年來(lái)越來(lái)越多地用于發(fā)酵過(guò)程不同組分和生物量的檢測(cè)[5-6]。目前,少量文獻(xiàn)介紹了利用近紅外光譜技術(shù)對(duì)發(fā)酵過(guò)程的生物參數(shù)進(jìn)行檢測(cè),但基本上是采用離線的方法對(duì)單一生物參數(shù)進(jìn)行檢測(cè),如文獻(xiàn)[7]基于近紅外光譜技術(shù)離線檢測(cè)乳酸鏈球菌發(fā)酵過(guò)程的還原糖濃度、乳酸鏈球菌效價(jià)、細(xì)胞濃度和pH。文獻(xiàn)[8]采用近紅外光譜儀對(duì)1,3-丙二醇發(fā)酵過(guò)程的生物量給出了一個(gè)實(shí)時(shí)測(cè)量方法,但不能同時(shí)對(duì)發(fā)酵底物和產(chǎn)物的含量進(jìn)行檢測(cè)。文獻(xiàn)[9]針對(duì)絲狀真菌發(fā)酵過(guò)程給出了基于近紅外光譜技術(shù)實(shí)時(shí)檢測(cè)生物量的方法,亦不能同時(shí)對(duì)其他組分進(jìn)行測(cè)量。
在乙醇發(fā)酵過(guò)程中,葡萄糖、生物量和乙醇分別為發(fā)酵過(guò)程的基質(zhì)、生物質(zhì)和產(chǎn)物?,F(xiàn)已發(fā)展了一些對(duì)這些參數(shù)的離線檢測(cè)方法[10-12],如采用葡萄糖氧化酶法和高效液相色譜法對(duì)葡萄糖濃度進(jìn)行測(cè)量,使用氣相色譜儀法和酶學(xué)方法等測(cè)量乙醇濃度,以及使用酶標(biāo)儀等測(cè)量光密度 (Optical density,) 表示生物量。葡萄糖在釀酒酵母菌的作用下發(fā)生糖酵解過(guò)程[13],一分子葡萄糖產(chǎn)生兩分子丙酮酸,然后丙酮酸轉(zhuǎn)化成乙醇。乙醇發(fā)酵過(guò)程為生長(zhǎng)偶聯(lián)型發(fā)酵過(guò)程,發(fā)酵過(guò)程中的基質(zhì)濃度和生物量變化都會(huì)對(duì)產(chǎn)物濃度帶來(lái)影響,因此需要對(duì)乙醇發(fā)酵過(guò)程中葡萄糖濃度、生物量和乙醇濃度建立聯(lián)合標(biāo)定同時(shí)進(jìn)行實(shí)時(shí)檢測(cè)。然而目前對(duì)乙醇發(fā)酵過(guò)程各組分同時(shí)在線測(cè)量的研究成果很少?,F(xiàn)有研究[7-9]主要采用偏最小二乘法 (PLS) 對(duì)發(fā)酵過(guò)程各種組分分別建立近紅外光譜標(biāo)定模型,以用于離線或?qū)崟r(shí)檢測(cè),未考慮采用近紅外光譜同時(shí)對(duì)多種組分進(jìn)行建模和預(yù)測(cè)。然而近期研究[14]指出,采用多輸出支持向量機(jī)回歸 (MLS-SVR) 方法對(duì)多變量輸出建立聯(lián)合標(biāo)定模型,能有效利用多變量輸出之間的相關(guān)性,達(dá)到更好的檢測(cè)可靠性和測(cè)量精度。
文中針對(duì)乙醇發(fā)酵過(guò)程,建立基于近紅外光譜儀對(duì)葡萄糖濃度、生物量及乙醇濃度原位在線測(cè)量的實(shí)驗(yàn)平臺(tái),基于MLS-SVR算法對(duì)乙醇發(fā)酵過(guò)程中生葡萄糖濃度、生物量以及乙醇濃度建立聯(lián)合標(biāo)定定量分析模型。通過(guò)實(shí)驗(yàn)測(cè)試,驗(yàn)證說(shuō)明針對(duì)近紅外光譜基于MLS-SVR建立的多變量標(biāo)定模型能夠有效地對(duì)乙醇發(fā)酵過(guò)程葡萄糖濃度、生物量以及乙醇濃度進(jìn)行實(shí)時(shí)測(cè)量。
為本文研究工作建立的乙醇發(fā)酵過(guò)程在線監(jiān)測(cè)實(shí)驗(yàn)平臺(tái)如圖1所示。其中發(fā)酵罐容量為2.5 L,罐中的溫度、pH值、攪拌槳轉(zhuǎn)速等由發(fā)酵控制設(shè)備控制。利用鉑金溫度計(jì)PT100測(cè)量發(fā)酵罐中溫度,通過(guò)加熱裝置及循環(huán)冷卻水進(jìn)行控溫。通過(guò)NaOH溶液調(diào)節(jié)發(fā)酵液酸堿度,由pH計(jì)實(shí)時(shí)檢測(cè)發(fā)酵罐內(nèi)pH值。通過(guò)電動(dòng)攪拌槳對(duì)發(fā)酵罐中溶液進(jìn)行均勻攪拌??紤]到在發(fā)酵初期和發(fā)酵末期中產(chǎn)氣量較少,直接使用尾氣分析儀測(cè)量尾氣可能會(huì)造成測(cè)量不準(zhǔn)確,因此如圖所示進(jìn)行循環(huán)通氣檢測(cè)發(fā)酵過(guò)程中O2和CO2濃度,以保證實(shí)時(shí)尾氣檢測(cè)的可靠性。將近紅外光譜分析儀的浸入式探頭采用酒精清潔除菌后插入發(fā)酵罐中,進(jìn)行實(shí)時(shí)采集發(fā)酵罐中溶液組分對(duì)近紅外光譜的吸光度,所有檢測(cè)信號(hào)由監(jiān)控電腦進(jìn)行實(shí)時(shí)顯示。
