王曉華,陳鐵江,樓一波

王曉華,陳鐵江,樓一波,義烏市中心醫(yī)院急診科 浙江省義烏市322000

核心提要：抑制miR-181a-5p表達(dá)可以抑制雨蛙肽誘導(dǎo)的急性胰腺炎腺泡細(xì)胞損傷,其機(jī)制可能與靶向調(diào)控PIAS1有關(guān).可為急性胰腺炎診斷和治療提供新靶點(diǎn)和新思路.

0 引言

急性胰腺炎(acute pancreatitis,AP)是體內(nèi)胰酶被激活并致胰腺自身消化,繼以胰腺局部炎癥反應(yīng)為主要特征的疾病,其病情復(fù)雜多變,嚴(yán)重時(shí)可發(fā)生全身炎性反應(yīng)綜合征[1].研究其發(fā)病機(jī)制對(duì)于靶向特異性治療具有重要意義.多種miRNAs在AP中異常表達(dá),與AP的發(fā)生發(fā)展相關(guān),研究其在AP發(fā)病機(jī)制中的作用有助于為AP的診斷和治療提供新的思路和方法[2].研究發(fā)現(xiàn)miR-181a在腦缺血組織中過(guò)表達(dá),可以促進(jìn)腦組織細(xì)胞凋亡和炎癥的發(fā)生,加重神經(jīng)損傷的嚴(yán)重程度[3]; 且miR-181a能抑制胰腺癌細(xì)胞系的生長(zhǎng)、增加細(xì)胞凋亡、減少遷移[4],但miR-181a-5p在AP中的具體作用機(jī)制尚未清楚.信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活子(signal transducer and activators of transcription,STAT)活化抑制蛋白1(protein inhibitor of activated signal transducer and activators of transcription 1,PIAS1)是一種特異性抑制蛋白,調(diào)控腫瘤的發(fā)生發(fā)展,可作為腫瘤的靶向治療靶點(diǎn)[5].且研究發(fā)現(xiàn)PIAS1可抑制炎癥微環(huán)境誘導(dǎo)的胃癌上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化,抑制腫瘤侵襲與轉(zhuǎn)移[6].PIAS1可降低血?dú)馄琳贤ㄍ感?抑制炎性細(xì)胞外滲,進(jìn)而改善急性壞死性胰腺炎繼發(fā)急性肺損傷[7].本文旨在研究miR-181a-5p對(duì)雨蛙肽誘導(dǎo)的AP腺泡細(xì)胞損傷的影響及其與PIAS1的關(guān)系,以及其作用機(jī)制是否與PIAS1有關(guān).將為AP的診斷和治療提供新思路和新靶點(diǎn).

1 材料和方法

1.1 材料 胰腺腺泡細(xì)胞AR42J、MPC-38購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù).AP患者和健康者血清標(biāo)本取自當(dāng)?shù)蒯t(yī)院; 雨蛙素購(gòu)自美國(guó)Sigma公司; 胎牛血清、RPMI 1640培養(yǎng)基均購(gòu)自美國(guó)Gibco公司; RNA提取試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒和qPCR試劑盒購(gòu)自日本Takara公司; 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)檢測(cè)試劑盒購(gòu)自上海聯(lián)科生物技術(shù)有限公司; Western Blot試劑盒、BCA試劑盒、膜聯(lián)蛋白V-異硫氰酸熒光素(Annexin V-FITC)和碘化丙錠(PI)試劑盒購(gòu)自碧云天生物技術(shù)研究所; 雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒購(gòu)自美國(guó)Promega公司; LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑盒購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司; 流式細(xì)胞儀購(gòu)自賽默飛公司; 兔抗人Bax多克隆抗體、兔抗人Bcl-2多克隆抗體、兔抗人cleaved-caspase-3多克隆抗體、兔抗人PIAS1多克隆抗體、兔抗人GAPDH多克隆抗體、山羊抗兔IgG-辣根過(guò)氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)均購(gòu)自北京博奧森生物科技有限公司.

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及AP建模：大鼠胰腺腺泡AR42J、MPC-38細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)于含10% FBS的RPMI 1640培養(yǎng)基,置于37 ℃,含5%CO2恒溫箱培養(yǎng).每2-3 d傳代一次.造模前1 d取AR42J細(xì)胞接種于6孔板上,培養(yǎng)24 h后加入100 nm/L的雨蛙素,震蕩混勻后繼續(xù)培養(yǎng)6 h,收集備用.

