歐陽(yáng)夢(mèng)琪， 舒佳慧， 張 棋， 向 陽(yáng)， 王慶松, △

(1西南醫(yī)科大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院， 四川 瀘州 646000； 2中國(guó)人民解放軍成都軍區(qū)總醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科， 四川 成都 610083)

缺血性腦卒中發(fā)病率逐年上升，且具有致殘率高和復(fù)發(fā)率高的特點(diǎn)[1]。腦卒中不僅可引起軀體殘疾，同時(shí)影響患者的認(rèn)知功能，給患者及其家庭乃至社會(huì)都帶來(lái)沉重的負(fù)擔(dān)，正日益成為我國(guó)乃至全球性的公共衛(wèi)生挑戰(zhàn)。不僅要關(guān)注卒中后運(yùn)動(dòng)功能障礙，更要關(guān)注卒中后認(rèn)知障礙(post-stroke cognitive impairment，PSCI)已成為國(guó)內(nèi)外學(xué)者的廣泛共識(shí)[2-3]。大量研究表明，腦灌注不足與認(rèn)知障礙和癡呆的發(fā)展有關(guān)[4]，這為防治卒中后認(rèn)知障礙奠定了理論依據(jù)。慢性腦低灌注(chronic cerebral hypoperfusion，CCH)狀態(tài)是腦血管因素的直接影響結(jié)果，可能是導(dǎo)致認(rèn)知障礙的重要病理生理機(jī)制[5]。本課題組前期實(shí)驗(yàn)已證實(shí)CCH狀態(tài)可導(dǎo)致大鼠認(rèn)知功能減退[6]，但具體機(jī)制仍亟待進(jìn)一步闡明。

線粒體-內(nèi)質(zhì)網(wǎng)結(jié)構(gòu)偶聯(lián)(mitochondria-asso-ciated endoplasmic reticulum membranes，MAMs)是線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)之間存在的物理和生化連接，同時(shí)也是二者結(jié)構(gòu)與功能溝通的橋梁[7]。研究證實(shí)，MAMs結(jié)構(gòu)和功能改變可能是阿爾茨海默病、帕金森病及其它類型認(rèn)知相關(guān)疾病發(fā)病機(jī)制中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)[7]，其中線粒體融合蛋白2(mitofusin 2，Mfn2)是調(diào)節(jié)MAMs結(jié)構(gòu)的關(guān)鍵蛋白[8]。

近年來(lái)，辣椒素(capsaicin)的神經(jīng)血管保護(hù)作用逐漸受到重視。有研究表明瞬時(shí)受體電位香草酸亞型1(transient receptor potential vanilloid 1，TRPV1)在海馬組織廣泛表達(dá)，辣椒素通過(guò)高選擇性激活TRPV1，可保護(hù)突觸可塑性，并一定程度令受損的學(xué)習(xí)記憶能力恢復(fù)[9],但其對(duì)慢性腦低灌注狀態(tài)下認(rèn)知功能的影響及作用仍不明確。

本研究通過(guò)觀察辣椒素對(duì)慢性腦低灌注大鼠認(rèn)知行為受損以及線粒體-內(nèi)質(zhì)網(wǎng)結(jié)構(gòu)偶聯(lián)的影響，探討慢性腦低灌注狀態(tài)所致認(rèn)知功能受損的相關(guān)機(jī)制，為卒中后認(rèn)知相關(guān)后遺癥的預(yù)防與治療提供新的思路。

材 料 和 方 法

1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組

本研究所用48只健康雄性Sprague-Dawlay(SD)大鼠，體重(250±20) g，購(gòu)自成都達(dá)碩實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，合格證號(hào)為SCXK(川)2015-030。按隨機(jī)數(shù)字表法將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物隨機(jī)分為假手術(shù)(sham)組、CCH組、辣椒素(capsaicin)組和溶媒(solvent)組(n=12)。所有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物購(gòu)回后飼養(yǎng)于成都軍區(qū)總醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物房，恒溫(25±2)℃，恒濕(40～60)%，通風(fēng)良好，光照明暗交替每天12 h，自由取食飲水。本研究所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)已通過(guò)成都軍區(qū)總醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理審查。