圖1 乙醇發(fā)酵過(guò)程在線監(jiān)測(cè)實(shí)驗(yàn)平臺(tái)
本研究采用ABB公司制造的TALYS-AS531傅里葉近紅外光譜分析儀以及配套的浸入式漫反射探頭采集近紅外光譜,并由Horizon MB軟件進(jìn)行光譜參數(shù)設(shè)置和數(shù)據(jù)預(yù)處理。光譜采集設(shè)置:測(cè)量波數(shù)范圍為4 000–12 000 cm–1,儀器分辨率為16 cm–1,光譜掃描次數(shù)為64次,檢測(cè)器增益為237.84,采集近紅外光譜以空氣為參考背景。發(fā)酵過(guò)程控制設(shè)備型號(hào)為 (KoBioTech KBT-2.5L)。采用液相色譜儀 (Waters) 測(cè)量發(fā)酵液葡萄糖濃度,采用氣相色譜儀 (Agilent 6890 Series GC System)測(cè)量發(fā)酵液的乙醇濃度,采用Multiskan Ascent 酶標(biāo)儀測(cè)量發(fā)酵液的生物量 (采用表示)。使用西安智琦公司制造的尾氣分析儀檢測(cè)發(fā)酵過(guò)程產(chǎn)生的尾氣,其中IRME-M紅外氣體分析儀可對(duì)CO2濃度進(jìn)行檢測(cè),電化學(xué)式氧分析儀可對(duì)O2濃度進(jìn)行檢測(cè)。通過(guò)監(jiān)控計(jì)算機(jī)監(jiān)視對(duì)發(fā)酵液實(shí)時(shí)采集的近紅外光譜數(shù)據(jù)。
本實(shí)驗(yàn)所用的菌種為釀酒酵母4126菌種,由大連理工大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院提供及保藏。發(fā)酵實(shí)驗(yàn)前需要對(duì)種子進(jìn)行培養(yǎng)。在種子活化培養(yǎng)階段,接種100 μL菌種到活化培養(yǎng)基中,然后將培養(yǎng)基放入搖床中,于30 ℃、150 r/min條件下進(jìn)行24 h的活化。將活化后的菌種接入種子培養(yǎng)基,同樣在上述搖床條件下進(jìn)行12 h的培養(yǎng)。種子培養(yǎng)基和活化培養(yǎng)基由葡萄糖 (20 g/L)、蛋白胨 (20 g/L) 和酵母菌提取粉 (10 g/L) 組成。
菌種經(jīng)過(guò)活化培養(yǎng)后,接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中進(jìn)行發(fā)酵實(shí)驗(yàn)。發(fā)酵開(kāi)始前使用空氣泵對(duì)發(fā)酵罐通入空氣,直到尾氣分析儀中顯示發(fā)酵罐中氣體組分濃度和空氣一致時(shí),停止空氣泵。發(fā)酵過(guò)程中發(fā)酵罐內(nèi)溫度設(shè)置為30 ℃,pH值維持在5,電動(dòng)攪拌槳的轉(zhuǎn)速設(shè)置為150 r/min,以保證發(fā)酵液為均相狀態(tài)。發(fā)酵培養(yǎng)基由葡萄糖 (60 g/L)、蛋白胨 (3 g/L) 和酵母菌提取粉 (5 g/L) 組成。
利用上述實(shí)驗(yàn)平臺(tái)采集5批發(fā)酵過(guò)程數(shù)據(jù)用于建立近紅外光譜標(biāo)定模型,每個(gè)取樣時(shí)間點(diǎn)采集3次光譜數(shù)據(jù)和3組樣本做離線檢測(cè)參考數(shù)據(jù)。按照3∶1的比例分為校正集和驗(yàn)證集,如表1所示,這里將離線檢測(cè)參考數(shù)據(jù)的最大值和最小值歸入校正集中,用于建立模型,以保證用于建立光譜標(biāo)定模型的參考數(shù)據(jù)范圍大于驗(yàn)證集,從而確保以模型內(nèi)插方式實(shí)現(xiàn)可靠的預(yù)測(cè)。
