佘 顏， 胡雨琴， 張 荊， 蒿玉興， 蔡 媛， 張蟈蟈， 王睿智， 鄧常清△， 劉新春

(1湖南中醫(yī)藥大學(xué)血管生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室， 湖南 長(zhǎng)沙 410208； 2湖南中醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校附屬第一醫(yī)院， 湖南 株洲 412000)

腦缺血再灌注損傷的病理生理機(jī)制是一系列復(fù)雜的神經(jīng)損傷級(jí)聯(lián)反應(yīng)，神經(jīng)細(xì)胞的死亡貫穿整個(gè)損傷過(guò)程。細(xì)胞焦亡是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)并證實(shí)的一種典型依賴于炎癥反應(yīng)的程序性細(xì)胞死亡方式。經(jīng)典焦亡途徑依賴于caspase-1激活后誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)，內(nèi)源性和外源性刺激信號(hào)通過(guò)不同途徑作用于炎癥小體而激活caspase-1，介導(dǎo)細(xì)胞滲透性腫脹破裂，形成膜孔，胞內(nèi)物質(zhì)(如乳酸脫氫酶等)流出，白細(xì)胞介素1β(interleukin-1β，IL-1β)和IL-18前體裂解并誘導(dǎo)其它炎癥因子、黏附分子等的合成和釋放，放大局部和全身炎癥反應(yīng)，誘導(dǎo)細(xì)胞焦亡的發(fā)生[1-3]。炎癥小體的活化是細(xì)胞焦亡調(diào)控的經(jīng)典途徑，是細(xì)胞焦亡調(diào)控的核心環(huán)節(jié)，核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體蛋白3(nucleotide-binding oligomerization domain-like receptor protein 3，NLRP3)炎癥小體是通過(guò)caspase-1與含CARD 結(jié)構(gòu)域的凋亡相關(guān)顆粒樣蛋白(apoptosis-associated speck-like protein containing CARD，ASC)等相互作用而構(gòu)成的蛋白復(fù)合體，可誘導(dǎo)細(xì)胞焦亡的發(fā)生[4-5]。NLRP3炎癥小體同樣作為腦缺血后中樞神經(jīng)系統(tǒng)無(wú)菌性炎癥反應(yīng)的始動(dòng)因子，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中誘導(dǎo)細(xì)胞焦亡和炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞的損傷，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)細(xì)胞焦亡中發(fā)揮關(guān)鍵作用[6-7]。在腦缺血再灌注中，細(xì)胞焦亡及其調(diào)控機(jī)制與神經(jīng)系統(tǒng)損傷有何種關(guān)系還不清楚，因此，本文研究腦缺血再灌注后不同時(shí)間點(diǎn)海馬和皮質(zhì)區(qū)細(xì)胞焦亡的變化特點(diǎn)，以進(jìn)一步明確神經(jīng)細(xì)胞焦亡在腦缺血再灌注損傷發(fā)生發(fā)展中的意義。

材 料 和 方 法

1 動(dòng)物

SPF級(jí)雄性SD大鼠80只，體重240～260 g，由湖南維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供,動(dòng)物合格證號(hào)為SCXK(湘)2009-0004。 飼養(yǎng)于SPF級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室，濕度 45%、室溫25 ℃。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)經(jīng)湖南中醫(yī)藥大學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

2 主要試劑和儀器

兔抗鼠cleaved caspase-1、IL-1β和NLRP3多克隆抗體及Alexa Fluor 594標(biāo)記的山羊抗兔IgG購(gòu)自Proteintech；兔抗鼠pro-caspase-1單克隆抗體購(gòu)自Abcam；兔抗鼠β-actin單克隆抗體購(gòu)自北京中杉金橋；TUNEL熒光試劑盒購(gòu)自凱基生物；辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG和HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG購(gòu)自北京中杉金橋；TTC購(gòu)自Sigma。CM185恒冷箱冰凍切片機(jī)購(gòu)自Leica;熒光顯微鏡購(gòu)自Carl Zeiss; ChemiDoc XRS 高靈敏度化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)購(gòu)自Bio-Rad。

