李余星 秦冰杰 劉小虎 譚 瀟 鄭 軍 鄭衛(wèi)紅△

（1三峽大學(xué)醫(yī)學(xué)院 國家中藥藥理科研三級(jí)實(shí)驗(yàn)室，宜昌443002；2三峽大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院肝膽胰外科研究所，宜昌443003；3宜都市第一人民醫(yī)院藥劑科，宜昌443300）

由軀體感覺神經(jīng)直接損傷或疾病引起的疼痛稱為神經(jīng)病理性疼痛，是臨床最為難治的慢性疼痛之一。長春生物堿類（長春新堿，vincristine, VCR）是目前臨床常用的抗腫瘤化療藥物，在抗腫瘤治療中發(fā)揮重要作用。然而，目前國內(nèi)外有越來越多的報(bào)道提示[1～4]，其單用或合用在抗腫瘤的同時(shí)會(huì)產(chǎn)生神經(jīng)損傷毒性作用，誘發(fā)痛覺過敏和超敏反應(yīng)，稱化療誘導(dǎo)的神經(jīng)病理性疼痛(chemotherapy-induced neuropathic pain, CINP)，簡稱化療痛。此疼痛制約了腫瘤的進(jìn)一步加量化療，并降低了腫瘤病人的生活質(zhì)量，也降低了長春生物堿類藥物的抗腫瘤療效[5～7]。目前其發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明，并缺乏有效的治療措施。因此，研究化療痛的發(fā)生發(fā)展機(jī)制、尋找能減輕或消除化療痛發(fā)生發(fā)展的藥物和方法是當(dāng)今國內(nèi)外該領(lǐng)域里亟待解決的課題。

隨著對神經(jīng)病理性疼痛研究的不斷深入，藥物治療的新靶點(diǎn)不斷被發(fā)現(xiàn)，如小膠質(zhì)細(xì)胞通路[8]、P38 MAPK通路[9]、神經(jīng)生長因子抗體[10]、電壓門控鈉離子通道阻滯劑、WNT信號(hào)通路抑制劑[11]等。其中，本課題組前期研究[12]已證實(shí)脊髓背角小膠質(zhì)細(xì)胞活化通路參與了VCR誘導(dǎo)的神經(jīng)病理性疼痛的發(fā)生、發(fā)展。而之前已有研究表明[13,14]，小膠質(zhì)細(xì)胞的激活與Notch信號(hào)通路激活密切相關(guān)，抑制Notch信號(hào)通路可顯著抑制小膠質(zhì)細(xì)胞活化，從而降低促炎細(xì)胞因子（TNF-α、IL-1β和IL-6）的表達(dá)，減輕神經(jīng)元的損傷。 Sun 等人的研究也發(fā)現(xiàn)[15]，大鼠坐骨神經(jīng)損傷引起神經(jīng)病理性疼痛，其脊髓Notch信號(hào)的表達(dá)和活性顯著增加，痛域值顯著降低；抑制Notch信號(hào)通路則逆轉(zhuǎn)了大鼠神經(jīng)損傷后產(chǎn)生的痛覺過敏。但化療藥VCR誘導(dǎo)的神經(jīng)病理性疼痛發(fā)生發(fā)展是否也與脊髓背角Notch信號(hào)通路的活化相關(guān)，能否通過抑制Notch信號(hào)通路的活化來緩解化療痛大鼠痛覺過敏反應(yīng)，目前尚無相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道。本研究建立VCR誘導(dǎo)神經(jīng)病理性疼痛大鼠模型，并通過鞘內(nèi)注射Notch信號(hào)通路活化的抑制劑DAPT，檢測大鼠痛閾值變化及其Notch信號(hào)通路活化胞內(nèi)段NICD、核內(nèi)下游基因Hes1 mRNA的表達(dá)，從Notch信號(hào)通路進(jìn)一步探討化療誘導(dǎo)的神經(jīng)病理性發(fā)生發(fā)展機(jī)制，為治療化療痛尋找新的靶點(diǎn)提供理論依據(jù)。

方 法

1.材料

（1）主要試劑：Notch信號(hào)通路抑制劑DAPT購自Selleck公司（批號(hào)：S2215）；注射用硫酸長春新堿購自深圳萬樂藥業(yè)有限公司（批號(hào)：H44021772）；Anti-NICD antibody（Abcam公司）；正常山羊血清封閉液（谷歌生物）。