圖2示例給出了對(duì)其中一個(gè)批次乙醇發(fā)酵過(guò)程采集的近紅外光譜吸光度數(shù)據(jù)。由圖2可以看出,在波數(shù)段5 500–6 500 cm–1及8 000– 12 000 cm–1范圍內(nèi)的近紅外光譜相較于其他波段具有明顯的變化特征。需要說(shuō)明,生物反應(yīng)器的結(jié)構(gòu)差異 (例如攪拌槳和擋板的尺寸和方向等) 會(huì)改變培養(yǎng)基中的物理特性,從而會(huì)影響光譜吸收特性[15]。隨著發(fā)酵過(guò)程的進(jìn)行,生物量的增加不僅會(huì)影響發(fā)酵罐中各物質(zhì)成分含量,還會(huì)影響罐中顏色、密度和粘度等物理特性,當(dāng)然也會(huì)影響細(xì)胞的生理代謝特性。圖2中最明顯的變化為基線漂移,造成基線漂移是由于發(fā)酵過(guò)程的物理特性變化 (例如氣泡) 使光源散射。通氣、攪拌速度、溫度、pH等都會(huì)造成一定程度的光譜變化。為了消除環(huán)境條件變化對(duì)光譜測(cè)量帶來(lái)的擾動(dòng),文中采用了一階導(dǎo)數(shù)的光譜預(yù)處理方法,用于消除基線和背景漂移對(duì)光譜造成的影響,增強(qiáng)光譜的差異,從而提高檢測(cè)精度和可靠性[16-17]。
表1 校正集與驗(yàn)證集數(shù)據(jù)分析
圖2 乙醇發(fā)酵過(guò)程近紅外光譜圖
構(gòu)建如下形式的映射函數(shù):
取對(duì)應(yīng)的Lagrange函數(shù)為
由KKT條件[18]可建立下列線性方程組進(jìn)行求解:
根據(jù)上述方程組的求解,確定多輸出的擬合函數(shù)為
需要說(shuō)明,上式 (5) 中的核函數(shù)選取為常用的徑向基核 (RBF) 函數(shù)[19-20]:
為了評(píng)估近紅外光譜標(biāo)定模型對(duì)葡萄糖濃度、生物量和乙醇濃度的預(yù)測(cè)性能,這里采用預(yù)測(cè)集均方根誤差RMSEP (Root-mean-square error of prediction)、相關(guān)系數(shù)2(Correlation coefficient) 和范圍誤差比RPD (Ration of performance to standard deviate) 評(píng)價(jià)指標(biāo)[23-24],其計(jì)算公式分別為:
分別用多輸出MLS-SVR算法和單輸出PLS算法建立光譜標(biāo)定模型,然后使用已知的驗(yàn)證集數(shù)據(jù)對(duì)這兩種標(biāo)定模型進(jìn)行驗(yàn)證。圖3和圖4分別表示了這兩種標(biāo)定模型的預(yù)測(cè)效果,其中橫坐標(biāo)為離線儀器檢測(cè)的參考值,縱坐標(biāo)為基于近紅外光譜數(shù)據(jù)的預(yù)測(cè)值??梢钥闯?,多輸出MLS-SVR光譜標(biāo)定模型對(duì)葡萄糖濃度、生物量和乙醇濃度的預(yù)測(cè)比較準(zhǔn)確地?cái)M合驗(yàn)證集數(shù)據(jù),建模樣本和驗(yàn)證集數(shù)據(jù)在參考線附近分布比較緊致。相較之下,單輸出PLS光譜標(biāo)定模型的預(yù)測(cè)結(jié)果和校正集數(shù)據(jù)擬合較為松散。
兩種光譜標(biāo)定模型的預(yù)測(cè)性能評(píng)價(jià)如表2所示。可以看到,多輸出MLS-SVR光譜標(biāo)定模型對(duì)于葡萄糖濃度、生物量和乙醇濃度預(yù)測(cè)的RMSEP都較小,由此驗(yàn)證說(shuō)明聯(lián)合標(biāo)定模型的預(yù)測(cè)準(zhǔn)確性相對(duì)于PLS建立的獨(dú)立標(biāo)定模型有明顯提高。而且該聯(lián)合標(biāo)定模型對(duì)應(yīng)的2亦相對(duì)較大,說(shuō)明模型對(duì)于驗(yàn)證集的預(yù)測(cè)值同測(cè)量參考值相關(guān)性更高。尤其指出,對(duì)于生物量 () 預(yù)測(cè),聯(lián)合標(biāo)定模型對(duì)應(yīng)的RPD為18.593 3,相較于PLS獨(dú)立標(biāo)定模型有顯著提高,可用于過(guò)程實(shí)時(shí)控制和優(yōu)化。同時(shí),聯(lián)合標(biāo)定模型對(duì)于葡萄糖濃度和乙醇濃度的RPD亦都大于5,說(shuō)明由此建立的定量分析模型能可靠地用于質(zhì)量預(yù)測(cè)。
