盧建芳，黎克純，雷福厚，周菊英

(1.廣西民族大學(xué) 化學(xué)化工學(xué)院，南寧 530006； 2.廣西林產(chǎn)化學(xué)與工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南寧 530006)

脂肪酶是一類重要的?；饷福１挥脕?lái)催化酯的合成、水解、醇解及酯交換等反應(yīng)。由于脂肪酶較高的活性、穩(wěn)定性、區(qū)域和立體選擇性，被廣泛應(yīng)用于洗滌劑、油脂、皮革、紡織、有機(jī)合成和制藥行業(yè)等多個(gè)領(lǐng)域[1-3]。但是游離脂肪酶的可操作性和穩(wěn)定性較差，限制了其應(yīng)用。當(dāng)脂肪酶暴露在高溫或有機(jī)溶劑中，會(huì)發(fā)生變性引發(fā)活性損失[4]。此外，由于高成本，難以回收和再利用以及污染產(chǎn)品等缺陷使得可溶性酶在工業(yè)過(guò)程中的廣泛應(yīng)用受到限制。因此，必須尋找一種有效的酶處理方法[5]，提高其操作穩(wěn)定性，且易于分離回收。目前，固定化方法基本分為兩種類型：載體和無(wú)載體[6]。無(wú)載體最新技術(shù)——交聯(lián)脂肪酶聚集體(CLEAs)是利用蛋白沉淀劑，將溶解狀態(tài)的酶進(jìn)行物理沉淀得到酶聚集體，隨后利用交聯(lián)劑與酶聚集體分子上的氨基發(fā)生Schiff堿反應(yīng)，生成不溶水的交聯(lián)脂肪酶聚集體。載體固定化是利用載體固定化技術(shù)即采用吸附、包埋、共價(jià)結(jié)合等方法將酶固定在載體上。兩種方法各有優(yōu)缺點(diǎn)。有載體的固定化酶不可避免地導(dǎo)致酶催化活性的稀釋[7]，而無(wú)載體酶具有較高單位酶活性[8]，避免粗酶的進(jìn)一步純化。但CLEAs具有一些缺點(diǎn)：機(jī)械穩(wěn)定性低，酶分子泄漏和難以恢復(fù)。將CLEAs與載體固定化相結(jié)合不僅可以提高CLEAs的機(jī)械強(qiáng)度而且可以根據(jù)實(shí)際需要設(shè)計(jì)不同類型的固定化酶。王冬偉等[9]將木聚糖酶聚集體固定到LKZ-128氨基型樹脂上，酶活達(dá)到190 U/g，操作穩(wěn)定性、熱穩(wěn)定性和pH穩(wěn)定性均得到提高。Gao等[10]制備了介孔氧化硅固載化脂肪酶交聯(lián)脂肪酶聚集體(CLL@MPS)，應(yīng)用于水解、酯化和轉(zhuǎn)酯反應(yīng)時(shí)，CLL@MPS展現(xiàn)出良好的穩(wěn)定性和重復(fù)使用性。Zeinali等[11]將劍豆脲酶交聯(lián)聚集體包埋在聚丙烯酰胺凝膠中，考察了酶活最佳條件，顯示此方法可明顯提高脲酶的儲(chǔ)存穩(wěn)定性和操作穩(wěn)定性。

松香含有共軛二烯結(jié)構(gòu)和羧酸基團(tuán)，有利于形成機(jī)械強(qiáng)度高、耐熱性良好的功能高分子，可以結(jié)合多種生物分子。磁性具有良好的磁導(dǎo)向性，且通過(guò)外加磁場(chǎng)快速進(jìn)行分離和回收。本研究將CLEAs和載體固定化方法相結(jié)合，制備固定化交聯(lián)脂肪酶聚集體(CLEAs-L)。首先，通過(guò)沉淀制備脂肪酶聚集體，然后用戊二醛交聯(lián)。其次，將含有—NH2的磁性松香基高分子作為載體固定CLEAs，最終得到固定化CLEAs-L。此外，研究了固定化CLEAs-L的最佳制備條件，表面和微孔結(jié)構(gòu)，活性和穩(wěn)定性，以期該技術(shù)獲得更好的催化性能。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