1.2.2 細(xì)胞分組和轉(zhuǎn)染：取常規(guī)培養(yǎng)的大鼠胰腺腺泡AR42J、MPC-38細(xì)胞消化后接種于96孔板中,待細(xì)胞融合生長(zhǎng)至80%時(shí)進(jìn)行實(shí)驗(yàn),正常培養(yǎng)的大鼠胰腺腺泡AR42J、MPC-38細(xì)胞添加100 nmol/L雨蛙素培養(yǎng)6 h作為Caerulein組、不做任何處理的AR42J、MPC-38細(xì)胞作為對(duì)照(Con)組; 將miR-NC、miR-181a-5p、anti-miRNC和anti-miR-181a-5p質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)染至常規(guī)培養(yǎng)的大鼠胰腺腺泡AR42J、MPC-38細(xì)胞中,分別記為miR-NC組、miR-181a-5p組、anti-miR-NC組和anti-miR-181a-5p組.AP患者記為AP組,健康者記為Healthy組.

將anti-miR-NC、anti-miR-181a-5p、pcDNA、pcDNA-PIAS1轉(zhuǎn)染至大鼠胰腺腺泡AR42J、MPC-38細(xì)胞中,nti-miR-181a-5p分別與si-NC和si-PIAS1共轉(zhuǎn)染至大鼠胰腺腺泡AR42J、MPC-38細(xì)胞中,然后用100 nmol/L雨蛙素刺激培養(yǎng)6 h,分別記為Caerulein+anti-miR-NC組、Caerulein+anti-miR-181a-5p組、Caerulein+pcDNA組、Caerulein+pcDNA-PIAS1組、Caerulein+anti-miR-181a-5p+si-NC組、Caerulein+anti-miR-181a-5p+si-PIAS1組,轉(zhuǎn)染按照LipofectamineTM2000試劑盒進(jìn)行操作.

1.2.3 ELISA法檢測(cè)TNF-α和IL-6的表達(dá)：取雨蛙素處理后的各組細(xì)胞,離心取上清,按ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行檢測(cè).

1.2.4 qRT-PCR分析miR-181a-5p和PIAS1 mRNA表達(dá)水平：按照Trizol說(shuō)明書(shū)提取總RNA,用反轉(zhuǎn)錄試劑盒逆轉(zhuǎn)錄成cDNA,按照AceQ qPCR SYBR?Green Mix說(shuō)明書(shū)進(jìn)行qRT-PCR方法擴(kuò)增.循環(huán)條件為95 ℃ 30 s,60 ℃30 s; 72 ℃ 30 s,共40個(gè)循環(huán); 60 ℃延長(zhǎng)5 min.相對(duì)表達(dá)量采用2-△△Ct法計(jì)算.

1.2.5 Western Blot檢測(cè)蛋白表達(dá)：提取各組細(xì)胞蛋白,用BCA蛋白定量試劑盒進(jìn)行蛋白定量.各組蛋白上樣量60 μg,SDS-PAGE后,經(jīng)電轉(zhuǎn)將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上.用5%脫脂牛奶室溫封閉90 min,分別加入相應(yīng)的一抗：兔抗人Bax多克隆抗體、兔抗人Bcl-2多克隆抗體、兔抗人cleaved-caspase-3多克隆抗體、兔抗人PIAS1多克隆抗體、兔抗人GAPDH多克隆抗體,4 ℃孵育過(guò)夜,PBS洗滌3次,每次5 min; 再加入相對(duì)應(yīng)的二抗HRP,室溫孵育2 h,PBS洗滌3次,每次10 min,后在暗室中曝光顯影,再浸入定影,最后洗去殘液晾干,將膠片用Quantity One凝膠分析軟件處理,測(cè)定各組蛋白條帶的吸光度,以目的條帶和GAPDH條帶的比值作為蛋白表達(dá)水平.

1.2.6 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡：用不含EDTA的胰酶消化細(xì)胞,離心收集各組細(xì)胞,PBS漂洗2次,加結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞.依據(jù)試劑盒說(shuō)明書(shū),先加入5 μL的Annexin V-FITC混勻后再加入5 μL的PI避光孵育15 min.流式細(xì)胞儀檢測(cè)激發(fā)波長(zhǎng)488 nm和發(fā)射波長(zhǎng)530 nm處的熒光強(qiáng)度,實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次.