（2）實(shí)驗(yàn)儀器：Von Frey電子測痛儀（深圳瑞沃德公司）；PL-200熱刺痛儀（成都泰盟科技有限公司）；DM.4-YLS-21A冷熱板測痛儀（北京達(dá)美達(dá)科技有限公司）；迷你轉(zhuǎn)印電泳儀（北京六一儀器廠）；熒光倒置顯微鏡（尼康TE-2000，日本）；全波長酶標(biāo)儀（Tecan Austria GmbH公司）。

（3）實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：實(shí)驗(yàn)采用三峽大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供SPF級(jí)Sprague-Dawley健康雌性大鼠,體重在220～240 g左右（動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（鄂）2011-0012）。大鼠飼養(yǎng)環(huán)境恒溫(22±2)℃，濕度為(60±5)%，12 h交替光照，自由攝食飲水，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物設(shè)施使用許可證號(hào)：SYXK（鄂）2011-0061）。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物適應(yīng)環(huán)境3 d后行鞘內(nèi)置管術(shù)，手術(shù)成功的大鼠按熱痛閾值大小，采用隨機(jī)區(qū)組法進(jìn)行分組，并單籠飼養(yǎng)。動(dòng)物使用經(jīng)過倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)。

2.方法

（1）大鼠鞘內(nèi)置管：縱向切開約2 cm的大鼠髂棘水平連線為中點(diǎn)的皮膚，分離剔除大鼠L5、L6腰椎棘突周圍的肌肉組織，充分暴露進(jìn)針點(diǎn)。用1 ml注射器的針頭輕探測，出現(xiàn)落空感并伴隨大鼠側(cè)向甩尾動(dòng)作，即為精準(zhǔn)進(jìn)管位置，快速在該位置插入注滿高壓消毒的生理鹽水的PE 10管。若再次觀察到大鼠側(cè)向甩尾，并發(fā)現(xiàn)PE 10管中流入腦脊液，說明初步置管成功。將大鼠背頸脖處做一切口，灌胃針由此切口穿入沿皮下至大鼠背部刀口將置管引出，立即熱熔封閉PE 10管并縫合傷口。對大鼠進(jìn)行消毒處理，肌肉注射青霉素鈉8萬IU/只，防止傷口感染。置管三天后，大鼠鞘內(nèi)注射2 %利多卡因10 μl。若大鼠的雙后肢出現(xiàn)癱軟并拖地行走且在30 min后恢復(fù)正常行走，表明該大鼠可用于實(shí)驗(yàn)；反之，則剔除。

（2）實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及化療痛動(dòng)物模型的建立：將已鞘內(nèi)插管的SD大鼠進(jìn)行熱痛行為學(xué)實(shí)驗(yàn)，并挑選出熱痛閾值合格SD大鼠，按熱痛閾值大小篩選實(shí)驗(yàn)大鼠并隨機(jī)區(qū)組分為4組，每組10只：①對照組 (control)：鞘內(nèi)注射(i.t.) DMSO (10 %, 1 μl)共8次(D0～D7)；再隔日腹腔注射(i.p.)生理鹽水0.5 ml /100 g，共4次(D1、D3、D5、D7)；②VCR致化療痛模型組 (VCR)：i.t.DMSO (10%, 1 μl)共8次(D0～D7)；再隔日i.p.VCR 125 μg/kg，共4次(D1、D3、D5、D7)；③DAPT多次給藥+ VCR組(DAPT(8)+VCR)：i.t.γ分泌酶抑制劑-DAPT（Notch信號(hào)通路抑制劑）(50 μg/μl, 1 μl)共8次(D0 ～ D7)；再 間 隔 日 i.p.VCR 125 μg/kg， 共 4 次 (D1、D3、D5、D7)；④DAPT單次給藥+ VCR組 (DAPT(1)+VCR)：i.t.DAPT (50 μg/μl, 1 μl) 共 1 次 (D0)；i.t.DMSO (50 μg/μl, 1 μl)共 7 次 (D1 ～ D7)；再間隔 日 i.p.VCR 125 μg/kg， 共 4次 (D1、D3、D5、D7)。以首次鞘內(nèi)給藥DAPT為第0 d，即D0。在D0、D8測定4組實(shí)驗(yàn)大鼠機(jī)械痛、熱痛和冷痛閾值。并于D9處理大鼠。0.3%戊巴比妥鈉(30 mg/kg)對實(shí)驗(yàn)大鼠進(jìn)行深度麻醉，一部分大鼠用4%多聚甲醛進(jìn)行活體灌注固定，并取出脊髓腰膨大L4-L6組織，放4%多聚甲醛中浸泡，置4℃冰箱內(nèi)備用。另一部分已麻醉大鼠置于冰盒上取出新鮮的L4-L6脊髓組織，放入預(yù)冷的生理鹽水中沖洗脊髓，再放入冷凍盒中，于-80℃中保存?zhèn)溆谩?/p>