脂肪酶(BR)，酚酞(Ind)，橄欖油(CP)，聚乙烯醇(CP，相對(duì)分子質(zhì)量為1 750±50)，戊二醛(CP)，二氯亞砜(CP)，氫氧化鈉、無(wú)水乙醇、十二水合磷酸二鈉、磷酸二氫鉀、1，4-二氧六環(huán)、甲基丙烯酸、丙烯酸、過(guò)氧化二苯甲酰，均為分析純。馬來(lái)松香丙烯酸乙二醇酯，廣西林產(chǎn)化學(xué)與工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供。

SYC-15超級(jí)恒溫水浴鍋；Scientz-10N冷凍干燥機(jī)；ZJ-2B磁天平；SUPRA 55 Sapphire場(chǎng)發(fā)射掃描電子顯微鏡，德國(guó)卡爾蔡司(CARL ZEISS)公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 磁性松香基高分子的制備[12]

取4.2 g甲基丙烯酸、1.8 g丙烯酸和20.0 g馬來(lái)松香丙烯酸乙二醇酯，溶于50 mL乙酸乙酯后，再加入0.06 g過(guò)氧化二苯甲酰，超聲20 min后再加入3.2 g FeCl3·6H2O、1.4 g FeCl2·4H2O及100 mL蒸餾水，繼續(xù)超聲30 min，然后400 r/min攪拌，緩慢加熱至80℃，迅速加入25 mL 質(zhì)量分?jǐn)?shù)25%的氨水，保溫6 h。通過(guò)外加磁場(chǎng)分離出磁性高分子，并用無(wú)水乙醇和去離子水各30mL洗滌5次，得到磁性松香基固體。

取5 g磁性松香基固體加入5 mL吡啶中，冰浴條件下緩慢滴加15 mL二氯亞砜，反應(yīng)4 h后減壓抽濾。再向其中加入溶有5 mL乙二胺的10 mL 1，4-二氧六環(huán)的溶液。常溫條件下，磁力攪拌反應(yīng)2 h，在外加磁場(chǎng)的作用下固液分離并用蒸餾水反復(fù)洗滌，得到磁性松香基高分子。

1.2.2 脂肪酶聚集體的制備

將0.4 g脂肪酶溶于pH 7.5的磷酸鹽緩沖溶液中，0℃下磁力攪拌1 h。-10℃、8 000 r/min離心10 min取上層清液，冰浴下加入一定量的沉淀劑(無(wú)水乙醇)，反應(yīng)0.5 h，8 000 r/min離心10 min，得脂肪酶聚集體。取脂肪酶聚集體，冷凍干燥，測(cè)定其活性，確定聚集條件。

1.2.3 交聯(lián)脂肪酶聚集體的制備

取25 mL脂肪酶聚集體懸浮液(將0.4 g脂肪酶制得的酶聚集體放入25 mL磷酸鹽緩沖溶液中超聲分散)置于冰浴中，緩慢滴加一定量戊二醛溶液,輕微攪拌,交聯(lián)反應(yīng)一段時(shí)間，6 000 r/min離心10 min，棄去上清液，用pH 7.5的磷酸鹽緩沖液反復(fù)洗滌沉淀。得到交聯(lián)脂肪酶聚集體，測(cè)定酶活力，確定交聯(lián)條件。

1.2.4 磁性松香基高分子載體固定交聯(lián)脂肪酶聚集體的制備

將0.5 g磁性松香基高分子載體和0.2 g交聯(lián)脂肪酶聚集體放入20 mL pH 7.5的磷酸鹽緩沖溶液中，加一定量戊二醛。冰浴中交聯(lián)反應(yīng)1 h。外加磁場(chǎng)分離固體，冷凍干燥，測(cè)定固定化CLEAs-L活力，確定二次交聯(lián)條件。