1.2.7 熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)miR-181a-5p對(duì)PIAS1的靶向調(diào)控：TargetScan數(shù)據(jù)庫(kù)顯示PIAS1 3′UTR區(qū)域有miR-181a-5p結(jié)合位點(diǎn).構(gòu)建野生型和突變型基因靶點(diǎn)PIAS1的3′UTR-熒光素酶表達(dá)載體(WT-PIAS1和MUT-PIAS1),取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期大鼠胰腺腺泡AR42J、MPC-38細(xì)胞接種于24孔板(5×104個(gè)/孔),待細(xì)胞生長(zhǎng)至80%融合時(shí),用LipofectamineTM2000將WT-PIAS1和MUT-PIAS1組細(xì)胞分別轉(zhuǎn)染miR-NC和miR-181a-5p.依據(jù)說(shuō)明書(shū)要求,使用熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)儀進(jìn)行雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)測(cè)定.實(shí)驗(yàn)結(jié)果以熒光素酶活性和Renilla活性的比值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析.實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次.

統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 20.00進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析.計(jì)量資料以mean±SD表示,兩組比較行t檢驗(yàn),多組間比較采用單因素方差分析,以P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義.

2 結(jié)果

2.1 miR-181a-5p和PIAS1在AP患者血清及雨蛙肽誘導(dǎo)的胰腺腺泡細(xì)胞中的表達(dá) qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果(圖1A,B)顯示,與健康組相比,AP患者血清中miR-181a-5p的表達(dá)水平顯著升高,PIAS1 mRNA的表達(dá)水平顯著降低; 與對(duì)照組相比,雨蛙肽處理的AR42J細(xì)胞和MPC-38細(xì)胞中miR-181a-5p的表達(dá)水平顯著升高,PIAS1 mRNA的表達(dá)水平顯著下降(P＜0.05).Western Blot檢測(cè)結(jié)果(圖1C,D)顯示,與健康組相比,AP患者血清中PIAS1蛋白的表達(dá)水平顯著降低; 與對(duì)照組相比,雨蛙肽處理后AR42J細(xì)胞和MPC-38細(xì)胞中PIAS1蛋白的表達(dá)水平顯著下降(P＜0.05).可見(jiàn),在雨蛙肽處理的AR42J和MPC-38細(xì)胞以及AP患者血清中miR-181a-5p高表達(dá),PIAS1低表達(dá).

2.2 抑制miR-181a-5p表達(dá)對(duì)雨蛙肽誘導(dǎo)的AR42J和MPC-83細(xì)胞炎癥因子表達(dá)的影響 qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果(圖2A)顯示,與Con組相比,Caerulein組AR42J和MPC-83細(xì)胞中miR-181a-5p的表達(dá)水平顯著升高,與Caerulein+anti-miR-NC組相比,Caerulein+anti-miR-181a-5p組的miR-181a-5p表達(dá)水平顯著下降(P＜0.05).ELISA法檢測(cè)結(jié)果(圖2B,C)顯示,與Con組相比,Caerulein組AR42J和MPC-83細(xì)胞中IL-6和TNF-α的含量顯著升高;與Caerulein+anti-miR-NC組相比,Caerulein+anti-miR-181a-5p組IL-6和TNF-α的含量顯著降低(P＜0.05).可見(jiàn),抑制miR-181a-5p表達(dá)抑制雨蛙肽誘導(dǎo)的AR42J和MPC-83細(xì)胞炎癥因子的表達(dá).

2.3 抑制miR-181a-5p表達(dá)對(duì)雨蛙肽誘導(dǎo)的AR42J和MPC-83細(xì)胞凋亡的影響 流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果(圖3A,B)顯示,與Con組相比,Caerulein組AR42J和MPC-83細(xì)胞凋亡率顯著升高,與Caerulein+anti-miR-NC組相比,Caerulein+anti-miR-181a-5p組AR42J和MPC-83細(xì)胞凋亡率顯著降低(P＜0.05).Western Blot檢測(cè)結(jié)果(圖3C,D,E)顯示,與Con組相比,Caerulein組AR42J和MPC-83細(xì)胞中Bax、Caspase-3蛋白的表達(dá)水平顯著升高,Bcl-2蛋白的表達(dá)水平顯著降低; 與Caerulein+anti-miR-NC組相比,Caerulein+anti-miR-181a-5p組Bax、Caspase-3蛋白的表達(dá)水平顯著降低,Bcl-2蛋白的表達(dá)水平顯著升高(P＜0.05).可見(jiàn),抑制miR-181a-5p表達(dá)抑制雨蛙肽誘導(dǎo)的AR42J和MPC-83細(xì)胞凋亡.