通過(guò)另外一個(gè)單獨(dú)批次的乙醇發(fā)酵實(shí)驗(yàn)對(duì)于上述聯(lián)合標(biāo)定模型進(jìn)行驗(yàn)證。采用PLS獨(dú)立標(biāo)定模型和MLS-SVR聯(lián)合標(biāo)定模型的監(jiān)測(cè)結(jié)果如圖5、6所示,其中線條數(shù)據(jù)為基于近紅外光譜采集數(shù)據(jù)實(shí)時(shí)預(yù)測(cè)結(jié)果,散點(diǎn)數(shù)據(jù)為采樣離線檢測(cè)參考值??梢钥闯?,聯(lián)合標(biāo)定模型的實(shí)時(shí)預(yù)測(cè)結(jié)果同離線檢測(cè)參考值更為貼近,然而PLS獨(dú)立標(biāo)定模型的預(yù)測(cè)結(jié)果相對(duì)偏差較大,進(jìn)一步驗(yàn)證了聯(lián)合標(biāo)定模型具有更好的預(yù)測(cè)準(zhǔn)確性。需要說(shuō)明,上述實(shí)驗(yàn)中基于近紅外光譜技術(shù)建立的在線監(jiān)測(cè)聯(lián)合標(biāo)定模型可以對(duì)葡萄糖濃度、生物量和乙醇濃度進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè),定時(shí)1 min給出一次測(cè)量結(jié)果,然而傳統(tǒng)的離線檢測(cè)方法需要取樣,并且使用多個(gè)儀器對(duì)3種生物參數(shù)分別進(jìn)行測(cè)量,耗時(shí)約30–60 min。
表2 PLS與MLS-SVR模型性能指標(biāo)
文中提出了一個(gè)基于近紅外光譜技術(shù)原位實(shí)時(shí)檢測(cè)乙醇發(fā)酵過(guò)程葡萄糖濃度、生物量以及乙醇濃度的方法。考慮到乙醇發(fā)酵過(guò)程為生長(zhǎng)偶聯(lián)型發(fā)酵過(guò)程,文中采用多變量輸出預(yù)測(cè)的MLS-SVR方法來(lái)建立上述關(guān)鍵過(guò)程參數(shù)的聯(lián)合標(biāo)定模型。通過(guò)對(duì)乙醇發(fā)酵過(guò)程葡萄糖濃度、生物量和乙醇濃度進(jìn)行在線監(jiān)測(cè)的實(shí)驗(yàn),并且與現(xiàn)有的PLS獨(dú)立標(biāo)定建模方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)對(duì)比,驗(yàn)證了聯(lián)合標(biāo)定模型相對(duì)于獨(dú)立標(biāo)定模型有更好的預(yù)測(cè)精度和可靠性,且相較于傳統(tǒng)的離線檢測(cè)方法具有更好的實(shí)時(shí)性。由于近紅外光譜對(duì)發(fā)酵過(guò)程中存在含氫基團(tuán)的物質(zhì) (如丙酮、丁酮、乙醇、蛋白、油脂等) 具有較好的敏感性,因此文中方法對(duì)這類(lèi)生物質(zhì)發(fā)酵過(guò)程在線檢測(cè)多組分參數(shù)具有很好的應(yīng)用優(yōu)勢(shì)。當(dāng)然,對(duì)于更為復(fù)雜的發(fā)酵過(guò)程,有待于進(jìn)一步探討如何基于近紅外光譜分析有效和準(zhǔn)確地同時(shí)檢測(cè)相近組分的含量及其實(shí)時(shí)變化率,以及發(fā)酵過(guò)程質(zhì)量預(yù)測(cè)和異常檢測(cè)。
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On-line monitoring of multiple component parameters during ethanol fermentation by near-infrared spectroscopy
Xudong Wang1, Tao Liu1, Chuang Xue2, Zixuan Wang2, and Xudong Sun1
1 School of Control Science and Engineering, Dalian University of Technology, Dalian 116024, Liaoning, China 2 School of Life Science and Biotechnology,Dalian University of Technology, Dalian 116024, Liaoning, China