（3）行為學(xué)檢測：將大鼠置于有機(jī)玻璃籠內(nèi)適應(yīng)環(huán)境30 min，待大鼠安靜后，分別使用用電子von Frey測痛儀、熱刺痛儀器和冷板測痛儀測定痛閾值。左右足各測3次，刺激間隔15 min，記錄大鼠出現(xiàn)撤足反應(yīng)時(shí)測痛儀所顯示的刺激強(qiáng)度大小，計(jì)算左右共6次刺激痛閾值結(jié)果的平均值，分別作為大鼠機(jī)械痛、熱痛和冷痛的刺激痛閾值。

（4）免疫組化法檢測NICD蛋白：取固定好的脊髓腰膨大段L4-L6，制備成脊髓組織石蠟切片。取切片脫蠟后分別用pH 9.0 EDTA對NICD切片進(jìn)行抗原修復(fù)。經(jīng)3% H2O2孵育，5% BSA室溫封閉，加入NICD（稀釋度1:200, ab8925, abcam） ，4℃孵育過夜，再加入二抗：HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG(1:500, GB23303, Servicebio)，避光室溫下作用1 h，DAB顯色和蘇木精復(fù)染細(xì)胞核，封片后立即于顯微鏡下觀察并拍照，并用圖像分析軟件進(jìn)行灰度分析。

（5）Western blot檢測NICD蛋白：在冰上迅速取出脊髓腰膨大部位（L4-L6節(jié)段），加入10倍于組織塊的冰凍裂解液后用電動(dòng)勻漿器進(jìn)行勻漿，4℃下12 000 rpm離心10 min，用BCA法進(jìn)行蛋白定量測定。配置12%的分離膠，和5%的濃縮膠，濃縮膠電泳條件為80 V恒壓，分離膠電泳條件為120 V恒壓，當(dāng)溴酚藍(lán)染料前端電泳至分離膠末端處時(shí)即停止電泳，轉(zhuǎn)膜后5%脫脂奶粉封閉1 h，加入NICD，GAPDH一抗：NICD （稀釋度1:500,ab8925, abcam）；GAPDH （稀釋度1:10000, sc25778,santa cruz biotechnology），4℃孵育過夜后TBST洗膜3次，每次5 min。加入TBST稀釋的二抗：HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG (1:3 000, GB23303,Servicebio)，室溫孵育30 min后TBST洗膜3次，每次5 min。ECL反應(yīng)、顯、定影后使用圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

（6）RT-PCR法檢測Hes1 mRNA：采用Trizol法提取每一脊髓組織的總RNA。按照TaKaRa說明書步驟依次加入各試劑反轉(zhuǎn)錄，各組產(chǎn)物cDNA用于PCR或者-20℃保存。用Primer 5設(shè)計(jì)引物如下：Hes1-F：5' CTACCCCAGCCAGTGTCAAC3'；Hes1-R：5' CCCCAACACGCTCGGGTCTG3'。GAPDH-F：5' GCAAGTTCAACGGCACAG3'；GAPDH-R：5' CTCAACAGTATAAAGAGC3'。按照NovoStar Green PCR Mix說明依次加入上下游引物、各組產(chǎn)物cDNA、分子生物水制備25 μl PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系的混合物，混勻后置于PCR儀進(jìn)行PCR擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)。反應(yīng)結(jié)束后進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。配制2%瓊脂糖凝膠，上樣，電泳，電壓120 V，電流50 mA，電泳時(shí)間1 h。紫外凝膠成像儀檢測。采用軟件Image-Pro Plus 6對電泳條帶進(jìn)行灰度值(IOD)分析。

3.統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用SPSS 13.0軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，痛閾值分析采用隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)的方差分析，灰度值比較采用單因素方差分析，并用least significant difference (LSD) 法做兩兩比較，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差() 表示，P? 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1.大鼠痛閾值的變化

圖1 各組大鼠機(jī)械痛(A)、熱痛(B)、冷痛(C)閾值變化 (n=10,D)Fig.1 The change of the mechanical (A), thermal (B), cold(C) pain threshold in rats (n=10,D)