2.4 PIAS1過(guò)表達(dá)對(duì)雨蛙肽誘導(dǎo)的AR42J和MPC-83細(xì)胞損傷的影響 Western Blot檢測(cè)結(jié)果(圖4A,B,F,G,H)顯示,與Con組相比,Caerulein組AR42J和MPC-83細(xì)胞中Bax、Caspase-3蛋白的表達(dá)水平顯著升高,PIAS1、Bcl-2蛋白的表達(dá)水平顯著降低; 與Caerulein+pcDNA組相比,Caerulein+pcDNA-PIAS1組Bax、Caspase-3蛋白的表達(dá)水平顯著降低,PIAS1、Bcl-2蛋白的表達(dá)水平顯著升高(P＜0.05).ELISA法檢測(cè)結(jié)果(圖4C,D)顯示,與Con組相比,Caerulein組AR42J和MPC-83細(xì)胞中IL-6和TNF-α的含量顯著升高; 與Caerulein+pcDNA組相比,Caerulein+pcDNA-PIAS1組IL-6和TNF-α的含量顯著降低(P＜0.05).流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果(圖4E)顯示,與Con組相比,Caerulein組AR42J和MPC-83細(xì)胞凋亡率顯著升高,與Caerulein+pcDNA組相比,Caerulein+pcDNA-PIAS1組AR42J和MPC-83細(xì)胞凋亡率顯著降低(P＜0.05).可見(jiàn),PIAS1過(guò)表達(dá)抑制雨蛙肽誘導(dǎo)的AR42J和MPC-83細(xì)胞凋亡,抑制細(xì)胞炎癥因子IL-6和TNF-α的表達(dá).

圖1 miR-181a-5p和PIAS1在急性胰腺炎患者血清及雨蛙肽誘導(dǎo)的胰腺腺泡細(xì)胞中的表達(dá).A：miR-181a-5p和PIAS1在急性胰腺炎患者和健康對(duì)照組血清中的表達(dá); B：PIAS1 mRNA在急性胰腺炎患者和健康對(duì)照組血清中的表達(dá); C、D：PIAS1蛋白在急性胰腺炎患者和健康對(duì)照組血清中的表達(dá); E：miR-181a-5p在雨蛙肽誘導(dǎo)的AR42J細(xì)胞中的表達(dá); F：PIAS1 mRNA在雨蛙肽誘導(dǎo)的AR42J細(xì)胞中的表達(dá); G、H：PIAS1蛋白在雨蛙肽誘導(dǎo)的AR42J細(xì)胞中的表達(dá).aP＜0.05,vs Healthy組; cP＜0.05,vs Con組.

2.5 miR-181a-5p靶向調(diào)控PIAS1的表達(dá) 通過(guò)TargetScan數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)到PIAS1與miR-181a-5p存在結(jié)合位點(diǎn)(圖5A).熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)實(shí)驗(yàn)結(jié)果(圖5B,C)顯示,轉(zhuǎn)染野生型PIAS1基因表達(dá)載體WT-PIAS1后,相較于miR-NC組,miR-181a-5p組AR42J和MPC-83細(xì)胞的熒光素酶活性顯著降低(P＜0.05); 而轉(zhuǎn)染突變型PIAS1基因表達(dá)載體MUT-PIAS1后,相較于miR-NC組,miR-181a-5p組AR42J和MPC-83細(xì)胞的熒光素酶活性差異不顯著.Western Blot檢測(cè)結(jié)果(圖5D,E)顯示,相較于miR-NC組,miR-181a-5p組AR42J和MPC-83細(xì)胞中PIAS1蛋白的表達(dá)水平顯著降低; 而相較于anti-miR-NC組,anti-miR-181a-5p組AR42J和MPC-83細(xì)胞中PIAS1蛋白的表達(dá)水平顯著升高(P＜0.05).可見(jiàn),miR-181a-5p可靶向調(diào)控PIAS1的表達(dá).