1.2.5 固定化脂肪酶的制備

0.4 g脂肪酶溶解在100 mL pH 7.5的磷酸鹽緩沖溶液中，磁力攪拌1 h，冷凍離心取上層清液，加入如1.2.4相同量的磁性松香基高分子載體，添加1%戊二醛,冰浴交聯(lián)反應(yīng)1 h。外加磁場(chǎng)分離固體，冷凍干燥,即得固定化脂肪酶。

1.2.6 脂肪酶活性的測(cè)定[13]

游離脂肪酶和固定化酶的活性均采用橄欖油乳化法，即1 min催化產(chǎn)生1 μmol脂肪酸所需的酶量定義為1個(gè)活力單位。

固定化酶的酶活回收率=固定化酶的酶活/加入酶液的酶活×100%

固定化酶的相對(duì)活性=每組中所測(cè)酶活性值/該組中最高酶活性值×100%

1.2.7 SEM的測(cè)定

將脂肪酶聚集體、交聯(lián)脂肪酶聚集體、載體、固定化脂肪酶、固定化CLEAs-L粘在導(dǎo)電膠上，進(jìn)行噴金，然后用場(chǎng)發(fā)射掃描電子顯微鏡觀察材料的表面形態(tài)。

1.2.8 粒徑分布的測(cè)定

分別以粒徑700～1 400 μm、1 400～2 800 μm、2 800～4 200 μm和4 200～5 600 μm 4個(gè)級(jí)別對(duì)固定化CLEAs-L進(jìn)行篩分，以篩分后的700～5 600 μm固定化CLEAs-L的總質(zhì)量為基礎(chǔ)，計(jì)算不同粒徑范圍內(nèi)的固定化CLEAs-L的質(zhì)量占比。

1.2.9 酶負(fù)載量的測(cè)定

采用元素分析儀測(cè)定固定化脂肪酶和固定化CLEAs-L的氮含量，按下式計(jì)算固定化脂肪酶和固定化CLEAs-L的酶負(fù)載量。

(L+M)×N1=M×N2+L×N3

式中：L為載體的質(zhì)量，g；M為磁性松香基載體酶負(fù)載量，mg/g；N1為固定化脂肪酶或固定化CLEAs-L的氮含量,%；N2為游離脂肪酶的氮含量，即2.065%；N3為載體氮含量，0.055%。

2 結(jié)果與分析

2.1 固定化CLEAs-L制備條件的研究

2.1.1 聚集條件的確定

2.1.1.1 沉淀劑無(wú)水乙醇用量對(duì)脂肪酶聚集體活力的影響

沉淀劑通過(guò)破壞蛋白分子表面帶電狀態(tài)使蛋白質(zhì)聚集沉淀，這一過(guò)程會(huì)造成酶的空間結(jié)構(gòu)發(fā)生變形，酶分子的活性中心遭到破壞，酶活力下降[14]。高濃度的沉淀劑能使酶蛋白快速?gòu)娜芤褐芯奂⒊两迪聛?lái)，有助于酶活性中心結(jié)構(gòu)的維持；而濃度越低，聚集沉淀的速度越慢，對(duì)酶活性中心的損害就越大。與此同時(shí)，沉淀劑濃度過(guò)高，也會(huì)造成酶空間結(jié)構(gòu)變形，酶活中心受損，致使酶完全或部分失活。在脂肪酶質(zhì)量濃度2 g/L的條件下，無(wú)水乙醇用量對(duì)脂肪酶聚集體活力的影響見圖1。