3 方法

3.1動(dòng)物分組及造模 參照Longa等[8]報(bào)道的方法進(jìn)行改良建立右側(cè)大腦中動(dòng)脈阻塞局灶性腦缺血再灌注(middle cerebral artery occlusion and reperfusion，MCAO/R)模型。腦缺血2 h后撥出線栓恢復(fù)血流實(shí)現(xiàn)再灌注。分別在腦缺血再灌注后的3個(gè)時(shí)點(diǎn)(6 h、12 h和24 h)麻醉處死動(dòng)物檢測(cè)。假手術(shù)組僅手術(shù)分離頸總動(dòng)脈，不放線栓。

將80只大鼠隨機(jī)分成假手術(shù)組(sham組)和模型組(MCAO/R組)，模型組按腦缺血再灌注后不同時(shí)間再分成腦缺血再灌注6 h組(MCAO/R 6 h組)、腦缺血再灌注12 h組(MCAO/R12 h組)和腦缺血再灌注24 h組(MCAO/R 24 h組)，每組各20只。

3.2神經(jīng)功能評(píng)分 根據(jù) Longa 5級(jí)4分法對(duì)各個(gè)時(shí)點(diǎn)大鼠進(jìn)行神經(jīng)功能評(píng)分，模型納入標(biāo)準(zhǔn)為神經(jīng)功能評(píng)分1～3分，模型剔除標(biāo)準(zhǔn)為神經(jīng)功能評(píng)分為0分或4分。

3.3腦梗死體積的測(cè)定 采用TTC染色法測(cè)定。大鼠處死后取完整腦組織，去除小腦和腦干，將腦組織置于冰生理鹽水中置-20 ℃冷凍20 min，取出后放入專用腦槽切片模具中，按2 mm的厚度沿冠狀位切片，將腦組織切片放入2% TTC液中，37 ℃溫育15 min，使腦片均勻染色。染色后取出腦片浸入4%多聚甲醛中固定過(guò)夜，固定好的腦片取出晾干按順序拍照。Image-Pro Plus 6.0圖像分析軟件測(cè)定各腦片的缺血區(qū)(呈白色)面積，并根據(jù)腦片厚度計(jì)算缺血區(qū)體積。

3.4腦組織病理形態(tài)觀察 采用HE染色觀察海馬及皮質(zhì)區(qū)形態(tài)特征。將腦組織置于4%多聚甲醛中固定48 h，在全自動(dòng)脫水機(jī)上進(jìn)行組織脫水，石蠟包埋。連續(xù)切取5 μm厚冠狀切片，梯度乙醇脫水, 二甲苯透明后封片觀察。在顯微鏡下觀察海馬及皮質(zhì)區(qū)神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)，以判斷神經(jīng)細(xì)胞損傷程度。

3.5神經(jīng)細(xì)胞焦亡的測(cè)定 采用caspase-1和TUNEL免疫熒光雙染法檢測(cè)大鼠海馬及皮質(zhì)區(qū)神經(jīng)細(xì)胞焦亡。大鼠先用生理鹽水灌注，待肝臟顏色變淺后，經(jīng)心臟灌注4%多聚甲醛磷酸緩沖液250 mL固定，取腦組織作冰凍切片，按順序滴加50 μL TdT酶反應(yīng)液(45 μL equilibration buffer加1.0 μL biotin-11-dUTP和 4.0 μL TdT enzyme)和streptavidin-FITC標(biāo)記工作液，孵育 I 抗(cleaved caspase-1：1∶50)，4 ℃過(guò)夜，孵育 II 抗(抗兔-IgG標(biāo)記熒光抗體：1∶100)，DAPI工作液37 ℃染核，暗室中甘油封片。熒光顯微鏡下取海馬及皮質(zhì)區(qū)觀察拍照。Cleaved caspase-1熒光呈紅色，胞漿和胞核均有表達(dá)；TUNEL的熒光呈綠色， 在胞核中表達(dá)；藍(lán)色熒光為同視野下的細(xì)胞核。選取海馬CA1區(qū)及皮質(zhì)區(qū)同一部位，計(jì)數(shù)細(xì)胞共表達(dá)率(3色重疊細(xì)胞/藍(lán)色熒光細(xì)胞)作為陽(yáng)性細(xì)胞，計(jì)算細(xì)胞焦亡陽(yáng)性細(xì)胞率。