2.6 抑制PIAS1表達(dá)逆轉(zhuǎn)了抑制miR-181a-5p表達(dá)對(duì)雨蛙肽誘導(dǎo)的AR42J和MPC-83細(xì)胞損傷的影響 Western Blot檢測(cè)結(jié)果(圖6A,B,F,G,H)顯示,與Caerulein+antimiR-NC組相比,Caerulein+anti-miR-181a-5p組AR42J和MPC-83細(xì)胞中Bax、cleaved-caspase-3蛋白的表達(dá)水平顯著降低,PIAS1、Bcl-2蛋白的表達(dá)水平顯著升高; 與Caerulein+anti-miR-181a-5p+si-NC組相比,Caerulein+anti-miR-181a-5p+si-PIAS1組Bax、cleavedcaspase-3蛋白的表達(dá)水平顯著升高,PIAS1、Bcl-2蛋白的表達(dá)水平顯著降低(P＜0.05).ELISA法檢測(cè)結(jié)果(圖6C,D)顯示,與Caerulein+anti-miR-NC組相比,Caerulein+antimiR-181a-5p組AR42J和MPC-83細(xì)胞中IL-6和TNF-α的含量顯著降低; 與Caerulein+anti-miR-181a-5p+si-NC組相比,Caerulein+anti-miR-181a-5p+si-PIAS1組IL-6和TNF-α的含量顯著升高(P＜0.05).流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果(圖6E)顯示,與Caerulein+anti-miR-NC組相比,Caerulein+anti-miR-181a-5p組AR42J和MPC-83細(xì)胞凋亡率顯著降低,與Caerulein+anti-miR-181a-5p+si-NC組相比,Caerulein+anti-miR-181a-5p+si-PIAS1組AR42J和MPC-83細(xì)胞凋亡率顯著升高(P＜0.05).可見(jiàn),抑制PIAS1表達(dá)逆轉(zhuǎn)了抑制miR-181a-5p表達(dá)對(duì)雨蛙肽誘導(dǎo)的AR42J和MPC-83細(xì)胞凋亡.

圖3 抑制miR-181a-5p表達(dá)對(duì)雨蛙肽誘導(dǎo)的AR42J和MPC-83細(xì)胞凋亡的影響.A、B：抑制miR-181a-5p表達(dá)對(duì)雨蛙肽誘導(dǎo)的AR42J和MPC-83細(xì)胞凋亡的影響; C：免疫印跡圖; D：抑制miR-181a-5p表達(dá)對(duì)雨蛙肽誘導(dǎo)的AR42J細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響; E：抑制miR-181a-5p表達(dá)對(duì)雨蛙肽誘導(dǎo)的MPC-83細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響.aP＜0.05,vs Con組; cP＜0.05,vs Caerulein+anti-miR-NC組.

圖4 PIAS1過(guò)表達(dá)對(duì)雨蛙肽誘導(dǎo)的AR42J和MPC-83細(xì)胞的影響.A、B：PIAS1蛋白表達(dá); C：PIAS1過(guò)表達(dá)對(duì)雨蛙肽誘導(dǎo)的AR42J和MPC-83細(xì)胞IL-6表達(dá)的影響; D：PIAS1過(guò)表達(dá)對(duì)雨蛙肽誘導(dǎo)的AR42J和MPC-83細(xì)胞TNF-α表達(dá)的影響; E：PIAS1過(guò)表達(dá)對(duì)雨蛙肽誘導(dǎo)的AR42J和MPC-83細(xì)胞凋亡的影響; F：免疫印跡圖; G：PIAS1過(guò)表達(dá)對(duì)雨蛙肽誘導(dǎo)的AR42J細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響; H：PIAS1過(guò)表達(dá)對(duì)雨蛙肽誘導(dǎo)的MPC-83細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響.aP＜0.05,vs Con組; cP＜0.05,vs Caerulein+pcDNA組.

圖5 miR-181a-5p靶向調(diào)控PIAS1的表達(dá).A：PIAS1的3’UTR中含有與miR-181a-5p互補(bǔ)的核苷酸序列; B、C：雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn); D、E：miR-181a-5p調(diào)控PIAS1蛋白的表達(dá).aP＜0.05,vs miR-NC組; cP＜0.05,vs anti-miR-NC組.