圖1 無(wú)水乙醇用量對(duì)脂肪酶聚集體活力的影響

由圖1可知，隨著無(wú)水乙醇用量的增加，脂肪酶聚集體的活力也增加，當(dāng)無(wú)水乙醇用量超過(guò)30%后，酶活力反而下降。當(dāng)無(wú)水乙醇用量為30%時(shí)，脂肪酶聚集體的活力最大。

2.1.1.2 脂肪酶質(zhì)量濃度對(duì)脂肪酶聚集體活力的影響

沉淀劑無(wú)水乙醇用量為30%，加入不同質(zhì)量濃度的脂肪酶，其聚集體活力的變化見圖2。

圖2 脂肪酶質(zhì)量濃度對(duì)脂肪酶聚集體活力的影響

由圖2可知，當(dāng)沉淀劑用量一定時(shí)，脂肪酶質(zhì)量濃度過(guò)大，酶分子不能完全沉集，脂肪酶聚集體活力低，脂肪酶的質(zhì)量濃度低，沉淀劑會(huì)造成酶的三維空間結(jié)構(gòu)發(fā)生變形，活性中心會(huì)遭到破壞，酶活力下降。因此，當(dāng)脂肪酶質(zhì)量濃度為4 g/L時(shí)，所得脂肪酶聚集體活力最大。

2.1.2 交聯(lián)條件的確定

2.1.2.1 戊二醛用量對(duì)交聯(lián)脂肪酶聚集體(CLEAs-L)活力的影響

在交聯(lián)時(shí)間2 h條件下，交聯(lián)劑戊二醛用量對(duì)交聯(lián)脂肪酶聚集體活力的影響見圖3。

戊二醛既是酶交聯(lián)劑，同時(shí)也是蛋白質(zhì)變性劑。低濃度的戊二醛對(duì)酶聚集體交聯(lián)不完全或不牢固，易發(fā)生酶泄漏，而高濃度的戊二醛，有更多的機(jī)會(huì)進(jìn)攻酶的活性位點(diǎn)，導(dǎo)致酶失活的概率增大。由圖3可知，當(dāng)加入的戊二醛用量為0.3%時(shí)，酶活回收率最大。

圖3 戊二醛用量對(duì)交聯(lián)脂肪酶聚集體活力的影響

2.1.2.2 交聯(lián)時(shí)間對(duì)交聯(lián)脂肪酶聚集體活力的影響

在戊二醛用量0.3%條件下，交聯(lián)時(shí)間對(duì)交聯(lián)脂肪酶聚集體活力的影響見圖4。

圖4 交聯(lián)時(shí)間對(duì)交聯(lián)脂肪酶聚集體活力的影響

由圖4可知，交聯(lián)時(shí)間超過(guò)2 h，可能是部分未反應(yīng)的醛基繼續(xù)與CLEAs-L的活性氨基進(jìn)行反應(yīng)，增加了CLEAs-L活性位點(diǎn)的損失，致使交聯(lián)脂肪酶聚集體活力下降。與此同時(shí)，戊二醛本身就是一種酶蛋白的變性劑，隨著酶蛋白與戊二醛接觸時(shí)間的延長(zhǎng)，脂肪酶自身的酶活也會(huì)有所降低。交聯(lián)時(shí)間為2 h時(shí)，酶活回收率最大。

2.1.3 二次交聯(lián)條件的確定

2.1.3.1 戊二醛用量對(duì)固定化CLEAs-L活力的影響

在CLEAs-L與載體質(zhì)量比為1∶1條件下，戊二醛用量對(duì)固定化CLEAs-L活力的影響見圖5。

圖5 戊二醛用量對(duì)固定化CLEAs-L活力的影響

戊二醛起“手”的作用將CLEAs-L和磁性松香基高分子連接起來(lái)，實(shí)現(xiàn)載體與無(wú)載體固定化技術(shù)相結(jié)合。由圖5可知，戊二醛用量少不能有效固定交聯(lián)脂肪酶聚集體，固定化CLEAs-L酶活低。當(dāng)戊二醛過(guò)量，會(huì)交聯(lián)CLEAs-L的活性位點(diǎn)，導(dǎo)致酶失活。因此，二次交聯(lián)采用戊二醛用量為1%，固定化CLEAs-L酶活回收率最大。