3.6NLRP3、cleaved caspase-1、pro-caspase-1和IL-1β蛋白表達(dá)的測(cè)定 采用Western blot檢測(cè)海馬及皮質(zhì)區(qū) NLRP3、cleaved caspase-1、pro-caspase-1和IL-1β蛋白表達(dá)。分別分離海馬及皮質(zhì)區(qū)，加蛋白裂解液提取腦組織總蛋白，BCA法測(cè)定蛋白濃度。取50 μg蛋白樣品煮沸變性，行SDS-PAGE，轉(zhuǎn)膜，5%的脫脂奶粉 37 ℃ 封閉 1 h。加入稀釋的 I 抗(NLRP3:1∶300；cleaved caspase-1:1∶500； pro-caspase-1:1∶100和IL-1β:1∶200)及抗β-actin的I 抗(1∶100)，4 ℃孵育過(guò)夜。次日用 TBST漂洗膜 3次，將膜放入已用封閉液稀釋的 II 抗中，室溫孵育1 h 。洗滌后ECL顯影，凝膠成像儀照相，QuantityOne軟件測(cè)定各目的條帶的吸光度(IA值)，分別以NLRP3、cleaved caspase-1、pro-caspase-1、IL-1β的IA與 β-actin的IA的比值對(duì)目的蛋白的表達(dá)進(jìn)行相對(duì)定量。

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用 SPSS 24.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。所有數(shù)據(jù)均用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示。各組計(jì)量資料比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用 SNK-q檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 腦缺血再灌注后不同時(shí)點(diǎn)腦梗死體積的變化

假手術(shù)組未見(jiàn)白色的梗死灶。腦缺血再灌注后大腦皮質(zhì)出現(xiàn)梗死區(qū)，MCAO/R 6 h組、12 h組和24 h組的梗死體積顯著大于假手術(shù)組(P<0.05)，且隨著再灌注時(shí)間的增加，梗死體積進(jìn)一步增加，與MCAO/R 6 h組比較，MCAO/R 12 h組和24 h組的腦梗死體積顯著增大(P<0.05)，見(jiàn)圖1。

2 腦缺血再灌注后不同時(shí)點(diǎn)海馬CA1區(qū)和皮質(zhì)區(qū)神經(jīng)細(xì)胞病理形態(tài)學(xué)的變化

HE染色顯示，假手術(shù)組大鼠海馬區(qū)及皮質(zhì)區(qū)神經(jīng)細(xì)胞呈圓形或錐體形，排列整齊致密，胞核飽滿，核仁明顯，邊界清晰;腦缺血再灌注后，腦組織結(jié)構(gòu)疏松，間質(zhì)水腫，神經(jīng)細(xì)胞腫脹，排列紊亂，細(xì)胞核固縮，碎裂，神經(jīng)細(xì)胞數(shù)量明顯減少，呈細(xì)胞死亡的典型特征，尤其在MCAO/R 12 h組和24 h組變化顯著，見(jiàn)圖2。