圖6 抑制PIAS1表達(dá)逆轉(zhuǎn)了抑制miR-181a-5p表達(dá)對(duì)雨蛙肽誘導(dǎo)的AR42J和MPC-83細(xì)胞損傷的影響.A、B：PIAS1蛋白表達(dá); C：抑制PIAS1表達(dá)逆轉(zhuǎn)了抑制miR-181a-5p表達(dá)對(duì)雨蛙肽誘導(dǎo)的AR42J和MPC-83細(xì)胞IL-6表達(dá)的影響; D：抑制PIAS1表達(dá)逆轉(zhuǎn)了抑制miR-181a-5p表達(dá)對(duì)雨蛙肽誘導(dǎo)的AR42J和MPC-83細(xì)胞TNF-α表達(dá)的影響; E：抑制PIAS1表達(dá)逆轉(zhuǎn)了抑制miR-181a-5p表達(dá)對(duì)雨蛙肽誘導(dǎo)的AR42J和MPC-83細(xì)胞凋亡的影響; F：免疫印跡圖; G：抑制PIAS1表達(dá)逆轉(zhuǎn)了抑制miR-181a-5p表達(dá)對(duì)雨蛙肽誘導(dǎo)的AR42J細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響; H：抑制PIAS1表達(dá)逆轉(zhuǎn)了抑制miR-181a-5p表達(dá)對(duì)雨蛙肽誘導(dǎo)的MPC-83細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響.aP＜0.05,vs Caerulein+anti-miR-NC組; cP＜0.05,vs Caerulein+anti-miR-181a-5p+si-NC組.

3 討論

AP是消化道常見(jiàn)的危重疾病,其并發(fā)癥多,且近年來(lái)發(fā)病率不斷升高,對(duì)患者的生命安全造成了嚴(yán)重的威脅[8].miRNAs在AP的發(fā)生發(fā)展中扮演重要角色[9].異常表達(dá)的miR-181a通過(guò)調(diào)控功能蛋白的表達(dá)及信號(hào)通路影響多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展[10].miR-181a在老年急性心肌梗死患者血清中高表達(dá),可作為診斷老年急性心肌梗死潛在的生物標(biāo)志物[11]; 同樣miR-181a在類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎中也上調(diào)表達(dá)[12].此外,研究發(fā)現(xiàn)抑制miR-181a表達(dá)可減輕魚(yú)藤酮誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞損傷,對(duì)神經(jīng)元細(xì)胞有保護(hù)作用[13].miR-181a-5p在乳腺癌細(xì)胞中低表達(dá),過(guò)表達(dá)miR-181a-5p可通過(guò)靶向Kras抑制乳腺癌細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[14]; 過(guò)表達(dá)miR-181a還可以增強(qiáng)胰腺癌細(xì)胞侵襲能力[15].而本研究結(jié)果顯示,在雨蛙肽處理AR42J和MPC-83細(xì)胞中miR-181a-5p高表達(dá),抑制miR-181a-5p表達(dá)可減少炎癥因子腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)和白細(xì)胞介素-6(interleukin-6,IL-6)的分泌,抑制細(xì)胞凋亡.即抑制miR-181a-5p表達(dá)能保護(hù)雨蛙肽誘導(dǎo)的胰腺腺泡細(xì)胞凋亡.

PIAS1是激活的STAT轉(zhuǎn)錄活性蛋白抑制家族成員之一,PIAS1高表達(dá)正向激活了Shh信號(hào)通路,使胰腺癌細(xì)胞獲得對(duì)吉西他濱的耐藥能力,降低其表達(dá)可以減弱細(xì)胞耐藥能力[16].而過(guò)表達(dá)PIAS1可以通過(guò)抑制NF-κB活性起到抗細(xì)胞凋亡和抗炎作用,顯著改善心肌缺血再灌注損傷[17].且有研究發(fā)現(xiàn)PIAS1在AP中低表達(dá),沉默PIAS1會(huì)增強(qiáng)雨蛙肽活化的caspase-3凋亡途徑誘導(dǎo)的胰腺腺泡細(xì)胞凋亡[18]; PIAS1還參與了雨蛙肽素誘導(dǎo)的胰腺腺泡細(xì)胞的炎癥反應(yīng)[19].本實(shí)驗(yàn)結(jié)果也表明,在雨蛙肽處理的AR42J和MPC-83細(xì)胞中PIAS1低表達(dá),PIAS1過(guò)表達(dá)可以抑制炎癥因子TNF-α和IL-6的表達(dá),抑制細(xì)胞凋亡.且miR-181a-5p靶向負(fù)調(diào)控PIAS1; 抑制PIAS1表達(dá)逆轉(zhuǎn)了抑制miR-181a-5p對(duì)雨蛙肽處理AR42J和MPC-83細(xì)胞的凋亡抑制作用.