2 主要試劑與儀器

辣椒素購(gòu)自Alomone；兔抗細(xì)胞色素C氧化酶亞單位IV (cytochrome C oxidase subunit IV, COX IV)多克隆抗體和小鼠抗PDI單克隆抗體購(gòu)自Abcam；山羊抗兔Alexa Flour 488和山羊抗小鼠 Alexa Flour 594購(gòu)自Life Technologies；小鼠抗Mfn2單克隆抗體購(gòu)自Abcam；PVDF膜購(gòu)自Millipore； Triton X-100購(gòu)自Sigma-Aldrich；外科手術(shù)器械購(gòu)自成都醫(yī)療器械廠；其余藥品試劑均為市售分析純。冰凍切片機(jī)購(gòu)自Leica；激光共聚焦顯微鏡購(gòu)自O(shè)lympus；透射電子顯微鏡購(gòu)自HITACHI(型號(hào)H-600IV)；超薄切片機(jī)購(gòu)自Reichert-Jung(LabX)。

3 主要方法

3.1CCH模型的制備與給藥 本課題組前期研究證實(shí)[6]，永久性結(jié)扎雙側(cè)頸總動(dòng)脈(bilateral common carotid artery occlusion，BCCAO)術(shù)后4周大鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力明顯受損，故本研究選擇術(shù)后4周時(shí)點(diǎn)作為重點(diǎn)探討。根據(jù)參考文獻(xiàn)與本課題組前期方法學(xué)基礎(chǔ)[6, 10]，各組大鼠在術(shù)前禁食8～12 h，禁飲4 h，并稱重。用1.5%戊巴比妥鈉(40 mg/kg)腹腔注射麻醉大鼠，取仰臥位固定于手術(shù)板，備皮、消毒頸部正中手術(shù)區(qū)域。于頸正中行縱行切口約1 cm，輕柔鈍性分離皮下組織和胸鎖乳突肌，避免損傷甲狀腺組織，分離暴露右側(cè)頸總動(dòng)脈，避免損傷迷走神經(jīng)及伴行靜脈，依次結(jié)扎該側(cè)頸總動(dòng)脈近心端和遠(yuǎn)心端，并離斷血管。逐層縫合組織與皮膚，消毒，術(shù)后予以肌注青霉素抗感染觀察至動(dòng)物蘇醒。術(shù)后密切觀察飼養(yǎng)1周后，按上述相同方法結(jié)扎對(duì)側(cè)頸總動(dòng)脈。假手術(shù)組操作過(guò)程同手術(shù)組，但僅分離頸總動(dòng)脈，不結(jié)扎也不離斷，術(shù)后動(dòng)物存活即造模成功。根據(jù)參考文獻(xiàn)[11]，capsaicin組于術(shù)后7 d，每周2次腹腔內(nèi)注射辣椒素2.5 mg/kg，連用4周；溶媒組在相同時(shí)點(diǎn)和條件下給予等量溶媒(生理鹽水∶DMSO∶乙醇=8∶1∶1)。術(shù)后4周進(jìn)行行為學(xué)測(cè)試，測(cè)試結(jié)束后第2天進(jìn)行灌注固定取材，各組用于取材大鼠各12只。