2.1.3.2 交聯(lián)脂肪酶聚集體與載體質(zhì)量比對(duì)固定化CLEAs-L活力的影響

在戊二醛用量為1%條件下，交聯(lián)脂肪酶聚集體與載體質(zhì)量比對(duì)固定化CLEAs-L活力的影響見圖6。

圖6 交聯(lián)脂肪酶聚集體與載體質(zhì)量比對(duì)固定化 CLEAs-L活力的影響

由圖6可知，隨著CLEAs-L與載體質(zhì)量比增大即交聯(lián)酶聚集體的投放量增大，固定化CLEAs-L酶活回收率先增大后減小，2.5∶1時(shí)酶活回收率最大，為86.52%。當(dāng)投入過(guò)多的CLEAs-L時(shí)，可能引起過(guò)多的CLEAs-L堆積在載體上，阻止酶與底物接觸，此時(shí)雖然加入的CLEAs-L量大，但是其酶活回收率很低即有效利用的酶量較小，不經(jīng)濟(jì)實(shí)惠。

2.2 酶學(xué)性質(zhì)

2.2.1 最適溫度及最適pH(見圖7)

取若干個(gè)三角燒瓶，每瓶加入0.2 g的固定化CLEAs-L(或1 mL游離脂肪酶溶液)，pH為7.5的磷酸鹽緩沖液5 mL和4 mL聚乙烯橄欖油乳化液，將三角燒瓶置于20～70℃下反應(yīng)10 min，然后立即取出加入15 mL 95%乙醇和3滴酚酞溶液后用0.05 mol/L的NaOH溶液滴定至粉紅色，30 s內(nèi)不褪色。測(cè)酶的活性，取同組實(shí)驗(yàn)中酶活最大的值為100，其余與之相比較，選出游離脂肪酶或固定化CLEAs-L最適溫度。

取三角燒瓶若干編號(hào)，每瓶加入0.2 g的固定化CLEAs-L(或1 mL的游離脂肪酶溶液)，然后在各燒瓶中分別加入pH為5.8～8.0的磷酸鹽緩沖液，再加入4 mL的聚乙烯橄欖油乳化液，分別置于40℃(游離脂肪酶)和45℃(固定化CLEAs-L)水浴中反應(yīng)10 min，取出加入95%乙醇15 mL，滴加3滴酚酞溶液后用0.05 mol/L的NaOH溶液滴定至粉紅色，30 s內(nèi)不褪色。測(cè)定酶的活性，以同組實(shí)驗(yàn)中某次酶活最大值為100，同組之間進(jìn)行比較得到游離脂肪酶或固定化CLEAs-L的最適pH。

圖7 溫度(a)和pH(b)對(duì)固定化CLEAs-L和游離脂肪酶活性的影響

由圖7可知，固定化CLEAs-L和游離脂肪酶的最適溫度分別為45、40℃。40℃之前固定化CLEAs-L 的相對(duì)活性低于游離脂肪酶的，可能是由于高分子鏈在低溫下沒(méi)有伸展開，部分固定化CLEAs-L不能與底物接觸，沒(méi)有發(fā)生反應(yīng)。40℃之后，固定化CLEAs-L的相對(duì)活性高于游離脂肪酶的，受溫度影響變小?？赡苁谴判运上慊叻肿赢a(chǎn)生的屏蔽效應(yīng)，在較高的溫度下保護(hù)了酶的活性。同時(shí)，酶分子與載體、酶分子與酶分子多點(diǎn)連接，防止了酶分子伸展變形。因此，固定化CLEAs-L的耐熱性明顯提高[15]。