Bcl-2是凋亡抑制基因,Bax是凋亡促進(jìn)基因,二者結(jié)合可抑制Bcl-2的功能,Bax/Bcl-2比值升高則促進(jìn)細(xì)胞凋亡; 此外,caspase-3是細(xì)胞凋亡信號(hào)途徑的關(guān)鍵酶,cleaved-caspase-3蛋白的表達(dá)水平可以表示細(xì)胞的凋亡程度[20].本研究發(fā)現(xiàn)在雨蛙肽誘導(dǎo)的胰腺腺泡細(xì)胞凋亡中cleaved-caspase-3、Bax高表達(dá),Bcl-2低表達(dá).抑制miR-181a-5p表達(dá)和PIAS1過(guò)表達(dá)均抑制cleavedcaspase-3和Bax表達(dá),促進(jìn)Bcl-2表達(dá),且miR-181a-5p靶向負(fù)調(diào)控PIAS1,說(shuō)明miR-181a-5p可能通過(guò)PIAS1影響B(tài)ax/Bcl-2/cleaved-caspase-3的表達(dá)從而抑制細(xì)胞凋亡.

綜上所述,抑制miR-181a-5p表達(dá)可以抑制雨蛙肽誘導(dǎo)的胰腺炎腺泡細(xì)胞凋亡,即可以保護(hù)雨蛙肽誘導(dǎo)的AP細(xì)胞損傷,其機(jī)制可能與靶向調(diào)控PIAS1進(jìn)而影響B(tài)ax/Bcl-2/cleaved-caspase-3有關(guān).為AP的診斷和治療提供新靶點(diǎn)和新思路.

文章亮點(diǎn)

實(shí)驗(yàn)背景

急性胰腺炎(acute pancreatitis,AP)是外科常見(jiàn)急腹癥,病情兇險(xiǎn),病死率高.除了胰酶的自身消化損傷作用外,多種炎癥介質(zhì)也參與了胰腺炎的發(fā)展進(jìn)程,使胰腺臟器損傷不斷加重.由于胰腺炎病程中的免疫異常極易導(dǎo)致多器官功能不全綜合癥的發(fā)生.通過(guò)調(diào)節(jié)致炎/抗炎細(xì)胞因子,改善機(jī)體免疫狀態(tài),有利于炎癥的控制和患者預(yù)后的提升.此外,針對(duì)特異性靶點(diǎn)進(jìn)行聯(lián)合治療可以提高治療效率,而更為精準(zhǔn)高效的治療需要弄清其發(fā)生發(fā)展機(jī)制.miRNA是一種小非編碼RNA分子,研究發(fā)現(xiàn)其此外可作為AP的生物標(biāo)志物,還可以調(diào)控AP的細(xì)胞死亡,可作為AP的治療靶點(diǎn).而本文主要是從miRNA方面研究其對(duì)AP凋亡的影響,對(duì)AP中相關(guān)炎癥因子的影響及其可能的作用機(jī)制.

實(shí)驗(yàn)動(dòng)機(jī)

本研究的主題是miR-181a-5p對(duì)AP細(xì)胞損傷的影響,擬解決的關(guān)鍵問(wèn)題是了解miR-181a-5p是如何影響AP細(xì)胞的凋亡,以及其和PIAS1之間的關(guān)系及它們對(duì)AP的影響,在AP中的發(fā)生發(fā)展機(jī)制,為以后臨床上的診斷治療等提供新思路和新靶點(diǎn).