3 腦缺血再灌注后不同時(shí)點(diǎn)海馬CA1區(qū)和皮質(zhì)區(qū)神經(jīng)細(xì)胞焦亡的變化

以cleaved caspase-1(呈紅色)和TUNEL(呈綠色)的共表達(dá)計(jì)數(shù)細(xì)胞共表達(dá)率(3色重疊細(xì)胞/藍(lán)色熒光細(xì)胞)反映細(xì)胞焦亡。假手術(shù)組可見(jiàn)少量的共表達(dá)焦亡細(xì)胞。腦缺血再灌注后，海馬CA1區(qū)和皮質(zhì)區(qū)焦亡細(xì)胞顯著多于假手術(shù)組(P<0.05)。隨著再灌注時(shí)間的延長(zhǎng)，焦亡細(xì)胞率增加，其中，在海馬CA1區(qū)和皮質(zhì)區(qū)，MCAO/R 12 h組和MCAO/R 24 h組的焦亡細(xì)胞率大于MCAO/R 6 h組(P<0.05)，見(jiàn)圖3。

Figure 1. The changes of cerebral infarction volumes at different time points after cerebral ischemia reperfusion. Mean±SD.n=5.*P<0.05vssham group;#P<0.05vsMCAO/R 6 h group.

圖1 腦缺血再灌注后不同時(shí)點(diǎn)腦梗死體積的變化

Figure 2. The pathomorphological changes of the hippocampal CA1 and cortical neurons at different time points after cerebral ischemia reperfusion.

圖2 腦缺血再灌注后不同時(shí)點(diǎn)海馬CA1區(qū)和皮質(zhì)區(qū)神經(jīng)細(xì)胞的病理形態(tài)學(xué)變化

Figure 3. The pyroptosis of the hippocampal CA1 and cortical neurons at different time points after cerebral ischemia reperfusion. Mean±SD.n=5.*P<0.05vssham group;#P<0.05vsMCAO/R 6 h group.

圖3 腦缺血再灌注后不同時(shí)點(diǎn)海馬CA1區(qū)和皮質(zhì)區(qū)神經(jīng)細(xì)胞焦亡的比較

4 腦缺血再灌注后不同時(shí)點(diǎn)海馬和皮質(zhì)區(qū)NLRP3、pro-caspase-1、cleaved caspase-1及IL-1β蛋白表達(dá)的變化

腦缺血再灌注后，腦組織NLRP3蛋白表達(dá)顯著高于假手術(shù)組。在海馬區(qū)，隨著再灌注時(shí)間的延長(zhǎng)，NLRP3蛋白表達(dá)不斷增加，MCAO/R 24 h組的表達(dá)水平最高，MCAO/R 12 h組和MCAO/R 24 h組的NLRP3蛋白表達(dá)顯著高于MCAO/R 6 h組(P<0.05)；在皮質(zhì)區(qū)，模型組各時(shí)點(diǎn)的NLRP3蛋白表達(dá)顯著高于假手術(shù)組(P<0.05)，以MCAO/R 6 h組的表達(dá)水平最高，隨后NLRP3蛋白表達(dá)緩慢下降，見(jiàn)圖4。

Figure 4. The protein expression of NLRP3, pro-caspase-1, cleaved caspase-1 and IL-1β in the hippocampus CA1 and cortical areas at different time points after cerebral ischemia reperfusion. Mean±SD.n=5.*P<0.05vssham group;#P<0.05vsMCAO/R 6 h group;△P<0.05vsMCAO/R 12 h group.

圖4 腦缺血再灌注后不同時(shí)點(diǎn)海馬CA1區(qū)和皮質(zhì)區(qū)NLRP3、pro-caspase-1、cleaved caspase-1及IL-1β蛋白表達(dá)的比較

腦缺血再灌注后，腦組織pro-caspase-1的蛋白表達(dá)顯著增加。在海馬區(qū)，模型組各時(shí)點(diǎn)的pro-caspase-1蛋白表達(dá)顯著高于假手術(shù)組(P<0.05)。在皮質(zhì)區(qū)，MCAO/R 6 h組和12 h組的pro-caspase-1蛋白表達(dá)無(wú)顯著增加(P>0.05)，而MCAO/R 24 h組的pro-caspase-1蛋白表達(dá)顯著增高(P<0.05)，見(jiàn)圖4。