固定化CLEAs-L的最適pH為7.0，比游離脂肪酶向堿性方向移動(dòng)了0.5個(gè)單位。可能是因?yàn)榇判运上慊叻肿訅A性載體可以吸引更多的在固定化CLEAs-L附近的H+，局部的環(huán)境比溶液的酸性更強(qiáng)。因此，固定化CLEAs-L比游離脂肪酶耐堿性增強(qiáng)，耐酸性有所降低[16]。

2.2.2 操作穩(wěn)定性

固定化CLEAs-L、固定化脂肪酶和交聯(lián)脂肪酶聚集體(CLEAs-L)在45℃、pH 7.0的磷酸鹽緩沖溶液中按1.2.6方法測(cè)定酶活性，然后外加磁場(chǎng)將固定化CLEAs-L、固定化脂肪酶回收，過(guò)濾將交聯(lián)脂肪酶聚集體(CLEAs-L)回收，再用10 mL pH 7.0的磷酸鹽緩沖溶液洗滌3種酶。然后將3種酶再按1.2.6方法測(cè)定酶活性，再回收、洗滌，重復(fù)操作，研究3種酶的操作穩(wěn)定性，結(jié)果見圖8。

由圖8可知，重復(fù)操作6次后，固定化CLEAs-L、固定化脂肪酶、CLEAs-L的酶活回收率分別為60.53%、36.60%和32.12%。固定化CLEAs-L效果最好。隨著循環(huán)操作次數(shù)的增加，酶活回收率下降，可能是由于在重復(fù)使用過(guò)程中，固定化載體溶脹、結(jié)構(gòu)發(fā)生變化和酶的泄露所造成的。

圖8 操作穩(wěn)定性

2.2.3 儲(chǔ)存穩(wěn)定性

將各0.1 g游離脂肪酶、固定化CLEAs-L和CLEAs-L分別放在20 mL、0.1 mol/L pH 7.5的磷酸鹽緩沖溶液中，4℃下低溫保存，定期取樣測(cè)定酶活性。3種酶的儲(chǔ)存穩(wěn)定性結(jié)果見表1。

表1 游離脂肪酶、CLEAs-L和固定化CLEAs-L的 儲(chǔ)存穩(wěn)定性

由表1可知，在相同條件下儲(chǔ)存120 d，固定化CLEAs-L和CLEAs-L相對(duì)活性分別為68.92%和34.75%，而游離脂肪酶已經(jīng)沒(méi)有活性了。說(shuō)明固定化CLEAs-L穩(wěn)定性較好，適合于長(zhǎng)期儲(chǔ)存和使用。這可能是因?yàn)楫?dāng)酶分子從溶液中轉(zhuǎn)移到固定化CLEAs-L中，由于不溶的剛性載體的存在，對(duì)酶有屏蔽作用，并且增大了分子間的疏水作用，防止酶發(fā)生變性，從而增強(qiáng)了酶對(duì)熱和其他變性劑的穩(wěn)定性[17]。

2.2.4 熱穩(wěn)定性

將固定化CLEAs-L、CLEAs-L和游離脂肪酶放置在40～80℃的恒溫水浴中保溫2 h。并定義25℃游離脂肪酶的酶活性為100%，經(jīng)過(guò)熱處理的酶活性與之比較，從而得出相對(duì)活性。結(jié)果見表2。

由表2可知，固定化CLEAs-L的耐熱性明顯提高，可能是：①磁性松香基高分子載體的屏蔽作用，抑制酶分子活性結(jié)構(gòu)的破壞，有效保護(hù)了交聯(lián)脂肪酶聚集體；②在酶分子的聚集過(guò)程中，酶蛋白分子進(jìn)行了有序的排列，并在交聯(lián)過(guò)程中將酶分子進(jìn)行固定，減少其受溫度影響發(fā)生折疊和反轉(zhuǎn)引起三維結(jié)構(gòu)損壞[11]。