實(shí)驗(yàn)?zāi)繕?biāo)

研究的主要目標(biāo)即miR-181a-5p,PIAS1,AP之間的關(guān)系,研究得到在AP中miR-181a-5p高表達(dá),PIAS1低表達(dá),抑制miR-181a-5p表達(dá)和過(guò)表達(dá)PIAS1均可抑制雨蛙素處理AR42J和MPC-83細(xì)胞凋亡,抑制炎癥因子TNF-α和IL-6的表達(dá),且miR-181a-5p靶向負(fù)調(diào)控PIAS1.可以從調(diào)控AP凋亡的途徑及相關(guān)炎癥因子水平等來(lái)調(diào)控其進(jìn)展,為其治療提供新思路.

實(shí)驗(yàn)方法

本研究首先是用雨蛙素處理大鼠胰腺腺泡來(lái)構(gòu)建AP的模型.轉(zhuǎn)染miR-181a-5p抑制表達(dá)和PIAS1過(guò)表達(dá)的載體質(zhì)粒,MTT檢測(cè)細(xì)胞增殖活性,流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡,Western blot檢測(cè)PIAS1蛋白表達(dá),qRT-PCR檢測(cè)miR-181a-5p和PIAS1 mRNA表達(dá)水平,酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)法檢測(cè)雨蛙肽處理AR42J和MPC-83細(xì)胞的TNF-α和IL-6的表達(dá),熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)miR-181a-5p與PIAS1之間的靶向關(guān)系.

實(shí)驗(yàn)結(jié)果

本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果是在雨蛙素構(gòu)建的AP模型細(xì)胞中,miR-181a-5p的表達(dá)水平升高,PIAS1的表達(dá)水平降低.抑制miR-181a-5p表達(dá)、過(guò)表達(dá)PIAS1腺泡細(xì)胞凋亡率降低,TNF-α和IL-6的表達(dá)水平降低.miR-181a-5p靶向負(fù)調(diào)控PIAS1,抑制PIAS1表達(dá)逆轉(zhuǎn)了抑制miR-181a-5p對(duì)雨蛙素處理AR42J和MPC-83細(xì)胞的凋亡抑制作用; 達(dá)到了本實(shí)驗(yàn)的目的,對(duì)該領(lǐng)域AP的發(fā)病進(jìn)展機(jī)制又增加了相關(guān)的理論依據(jù),以后可以進(jìn)一步在臨床方面進(jìn)行研究應(yīng)用.

實(shí)驗(yàn)結(jié)論

miR-181a-5p靶向負(fù)調(diào)控PIAS1; 抑制miR-181a-5p表達(dá)、過(guò)表達(dá)PIAS1抑制腺泡細(xì)胞凋亡和TNF-α和IL-6的表達(dá).可以通過(guò)調(diào)控PIAS1影響AP相關(guān)炎癥因子的表達(dá)進(jìn)而影響AP的進(jìn)展.從miRNA和其靶基因角度去研究其對(duì)AP的影響拓寬了研究的范圍,不同miRNA影響AP的進(jìn)展的機(jī)制不同,增加了其治療的靶點(diǎn).不同的miRNA在AP中的表達(dá)及其作用機(jī)制不同,可通過(guò)研究不同的miRNA及其靶基因和一些炎癥分子對(duì)AP的影響可拓展研究思路.miR-181a-5p通過(guò)靶向負(fù)調(diào)控PIAS1影響腺泡細(xì)胞凋亡和TNF-α和IL-6的表達(dá).通過(guò)上調(diào)或下調(diào)miRNA可以影響AP的細(xì)胞的凋亡及其嚴(yán)重程度.對(duì)未來(lái)臨床診斷和治療提供了新的標(biāo)志物和新靶點(diǎn).

展望前景

僅對(duì)小鼠模型在理論層面上進(jìn)行研究,需要進(jìn)一步在臨床上進(jìn)行相關(guān)研究和應(yīng)用.進(jìn)一步深入研究miR-181a-5p和PIAS1對(duì)治療AP小鼠的影響及其可能會(huì)產(chǎn)生的其他現(xiàn)象及是否會(huì)有副作用; 以及進(jìn)一步向臨床方向的研究靠攏.尋找更接近于真實(shí)AP的小鼠或者與人AP更為相似的受體,在其基礎(chǔ)上進(jìn)行實(shí)驗(yàn)治療,對(duì)其反應(yīng)狀況進(jìn)行觀(guān)察研究.