腦缺血再灌注后，腦組織的cleaved caspase-1蛋白表達(dá)顯著增加。在海馬區(qū)，模型組各時(shí)點(diǎn)cleaved caspase-1蛋白的表達(dá)增高(P<0.05)，以MCAO/R 12 h組的增高最顯著(P<0.05)。在皮質(zhì)區(qū)，在皮質(zhì)區(qū)，MCAO/R 6 h組和MCAO/R 12 h組的cleaved caspase-1蛋白表達(dá)無(wú)明顯增高(P>0.05)，而MCAO/R 24 h組的cleaved caspase-1蛋白表達(dá)明顯增高(P<0.05)，見(jiàn)圖4。

腦缺血再灌注后，腦組織IL-1β蛋白表達(dá)顯著增加。在海馬區(qū)，MCAO/R 6 h組和12 h組的IL-1β蛋白表達(dá)無(wú)顯著變化，而MCAO/R 24 h組的IL-1β蛋白表達(dá)水平顯著增高(P<0.05)。在皮質(zhì)區(qū)，MCAO/R 6 h組的IL-1β蛋白表達(dá)增高(P<0.05)，隨著再灌注時(shí)間延長(zhǎng)，IL-1β蛋白表達(dá)逐漸下降，見(jiàn)圖4。

討 論

細(xì)胞焦亡是一種典型依賴于炎癥的程序性細(xì)胞死亡方式，其經(jīng)典焦亡途徑依賴于caspase-1介導(dǎo)。當(dāng)機(jī)體遭受有害刺激時(shí)，胞漿內(nèi)炎癥體的形成，使無(wú)活性的pro-caspase-1裂解形成有活性的cleaved caspase-1，cleaved caspase-1可以誘導(dǎo)細(xì)胞膜穿孔使細(xì)胞溶解、死亡，胞內(nèi)物質(zhì)外釋引起炎癥反應(yīng)；同時(shí)促進(jìn)白介素-1β和白介素-18等促炎癥細(xì)胞因子的成熟分泌，導(dǎo)致細(xì)胞焦亡發(fā)生[9-10]。

研究表明，細(xì)胞焦亡現(xiàn)象廣泛存在于炎癥類疾病的發(fā)生發(fā)展中[11-13]，其中caspase-1介導(dǎo)的經(jīng)典焦亡途徑在帕金森癥、阿爾茲海默癥、亨廷頓舞蹈癥及神經(jīng)炎伴退行性神經(jīng)功能缺損等神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要的作用[14-16]。Caspase-1的表達(dá)在缺血后神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞以及小膠質(zhì)細(xì)胞顯著增加，阻斷caspase-1的表達(dá)能減輕腦缺血后神經(jīng)損傷[17]。Caspase-1的激活由一系列能形成炎癥小體的模式識(shí)別受體觸發(fā)，NLRP3作為固有免疫重要的模式識(shí)別受體參與了缺血后的炎癥損傷，NLRP3炎癥小體既能識(shí)別各類外源性病原體，又能感知自身內(nèi)源性危險(xiǎn)信號(hào)(如缺血再灌注損傷)，銜接天然免疫與獲得性免疫反應(yīng)，是炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)的關(guān)鍵分子通路。Fann等[7]通過(guò)體內(nèi)外研究均發(fā)現(xiàn)腦缺血缺氧后 NLRP3、ASC 及caspase-1等蛋白表達(dá)增加，NLRP3 炎癥小體激活，IL-1β 和 IL-18 分泌增多，而caspase-1抑制劑可抑制神經(jīng)元死亡，減輕缺血再灌注損傷。這些研究均證實(shí)經(jīng)典細(xì)胞焦亡的相關(guān)調(diào)控因子參與了缺血性腦損傷，細(xì)胞焦亡可能是腦卒中干預(yù)的潛在靶點(diǎn)。然而，目前研究仍存在許多問(wèn)題，如細(xì)胞焦亡的檢測(cè)方法、細(xì)胞焦亡在腦缺血再灌注損傷過(guò)程中動(dòng)態(tài)演變及分布特點(diǎn)仍需進(jìn)一步明確。