3.2行為學(xué)檢測(cè) 所有實(shí)驗(yàn)保持在每天同一時(shí)點(diǎn)，于安靜環(huán)境下進(jìn)行。(1)曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)(open field test，OFT)：將實(shí)驗(yàn)大鼠輕柔抓取放入曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)箱底固定位置，通過(guò)攝像裝置觀察并記錄5 min內(nèi)大鼠總行程、自發(fā)性抬足次數(shù)、自發(fā)活動(dòng)(四邊、四角和中央?yún)^(qū)活動(dòng)時(shí)間和行程)及排便情況等。實(shí)驗(yàn)完畢后清除實(shí)驗(yàn)箱中糞便和尿液，用75%乙醇全面清潔實(shí)驗(yàn)箱后，更換實(shí)驗(yàn)動(dòng)物；(2)物體辨別實(shí)驗(yàn)(object recognition test，ORT)：在物體辨別實(shí)驗(yàn)箱(40 cm×40 cm×45 cm)中放入2個(gè)相同物體A(為可樂(lè)易拉罐)，將大鼠從距兩物體A相同距離處放入，令其在箱內(nèi)自由探索5 min后取出,完成熟悉期測(cè)試。休息90 min后，將物體B(為形狀不規(guī)則飲料罐)替換其中1個(gè)物體A后，將同一只實(shí)驗(yàn)動(dòng)物在實(shí)驗(yàn)箱中距離物體A和物體B相同距離處放入，自由探索5 min取出,完成短期辨別記憶測(cè)試。每只實(shí)驗(yàn)大鼠實(shí)驗(yàn)完畢后清除實(shí)驗(yàn)箱中糞便和尿液，用75%乙醇擦拭實(shí)驗(yàn)箱及物體消毒,同時(shí)去除上一只大鼠殘留氣味。根據(jù)探索新物體時(shí)間(N)和探索舊物體時(shí)間(F)計(jì)算辨別指數(shù)[discrimination index(DI)=N/(N+F)×100%]；(3)Morris水迷宮(Morris water maze，MWM)實(shí)驗(yàn)：前1～5 d完成定位航行實(shí)驗(yàn)，每天同一時(shí)點(diǎn)訓(xùn)練4次，根據(jù)隨機(jī)表格分別從4個(gè)象限將大鼠面向池壁輕輕放入水中，逃生平臺(tái)置于西南象限中央，每2次間隔15 min。放入大鼠同時(shí)開(kāi)啟攝像裝置并計(jì)時(shí)，觀察并記錄大鼠運(yùn)動(dòng)軌跡及找到逃生平臺(tái)所需時(shí)間記為逃避潛伏期。如果60 s 后仍未找到逃生平臺(tái)，將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物引導(dǎo)至平臺(tái)停留10 s，記錄潛伏期時(shí)間為60 s。實(shí)驗(yàn)后將大鼠擦干放入籠中。第 6天撤去逃生平臺(tái)進(jìn)行空間探索實(shí)驗(yàn)，通過(guò)同步攝像裝置觀察并記錄大鼠60 s內(nèi)穿越原平臺(tái)次數(shù)以及穿越平臺(tái)潛伏期。

3.3病理標(biāo)本取材 行為學(xué)實(shí)驗(yàn)完成后，對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物腹腔注射1.5%戊巴比妥鈉(80 mg/kg)進(jìn)行深度麻醉，迅速打開(kāi)胸、腹腔充分暴露心臟、肝和腎組織。經(jīng)左心快速灌注4 ℃預(yù)冷生理鹽水，同時(shí)剪開(kāi)右心耳，灌注至肝和腎變白且無(wú)血液流出后，用4%多聚甲醛溶液先快后慢滴注灌注至大鼠四肢和尾部僵硬后，迅速在冰上將大鼠斷頭取腦。

3.4免疫熒光雙重標(biāo)記檢測(cè)線粒體-內(nèi)質(zhì)網(wǎng)共定位水平 腦組織取出后用后4%多聚甲醛后固定8～12 h，10%～30%蔗糖濃度梯度逐級(jí)脫水后OCT包埋。冰凍切片機(jī)切取包括海馬組織腦片，片厚30 μm。PBS溶液清洗3次，每次10 min，用10%山羊血清和0.5% Triton X-100混合，室溫封閉90 min～120 min。加入兔抗COX Ⅳ多克隆抗體(1∶100)和小鼠抗PDI單克隆抗體(1∶100),混合孵育4 ℃過(guò)夜。PBS溶液洗去未結(jié)合的Ⅰ抗，混合孵育山羊抗小鼠Alexa Fluor 594熒光Ⅱ抗(1∶1 000)及山羊抗兔Alexa Fluor 488熒光Ⅱ抗(1∶1 000)120 min，PBS溶液洗去未結(jié)合的Ⅱ抗，室溫反應(yīng)，加DAPI染細(xì)胞核2 min，PBS溶液清洗3次，每次10 min。封片后立即在激光共聚焦顯微鏡下觀察采圖。線粒體-內(nèi)質(zhì)網(wǎng)共定位水平采用ImageJ軟件進(jìn)行計(jì)量分析。