表2 游離脂肪酶、CLEAs-L和固定化 CLEAs-L活性的熱穩(wěn)定性

2.3 磁性松香基高分子和固定化CLEAs-L的結(jié)構(gòu)

2.3.1 電鏡掃描

采用掃描電子顯微鏡(SEM)研究了脂肪酶聚集體、CLEAs-L、載體、固定化脂肪酶、固定化CLEAs-L的表面形態(tài)，結(jié)果如圖9所示。

由圖9可知，脂肪酶聚集體為“蜂窩狀”連貫結(jié)構(gòu)，由松散的不規(guī)則的凝聚物組成。而合成的CLEAs-L表面光滑，棒狀，幾乎平行排列。進(jìn)一步證明CLEAs-L具有更好的儲(chǔ)存穩(wěn)定性，操作穩(wěn)定性和熱穩(wěn)定性。圖9c、d、e顯示在相同放大倍率下，載體表面粗糙，不均勻，存在大量的空隙和凹坑。固定化脂肪酶表面幾乎與載體表面相同。相比之下，固定化CLEAs-L的相應(yīng)SEM圖像清晰可見顯示出具有少量空隙的不同表面，其均勻且完全被分散良好的CLEAs-L覆蓋。

注：a×5 000；b×5 000；c×15 000；d×15 000；e×15 000。圖9 脂肪酶聚集體(a)、交聯(lián)脂肪酶聚集體(b)、載體(c)、固定化脂肪酶(d)、固定化CLEAs-L(e)的SEM圖

2.3.2 粒徑分布

固定化CLEAs-L的粒徑分布如圖10所示。

圖10 固定化CLEAs-L的粒徑分布

脂肪酶催化反應(yīng)的底物大多比較黏稠，若固定化酶顆粒比較小，不利于反應(yīng)結(jié)束后的分離回收。由圖10可知，有60%的固定化CLEAs-L的粒徑集中在1 400～2 800 μm，顆粒較大、均勻、且具有磁性，在外加磁場(chǎng)的作用下有利于回收操作。

2.3.3 固定化脂肪酶和固定化CLEAs-L的酶負(fù)載量(見表3)

表3 固定化脂肪酶和固定化CLEAs-L的 氮含量及酶負(fù)載量

由表3可知，固定化CLEAs-L酶負(fù)載量約為固定化脂肪酶的5倍，但是圖8顯示，酶負(fù)載量與活性不成正比?？赡苁怯捎谥久冈诰奂徒宦?lián)過(guò)程中發(fā)生變性失活或是酶的活性位點(diǎn)與交聯(lián)劑發(fā)生交聯(lián)導(dǎo)致實(shí)際上能起催化作用的酶含量降低。

3 結(jié) 論

本研究將交聯(lián)脂肪酶聚集體固定在磁性松香基高分子上(即固定化CLEAs-L)。研究了制備過(guò)程中的工藝參數(shù)對(duì)固定化CLEAs-L活性的影響。最佳制備條件為：沉淀劑無(wú)水乙醇用量30%，脂肪酶質(zhì)量濃度4 g/L，一次交聯(lián)反應(yīng)中添加0.3%的戊二醛，交聯(lián)2 h，二次交聯(lián)反應(yīng)中添加1%的戊二醛，交聯(lián)脂肪酶聚集體與載體的質(zhì)量比為2.5∶1。在最佳制備條件下，固定化CLEAs-L的酶活回收率為86.52%，固定化CLEAs-L的最適溫度和pH分別為45℃和7.0，熱穩(wěn)定性、操作穩(wěn)定性和儲(chǔ)存穩(wěn)定性均有所提高。有60%的固定化CLEAs-L的粒徑集中在1 400～2 800 μm，顆粒較大，且載體具有磁性，外加磁場(chǎng)易于回收分離。此方法工藝簡(jiǎn)單，操作簡(jiǎn)便，改善了單一法所帶來(lái)的固定不穩(wěn)定及酶活回收率低等缺點(diǎn)。