圖1為各組大鼠機(jī)械痛(A)、熱痛(B)及冷痛(C)閾值變化。給藥前各組大鼠行為學(xué)痛閾值差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。造模第8 d檢測各組大鼠痛閾值顯示：與對照組比較，VCR組大鼠機(jī)械痛、熱痛及冷痛痛閾值均顯著降低(P?0.01)，提示VCR誘導(dǎo)大鼠產(chǎn)生痛覺過敏反應(yīng)，即成功建立大鼠化療痛模型；與VCR組比較，DAPT多次給藥+ VCR組和DAPT單次給藥+ VCR組機(jī)械痛、熱痛及冷痛痛閾值明顯升高（P?0.05或P?0.01），表明當(dāng)Notch信號(hào)通路活化被抑制后，化療痛大鼠的痛覺敏化反應(yīng)得到緩解；與DAPT多次給藥+ VCR組比較，DAPT單次給藥+ VCR組大鼠機(jī)械痛、熱痛及冷痛痛閾值沒有差異(P＞0.05)，表明Notch信號(hào)通路抑制劑DAPT多次給藥和單次給藥可以達(dá)到相同作用效應(yīng)。以上結(jié)果提示VCR隔日腹腔注射4次，可成功建立VCR誘導(dǎo)大鼠化療痛模型，Notch信號(hào)通路抑制劑DAPT可在初次鞘內(nèi)注射后即可達(dá)到抑制Notch信號(hào)通路的作用。

2.免疫組化法檢測大鼠脊髓背角NICD蛋白的表達(dá)

圖2為免疫組化檢測各組大鼠NICD表達(dá)(A)及NICD平均灰度值(B)。與對照組比較，VCR組NICD的表達(dá)顯著增加，其平均灰度值明顯升高(P?0.01)，表明活化的Notch信號(hào)通路參與VCR誘導(dǎo)的神經(jīng)病理性疼痛的發(fā)生與發(fā)展；與VCR組比較，DAPT多次給藥+ VCR組和DAPT單次給藥+ VCR組NICD表達(dá)和平均灰度值均顯著降低(P?0.01)，表明抑制Notch信號(hào)通路活化可緩解VCR誘導(dǎo)的大鼠化療痛；與DAPT多次給藥+VCR組比較，DAPT單次給藥+ VCR組NICD的表達(dá)無顯著變化(P＞0.05)，表明單次鞘內(nèi)注射DAPT即可阻斷Notch信號(hào)通化。

3.Western Blot法檢測大鼠脊髓背角NICD蛋白的表達(dá)

與對照組比較，VCR組大鼠NICD表達(dá)顯著升高(P?0.01)；與VCR組比較，DAPT多次給藥+ VCR組和DAPT單次給藥+ VCR組大鼠NICD表達(dá)均降低，且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P?0.01)，表明抑制Notch信號(hào)通路的活化，大鼠NICD的表達(dá)下調(diào)；與DAPT多次給藥+ VCR組比較，DAPT單次給藥+ VCR組大鼠NICD的表達(dá)并無變化，表明單次給予DAPT即可抑制Notch信號(hào)通路的活化（見圖3）。

4.RT-PCR法檢測大鼠脊髓背角Hes1 mRNA的表達(dá)水平

與對照組比較，VCR組大鼠Notch信號(hào)通路核內(nèi)下游基因Hes1 mRNA表達(dá)水平顯著升高(P?0.01)，表明VCR激活Notch信號(hào)通路誘導(dǎo)大鼠產(chǎn)生神經(jīng)病理性疼痛。與VCR組比較，DAPT多次給藥+ VCR組和DAPT單次給藥+ VCR組大鼠Hes1 mRNA表達(dá)水平均顯著降低(P?0.01)，表明抑制Notch信號(hào)通路的活化，VCR誘導(dǎo)的化療痛大鼠的Notch信號(hào)通路核內(nèi)下游基因Hes1 mRNA表達(dá)水平降低。與DAPT多次給藥+ VCR組比較，DAPT單次給藥+ VCR組大鼠Hes1 mRNA表達(dá)水平并無變化(P＞0.05)，表明單次給予DAPT即可抑制Notch信號(hào)通路的活化（見圖4）。