3.5透射電鏡觀察線粒體-內(nèi)質(zhì)網(wǎng)結(jié)構(gòu)偶聯(lián)的變化 灌注固定后取大鼠海馬組織CA1區(qū)，根據(jù)參考文獻(xiàn)[12]，用3%戊二醛預(yù)固定，之后用1%鋨酸后固定。30%～100%丙酮逐級(jí)脫水，環(huán)氧樹(shù)脂Epon812滲透包埋，超薄切片機(jī)進(jìn)行半薄切片，定位后行超薄切片，漂浮于刀槽液面上再撈至銅網(wǎng)，醋酸雙氧鈾及枸櫞酸鉛染色后，在電鏡下對(duì)樣本進(jìn)行觀察。根據(jù)參考文獻(xiàn)[13]，采用ImageJ軟件對(duì)圖像進(jìn)行分析，將線粒體與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)距離小于30 nm定義為線粒體-內(nèi)質(zhì)網(wǎng)結(jié)構(gòu)偶聯(lián)，同時(shí)測(cè)量線粒體與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)連接部分長(zhǎng)度占線粒體周長(zhǎng)的比例并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。

3.6Western blot檢測(cè)蛋白水平 生理鹽水灌注后取大鼠海馬組織凍存于-80 ℃冰箱。取標(biāo)本進(jìn)行勻漿，提取包含Mfn2及亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)等的蛋白。將等量蛋白(30 μg)于10% SDS-PAGE進(jìn)行分離后，轉(zhuǎn)移至PVDF膜(300 mA，2 h)，5%脫脂牛奶封閉2 h后，加入小鼠抗Mfn2單克隆抗體(1∶1 000)，4 ℃孵育過(guò)夜。次日用TBST漂洗3次，每次15 min，加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記Ⅱ抗(1 ∶5 000)，室溫?fù)u床孵育1 h，TBST漂洗3次，每次15 min，充分曝光顯影。使用ImageJ軟件進(jìn)行量化分析。

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 18.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。所有計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示。行為學(xué)測(cè)量數(shù)據(jù)組內(nèi)和組間比較采用重復(fù)測(cè)量的方差分析，多組間比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 辣椒素對(duì)慢性腦低灌注致認(rèn)知障礙大鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力的影響

與假手術(shù)組相比，CCH組大鼠的逃避潛伏期顯著延長(zhǎng)，穿越平臺(tái)次數(shù)明顯減少，穿越平臺(tái)潛伏期延長(zhǎng)(P<0.05)；與溶媒組相比，capsaicin組大鼠逃避潛伏期縮短，穿越平臺(tái)次數(shù)增多，同時(shí)穿越平臺(tái)潛伏期縮短(P<0.05)，見(jiàn)圖1。

2 辣椒素對(duì)慢性腦低灌注致認(rèn)知障礙大鼠自發(fā)活動(dòng)、運(yùn)動(dòng)速度與距離、中央?yún)^(qū)域活動(dòng)時(shí)間及距離的影響

曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與假手術(shù)組相比，CCH組自

Figure 1. The results of Morris water maze test between each group of the rats. A: the typical images of Morris water maze test in each group. Red arrows showed the starting point, black arrows showed the end point; B: the escape latency during place navigation test in the first 5 d; C: the number of crossing original platform in spatial probe test; D: the escape latency during platform trials in spatial probe test. Mean±SD.n=12.*P<0.05vssham group;#P<0.05vssolvent group.

圖1 4組大鼠Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)逃避潛伏期、穿越平臺(tái)次數(shù)和穿越平臺(tái)潛伏期的比較

發(fā)性抬足次數(shù)明顯減少，總活動(dòng)距離縮短，平均活動(dòng)速度下降，中央?yún)^(qū)域活動(dòng)時(shí)間減少，中央?yún)^(qū)域活動(dòng)距離縮短(P<0.05)；與溶媒組相比，capsaicin組自發(fā)性抬足次數(shù)增加，總活動(dòng)距離增加，平均活動(dòng)速度增加，中央?yún)^(qū)域活動(dòng)時(shí)間延長(zhǎng)，中央?yún)^(qū)域活動(dòng)距離增加(P<0.05)，見(jiàn)圖2。

Figure 2. Comparison of the number of spontaneous standing, the average speed, the total distance, the activity time of central region and the activity distance of central region in open field test. A: the representative images of open field test; B: the number of spontaneous standing in open field test; C: the average speed of open field test; D: the total distance of open field test; E: the activity time of central region; F: the activity distance of central region. Mean±SD.n=12.*P<0.05vssham group;#P<0.05vssolvent group.