腦組織中大腦皮質(zhì)及海馬區(qū)是對(duì)缺血缺氧損害敏感的區(qū)域。本文研究了腦缺血再灌注后不同時(shí)間細(xì)胞焦亡在海馬及皮質(zhì)區(qū)的變化特點(diǎn)，并從NLRP3介導(dǎo)的經(jīng)典焦亡途徑探究其機(jī)制。細(xì)胞焦亡在形態(tài)學(xué)上同時(shí)具有壞死和凋亡的特征。與細(xì)胞凋亡相似的是，發(fā)生焦亡的細(xì)胞同樣會(huì)出現(xiàn)細(xì)胞核濃縮、染色質(zhì)DNA斷裂以及TUNEL染色陽(yáng)性。細(xì)胞焦亡與細(xì)胞凋亡均屬于細(xì)胞程序性死亡方式，但是焦亡并不由傳統(tǒng)的凋亡分子caspase-3介導(dǎo)，而是由caspase-1介導(dǎo)。因此，本研究采用cleaved caspase-1和TUNEL免疫熒光雙染檢測(cè)細(xì)胞焦亡，同一細(xì)胞cleaved caspase-1染色和TUNEL染色雙陽(yáng)性可判斷為細(xì)胞焦亡。焦亡檢測(cè)結(jié)果表明：腦缺血再灌注后海馬及皮質(zhì)區(qū)均出現(xiàn)細(xì)胞焦亡現(xiàn)象，尤以MCAO/R 12 h和24 h最明顯。這一作用與神經(jīng)損傷的變化基本一致，證實(shí)了細(xì)胞焦亡參與了腦缺血再灌注后神經(jīng)細(xì)胞損傷。NLRP3介導(dǎo)的經(jīng)典焦亡途徑相關(guān)蛋白檢測(cè)結(jié)果表明，NLRP3和IL-1β蛋白表達(dá)在海馬區(qū)和皮質(zhì)區(qū)的變化趨勢(shì)不同，隨著再灌注時(shí)間延長(zhǎng)，NLRP3和IL-1β蛋白表達(dá)在海馬區(qū)逐漸上升，而在皮質(zhì)區(qū)表達(dá)先升高再逐漸下降，推測(cè)經(jīng)典焦亡途徑激活部位的皮質(zhì)區(qū)先于海馬區(qū)。Pro-caspase-1和cleaved caspase-1蛋白表達(dá)在海馬區(qū)3個(gè)時(shí)點(diǎn)均升高，以MCAO/R 12 h表達(dá)顯著，而皮質(zhì)區(qū)只在MCAO/R 24 h表達(dá)顯著，說(shuō)明腦缺血再灌注損傷后NLRP3/ caspase-1焦亡軸激活部位主要在海馬區(qū)。本研究證實(shí)細(xì)胞焦亡參與了缺血性神經(jīng)損傷，經(jīng)典焦亡途徑在海馬和皮質(zhì)區(qū)均發(fā)揮重要調(diào)控作用，皮質(zhì)區(qū)對(duì)NLRP3/ caspase-1焦亡軸的激活最敏感，而海馬區(qū)對(duì)NLRP3/ caspase-1焦亡軸的激活持續(xù)時(shí)間比皮質(zhì)區(qū)長(zhǎng)。提示海馬區(qū)是腦缺血后神經(jīng)細(xì)胞焦亡和炎癥反應(yīng)誘發(fā)的繼發(fā)性神經(jīng)損傷的主要部位，但以何種途徑激活經(jīng)典細(xì)胞焦亡參與腦缺血再灌注神經(jīng)損傷仍需進(jìn)一步探討。