The quantity of biomass, glucose concentration and ethanol concentration are important parameters in ethanol fermentation. Traditional methods are usually based on samples for off-line measurement, which not only requires multiple instruments for test and analysis but also consumes notable time and effort, and therefore is inconvenient for real-time process control and optimization. In this study, an-detection method based on the near-infrared (NIR) spectroscopy is proposed for measuring the above process parameters in real time. The-measurement is carried out by using an immersion type NIR spectroscopy. A multi-output prediction model for simultaneously estimating the quantity of glucose, biomass and ethanol is established based on a multi-output least-squares support vector regression algorithm. The experimental results show that the proposed method can precisely measure the quantity of glucose, biomass and ethanol during the ethanol fermentation process. Compared to the existing partial-least-squares method for modeling and prediction of individual components, the proposed method could evidently improve the measurement accuracy and reliability.
ethanol fermentation process, near-infrared (NIR) spectroscopy, ethanol concentration, on-line monitoring, detection of multiple components
January 6, 2019;
March 7, 2019
Supported by: National Natural Science Foundation of China (No. 61633006), the Fundamental Research Funds for the Central Universities of China (No.DUT18ZD201).
Tao Liu. Tel: +86-411-84706465; Fax: +86-411-84706706; E-mail: tliu@dlut.edu.cn
國(guó)家自然科學(xué)基金(No. 61633006),大連理工大學(xué)重點(diǎn)培育基金項(xiàng)目 (No. DUT18ZD201) 資助。
王旭東, 劉濤, 薛闖, 等. 基于近紅外光譜實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)乙醇發(fā)酵過(guò)程多組分參數(shù). 生物工程學(xué)報(bào), 2019, 35(8): 1491–1499.Wang XD, Liu T, Xue C, et al. On-line monitoring of multiple component parameters during ethanol fermentation by near-infraredspectroscopy. Chin J Biotech, 2019, 35(8): 1491–1499.
(本文責(zé)編 郝麗芳)