圖2 曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)中4組大鼠自發(fā)性抬足次數(shù)、運(yùn)動(dòng)速度與距離、中央?yún)^(qū)域活動(dòng)時(shí)間及活動(dòng)距離的比較

3 辣椒素對(duì)慢性腦低灌注致認(rèn)知障礙大鼠物體辨別指數(shù)的影響

物體辨別實(shí)驗(yàn)表明，假手術(shù)組物體辨別指數(shù)(DI)明顯高于CCH組(P<0.05)；capsaicin組物體辨別指數(shù)(DI)明顯高于溶媒組(P<0.05)，見(jiàn)圖3。

Figure 3. Comparison of discrimination index (DI) in each group of the rats in object recognition test. A: the representative images of object recognition test; B: the comparison of DI of each group of the rats. Mean±SD.n=12.*P<0.05vssham group;#P<0.05vssolvent group.

圖3 辣椒素對(duì)CCH大鼠物體辨別指數(shù)的影響

4 透射電鏡觀察各組大鼠海馬CA1區(qū)細(xì)胞內(nèi)線粒體-內(nèi)質(zhì)網(wǎng)偶聯(lián)結(jié)構(gòu)

通過(guò)透射電鏡觀察海馬CA1區(qū)線粒體-內(nèi)質(zhì)網(wǎng)偶聯(lián)結(jié)構(gòu)，結(jié)果顯示，與假手術(shù)組相比，CCH組線粒體-內(nèi)質(zhì)網(wǎng)偶聯(lián)結(jié)構(gòu)疏松，表現(xiàn)為線粒體-內(nèi)質(zhì)網(wǎng)之間距離顯著增加，線粒體-內(nèi)質(zhì)網(wǎng)偶聯(lián)結(jié)構(gòu)所占線粒體周長(zhǎng)百分比明顯降低(P<0.05)；與溶媒組相比，capsaicin組線粒體-內(nèi)質(zhì)網(wǎng)偶聯(lián)結(jié)構(gòu)相對(duì)緊密(P<0.05)，見(jiàn)圖4。

Figure 4. The results of mitochondria-associated endoplasmic reticulum membranes (MAMs) in the hippocampus CA1 area in each group of the rats were observed under transmission electron microscope. A: the representative electron micrographs of MAMs in each group. The arrowheads with loops show regions of association (scale bar=200 nm); B: the distances of mitochondria-ER contacts in different samples; C: the bar chart shows the percentage of the mitochondria surface closely apposed to ER in the whole mitochondria of different groups. Mean±SD.n=12.*P<0.05vssham group;#P<0.05vssolvent group.

圖4 透射電鏡觀察各組大鼠海馬CA1區(qū)MAMs平均距離及其占線粒體周長(zhǎng)的比例結(jié)果

5 免疫熒光雙重標(biāo)記檢測(cè)各組大鼠海馬CA1區(qū)細(xì)胞內(nèi)線粒體-內(nèi)質(zhì)網(wǎng)共定位水平

根據(jù)參考文獻(xiàn)，我們應(yīng)用PDI與COX IV免疫熒光雙重標(biāo)記內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和線粒體，觀察分析細(xì)胞內(nèi)線粒體-內(nèi)質(zhì)網(wǎng)結(jié)構(gòu)偶聯(lián)共定位水平，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與假手術(shù)組相較，CCH組線粒體-內(nèi)質(zhì)網(wǎng)共定位系數(shù)下降；與溶媒組相比，capsaicin組線粒體-內(nèi)質(zhì)網(wǎng)共定位水平增高(P<0.05)，見(jiàn)圖5。

Figure 5. The results of co-localization of ER and mitochondria in the hippocampus CA1 area of the rats in each group detected by immunofluorescence doublelobeling. Double-immunolabeled images for mitochondria marker COX-IV (green), ER marker PDI (red) and nucleus (blue) were showed. Co-localization showed co-localized pixels (orange). The scale bar=15 μm. The bar chart showed the ER-mitochondria co-localization. Mean±SD.n=16.*P<0.05vssham group;#P<0.05vssolvent group.