討 論

Notch信號(hào)通路由Notch受體、Notch配體（DSL蛋白）、NICD轉(zhuǎn)運(yùn)分子和下游靶基因如Hes、Hey等信號(hào)傳導(dǎo)分子等組成[16]。Notch信號(hào)是通過相鄰細(xì)胞的Notch配體與受體相互作用而產(chǎn)生，Notch蛋白經(jīng)過三次剪切，由胞內(nèi)段(NICD)釋放入胞質(zhì)，并進(jìn)入細(xì)胞核與轉(zhuǎn)錄因子CSL結(jié)合, 形成NICD/CSL轉(zhuǎn)錄激活復(fù)合體，從而激活HES、HEY、HERP等堿性-螺旋-環(huán)-螺旋 (basichelix-loophelix, bHLH)轉(zhuǎn)錄抑制因子家族的靶基因，發(fā)揮生物學(xué)作用。Xie等[17]發(fā)現(xiàn)，絲線結(jié)扎坐骨神經(jīng)干建立坐骨神經(jīng)結(jié)扎損傷模型(chronic constriction injury,CCI)和選擇性坐骨神經(jīng)損傷模型(spared nerve injury, SNI)時(shí)大鼠機(jī)械和熱痛域值顯著降低，鞘內(nèi)注射γ-分泌酶抑制劑DAPT，可明顯增加大鼠的機(jī)械痛閾值和熱輻射痛閾值，表明抑制Notch信號(hào)通路可預(yù)防或逆轉(zhuǎn)早期或晚期的神經(jīng)損傷型神經(jīng)病理性疼痛；而作為Notch信號(hào)傳導(dǎo)途徑配體的jagged-1肽則呈劑量依賴性地誘導(dǎo)正常大鼠的神經(jīng)性疼痛樣行為，提示Notch通路的活化可能參與了神經(jīng)損傷引起神經(jīng)病理性疼痛的產(chǎn)生和發(fā)展。

圖2 各組大鼠脊髓背角NICD的表達(dá)(A)及平均灰度值(B) (n=10,D)（免疫組化法 ×200）Scale bar=200 μmFig.2 Expression (A) and integrated optical density (B) of NICD in spinal dorsal horn of rats (n=10,D)(Immunohistochemistry ×200) Scale bar=200 μm

圖3 各組大鼠脊髓背角NICD表達(dá)變化 (n=10,D)Fig.3 Expression of NICD in spinal dorsal horn of rats(n=10,D)

圖4 各組大鼠脊髓背角Hes1 mRNA表達(dá)水平變化(n=10,D)Fig.4 Expression of Hes1 mRNA in spinal dorsal horn of rats (n=10,D)

本研究參考文獻(xiàn)方法[18]用化療藥物長春新堿腹腔注射建立化療藥誘導(dǎo)大鼠神經(jīng)病理性疼痛模型，結(jié)果顯示：VCR組大鼠機(jī)械痛閾值、熱痛閾值和冷痛閾值均顯著降低，證明化療痛模型成功建立。同時(shí)，VCR組化療痛大鼠脊髓背角Notch信號(hào)通路活化標(biāo)志物NICD蛋白、核內(nèi)下游基因Hes1 mRNA表達(dá)均顯著增高。鞘內(nèi)給予Notch信號(hào)通路抑制劑DAPT后，發(fā)現(xiàn)化療痛大鼠的痛閾值均顯著提高，其痛覺過敏反應(yīng)得到明顯緩解，大鼠脊髓背角NICD蛋白、Hes1 mRNA表達(dá)均明顯降低，且DAPT單次鞘內(nèi)注射與多次鞘內(nèi)注射的抑制作用無差異(P＞0.05)。提示Notch信號(hào)通路的活化在VCR誘導(dǎo)的神經(jīng)病理性疼痛中發(fā)揮關(guān)鍵作用。

該研究表明VCR誘導(dǎo)的大鼠神經(jīng)病理性疼痛與Notch信號(hào)通路活化密切相關(guān)，且單次鞘內(nèi)注射DAPT即可產(chǎn)生顯著的抑制效應(yīng)，從而達(dá)到緩解化療痛的療效。且本課題組前期研究已證實(shí)[12]化療藥誘導(dǎo)的神經(jīng)病理性疼痛的發(fā)生發(fā)展與小膠質(zhì)細(xì)胞活化通路相關(guān)。由此我們推測化療藥誘導(dǎo)神經(jīng)病理性疼痛的作用機(jī)制可能也是通過激活Notch信號(hào)通路，繼而導(dǎo)致小膠質(zhì)細(xì)胞活化通路活化，促使炎性細(xì)胞因子的釋放而產(chǎn)生的。然而，Notch信號(hào)通路活化對小膠質(zhì)細(xì)胞活化通路的激活是直接作用，還是間接作用的結(jié)果，以及而且二者之間是否存在相互遞進(jìn)的關(guān)系，尚有待進(jìn)一步研究闡明?？傊?，本研究結(jié)果提示：抑制Notch信號(hào)通路可作為治療化療藥誘導(dǎo)的神經(jīng)病理性疼痛的新途徑，為臨床治療化療痛提供了新思路。