圖5 免疫熒光雙標(biāo)記觀察4組大鼠海馬CA1區(qū)線粒體-內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的共定位情況

6 Western blot法檢測(cè)各組大鼠海馬組織中Mfn2蛋白表達(dá)水平

與假手術(shù)組相比，CCH組大鼠海馬組織中的Mfn2蛋白水平下降(P<0.05)；與溶媒組相比，capsaicin組大鼠海馬組織中Mfn2的蛋白水平顯著增加(P<0.05)，見(jiàn)圖6。

討 論

認(rèn)知功能障礙發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，涉及面廣，越來(lái)越多的研究揭示，腦血管因素與認(rèn)知功能密切相關(guān)，腦組織血管性病理?yè)p傷導(dǎo)致結(jié)構(gòu)及功能聯(lián)系破壞，腦組織功能網(wǎng)絡(luò)下調(diào)可導(dǎo)致混合的輕度認(rèn)知受損或血管性認(rèn)知障礙(vascular cognitive impairment，VCI)，血管病理與神經(jīng)退行性改變并存，逐漸可發(fā)展為臨床癡呆，針對(duì)血管危險(xiǎn)因素可能可以預(yù)防甚至治療癡呆[4]。CCH是作為腦血管病危險(xiǎn)因素、腦血管功能與血流動(dòng)力學(xué)改變直接影響的重要病理生理基礎(chǔ)，是導(dǎo)致神經(jīng)血管功能改變的重要機(jī)制之一，對(duì)認(rèn)知功能具有深遠(yuǎn)的影響[14]。我們前期通過(guò)動(dòng)態(tài)觀察發(fā)現(xiàn)隨著缺血時(shí)間延長(zhǎng)，CCH狀態(tài)下認(rèn)知功能明顯受損[6]，但相關(guān)機(jī)制仍不明確。本研究持續(xù)動(dòng)態(tài)觀察CCH狀態(tài)下，大鼠空間學(xué)習(xí)記憶功能的改變。

Figure 6. Western blot was used to determine the protein expression of Mfn2 in the hippocampal tissue between 4 groups of the rats. Mean±SD.n=20.*P<0.05vssham group;#P<0.05vssolvent group.

圖6 Western blot檢測(cè)4組大鼠海馬組織中Mfn2的蛋白表達(dá)水平

MWM實(shí)驗(yàn)是目前世界公認(rèn)的較為客觀的學(xué)習(xí)記憶功能評(píng)價(jià)方法[15]，為經(jīng)典的學(xué)習(xí)記憶評(píng)價(jià)工具之一。本研究通過(guò)采用MWM實(shí)驗(yàn)對(duì)CCH狀態(tài)下大鼠空間學(xué)習(xí)記憶功能進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，CCH狀態(tài)大鼠逃避潛伏期延長(zhǎng)，穿越平臺(tái)次數(shù)減少，穿越平臺(tái)潛伏期延長(zhǎng)，表明CCH狀態(tài)大鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力下降，結(jié)果與本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)一致。其次，曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)是用于評(píng)價(jià)動(dòng)物自發(fā)活動(dòng)、探索行為及焦慮狀態(tài)的經(jīng)典行為學(xué)實(shí)驗(yàn)，總路程、平均速度及自發(fā)抬足次數(shù)均被視為反映大鼠自發(fā)活動(dòng)的主要依據(jù);同時(shí)OFT基于大鼠的趨避性，即畏懼開(kāi)闊和未知等可能存在危險(xiǎn)的場(chǎng)所，具有“貼墻”活動(dòng)的天性，通過(guò)分析中央?yún)^(qū)域活動(dòng)時(shí)間及距離可客觀反映大鼠焦慮水平及探索行為，OFT結(jié)果表明CCH大鼠自發(fā)活動(dòng)行為減少，總活動(dòng)距離與平均速度降低，中央?yún)^(qū)域活動(dòng)探索頻率下降，焦慮水平較高。最后，物體辨別實(shí)驗(yàn)通過(guò)比較物體辨別指數(shù)，表明CCH大鼠短期辨別記憶能力下降。

線粒體與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)在結(jié)構(gòu)及功能上緊密連接并相互作用，線粒體通過(guò)蛋白質(zhì)連接內(nèi)質(zhì)網(wǎng)外膜的這一亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)區(qū)域稱為MAMs，MAMs作為兩者之間的物理生化橋梁，參與調(diào)節(jié)線粒體動(dòng)力學(xué)、生物能代謝、鈣平衡、磷脂合成與轉(zhuǎn)運(yùn)和氧化還原過(guò)程等細(xì)胞重要生命活動(dòng)，成為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(endoplasmic reticulum stress，ERS)和未折疊蛋白反應(yīng)(unfolded protein response，UPR)、自噬、炎性介質(zhì)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的關(guān)鍵所在，廣泛影響細(xì)胞內(nèi)正常生命活動(dòng)[16]。近年來(lái)研究者認(rèn)為MAMs是包括阿爾茨海默病和帕金森病等認(rèn)知相關(guān)疾病中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，MAMs結(jié)構(gòu)功能改變可能引起線粒體功能異常及生物能產(chǎn)生下降、鈣穩(wěn)態(tài)紊亂、膽固醇及磷脂代謝異常、自噬、突觸丟失從而導(dǎo)致學(xué)習(xí)記憶障礙[7, 17]。Mfn2為連接2種細(xì)胞器必需連接蛋白，Mfn2消融或沉默可使MAMs連接疏松或MAMs結(jié)構(gòu)破壞[8]。我們通過(guò)透射電鏡觀察CCH狀態(tài)下MAMs的超微結(jié)構(gòu)改變，進(jìn)一步通過(guò)Western blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)Mfn2蛋白的表達(dá)，結(jié)果表明CCH狀態(tài)下MAMs結(jié)構(gòu)疏松，Mfn2表達(dá)下降，推測(cè)MAMs結(jié)構(gòu)改變可能是CCH狀態(tài)后的空間學(xué)習(xí)記憶功能障礙的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。

辣椒素具有神經(jīng)和血管保護(hù)作用，能改善認(rèn)知功能[18]。辣椒素通過(guò)高選擇性激活TRPV1，可促進(jìn)長(zhǎng)時(shí)程增益效應(yīng)(long-term potentiation，LTP)，抑制長(zhǎng)時(shí)程抑制(Long-term depression，LTD)，保護(hù)海馬突觸可塑性，有助于空間記憶功能恢復(fù)，是改善認(rèn)知的潛在靶點(diǎn)[9]，但其對(duì)CCH狀態(tài)所致認(rèn)知功能減退是否有保護(hù)作用未見(jiàn)報(bào)道。同時(shí)，辣椒素通過(guò)激活TRPV1可改善缺血性損傷，并具有一定線粒體保護(hù)作用[19]，但具體機(jī)制仍不明確。本研究在發(fā)現(xiàn)CCH狀態(tài)下MAMs結(jié)構(gòu)改變這一現(xiàn)象的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步探討辣椒素是否可以改善CCH狀態(tài)導(dǎo)致認(rèn)知功能下降，以及其中可能的機(jī)制。我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明辣椒素干預(yù)組大鼠逃避潛伏期顯著縮短、穿越平臺(tái)次數(shù)明顯增多、穿越平臺(tái)潛伏期縮短，提示辣椒素確有改善空間學(xué)習(xí)記憶功能。進(jìn)一步觀察到大鼠海馬CA1區(qū)細(xì)胞內(nèi)MAMs結(jié)構(gòu)較CCH組緊密，同時(shí)Mfn2蛋白表達(dá)增多，推測(cè)辣椒素改善學(xué)習(xí)記憶功能的作用可能是通過(guò)影響MAMs結(jié)構(gòu)實(shí)現(xiàn)的。

因此，我們的實(shí)驗(yàn)表明在CCH狀態(tài)所致認(rèn)知障礙模型中，MAMs結(jié)構(gòu)疏松，距離增加，而辣椒素可改善CCH導(dǎo)致的學(xué)習(xí)記憶減退，其作用可能是通過(guò)改善MAMs結(jié)構(gòu)實(shí)現(xiàn)的，這為預(yù)防和治療CCH所致的認(rèn)知障礙減退提供新的治療靶點(diǎn)，但具體分子機(jī)制仍需進(jìn)一步探討。