楊偉國(guó)，錢建瑞，袁 瑞，孟祥國(guó)，宋建峰

(1.晨光生物科技集團(tuán)股份有限公司，河北 邯鄲 057250； 2.河北晨光檢測(cè)技術(shù)服務(wù)有限公司，河北 邯鄲 057250)

黃曲霉毒素是由真菌黃曲霉和寄生曲霉產(chǎn)生的一組強(qiáng)的次生代謝產(chǎn)物，尤其是黃曲霉毒素B1，是目前發(fā)現(xiàn)的真菌類中毒性最大、污染范圍最廣的毒素之一[1]。近年來(lái)黃曲霉毒素污染事件的發(fā)生，已引起世界各國(guó)及消費(fèi)者對(duì)食品安全的關(guān)注[2-3]。黃曲霉毒素的檢測(cè)方法主要包括薄層色譜法(TLC)、高效液相色譜法(HPLC)(液液提取和固相提取)、微柱篩選法、酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)[4-7]。高效液相色譜法測(cè)定黃曲霉毒素是目前國(guó)際上普遍采用的定量和確認(rèn)的分析方法，但用于棉籽及棉籽相關(guān)產(chǎn)品中黃曲霉毒素的研究鮮見報(bào)道。

我國(guó)是棉花種植大國(guó)，棉籽作為棉花加工的副產(chǎn)物來(lái)源豐富。棉籽中含有油脂和蛋白，是重要的油料及飼料原料[8]。棉籽相關(guān)產(chǎn)品主要包括棉殼、棉籽蛋白和棉籽油。棉殼主要用于菌類培養(yǎng)及牛羊等飼養(yǎng)用原料；棉籽蛋白作為單一飼料，應(yīng)用于整個(gè)飼料行業(yè)；棉籽油作為食用植物油，直接面對(duì)終端市場(chǎng)。

棉籽在采摘、晾曬、貯藏、運(yùn)輸、加工等過程中，由于環(huán)境條件及水分控制等問題，極易引起霉變及霉菌毒素污染[9-10]，因而棉殼、棉籽蛋白、棉籽油中極有可能由于加工過程中的毒素遷移而被污染。GB 2761—2017《 食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中真菌毒素限量》和 GB 13078—2017《飼料衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)》分別對(duì)棉籽油、棉籽相關(guān)產(chǎn)品黃曲霉毒素B1做了限定。本文采用GB/T 30955—2014《飼料中黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2的測(cè)定 免疫親和柱凈化-高效液相色譜法》并優(yōu)化其前處理方法，對(duì)棉籽及其相關(guān)產(chǎn)品的黃曲霉毒素B1進(jìn)行測(cè)定。 通過優(yōu)化后的方法，開展棉籽相關(guān)產(chǎn)品加工過程中黃曲霉毒素的監(jiān)測(cè)與控制研究，明確黃曲霉毒素B1在棉籽加工過程中的含量變化、遷移規(guī)律，為開發(fā)黃曲霉毒素控制技術(shù)提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 原料與試劑

棉籽，產(chǎn)地A、B。棉籽蛋白：棉籽經(jīng)剝殼、壓坯、提油后的黃色粉末。棉籽油：棉籽經(jīng)剝殼、壓坯、提取、濃縮、堿煉后的淺黃色液體。以上樣品均由晨光生物科技集團(tuán)股份有限公司提供。

黃曲霉毒素B1標(biāo)準(zhǔn)品(純度>99%)，美國(guó)Sigma公司；甲醇、乙腈，色譜純，美國(guó)Fisher公司；磷酸氫二鉀、氯化鈉、磷酸二氫鉀、碘、濃鹽酸，分析純；氯化鉀，優(yōu)級(jí)純；實(shí)驗(yàn)室用水均為Milli-Q超純水。

1.1.2 儀器與設(shè)備

1260高效液相色譜儀(配熒光檢測(cè)器)，美國(guó)Agilent公司；柱后衍生系統(tǒng)，美國(guó)Pickering Laboratories公司；島津分析天平；免疫親和柱(黃曲霉毒素B1)，北京華安麥科生物技術(shù)有限公司；玻璃纖維濾紙(直徑110 mm，孔徑1.5 μm)，英國(guó)GE Healthcare公司；Master-S UVF超純水機(jī)，上海和泰儀器有限公司；0.22 μm針式過濾膜，上海安譜科學(xué)儀器有限公司；調(diào)速多用振蕩器，江蘇金壇市中大儀器廠；數(shù)控超聲波清洗機(jī)，濟(jì)寧天華超聲電子儀器有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 使用溶液及標(biāo)準(zhǔn)溶液制備

磷酸鹽緩沖溶液(PBS)：稱取7.9 g氯化鈉、1.8 g磷酸氫二鉀、0.24 g磷酸二氫鉀、0.2 g氯化鉀，900 mL水溶解，然后用濃鹽酸調(diào)節(jié)pH至7.0，最后用水稀釋至1 000 mL，保存于4℃?zhèn)溆谩?/p>

10%甲醇-PBS：取10 mL甲醇，加入PBS并定容至100 mL。

黃曲霉毒素B1標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液：將黃曲霉素B1標(biāo)準(zhǔn)品用甲醇配制成13 μg/kg的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液，保存于4℃?zhèn)溆谩?/p>

柱后衍生溶液：稱取0.5 g碘，溶解于100 mL甲醇后，加純水定容至1 000 mL，以0.45 μm的尼龍濾膜過濾，充入氮?dú)獗芄獗４妗?/p>

1.2.2 色譜分離條件

ODS C18 色譜柱(100 mm×4.6 mm，5 μm)；進(jìn)樣量100 μL；柱溫40℃；流動(dòng)相為乙腈-甲醇-水(體積比22∶22∶56)溶液；流速1.0 mL/min；激發(fā)波長(zhǎng)360 nm，發(fā)射波長(zhǎng)440 nm。

1.2.3 柱后衍生化條件

衍生溶液為體積分?jǐn)?shù)10%甲醇溶液(含0.05%碘)；泵洗液為體積分?jǐn)?shù)20%甲醇溶液；衍生溶液流速0.3 mL/min；衍生反應(yīng)溫度95℃。

1.2.4 樣品預(yù)處理

1.2.4.1 提取

棉籽蛋白樣品混勻后用高速粉碎機(jī)粉碎，過0.25 mm分析篩。棉籽樣品混勻后用高速粉碎機(jī)粉碎，過2 mm孔徑試驗(yàn)篩。稱取5 g樣品，加一定量溶劑,采用一定的方式提取，用普通濾紙進(jìn)行過濾，收集濾液至250 mL玻璃錐形瓶中；移取5 mL濾液至50 mL容量瓶中，用PBS定容；將稀釋液用玻璃纖維濾紙過濾至三角瓶中。

1.2.4.2 凈化

取1.2.4.1稀釋液10 mL，加入免疫親和柱(流速1 mL/min)；液體徹底排凈后，加入5 mL 10%甲醇-PBS(或純水)洗滌2次(流速3 mL/min)；棄去洗脫液，加入1 mL甲醇，孵育2 min(流速1 mL/min)；收集洗脫液，搖勻。

1.2.5 樣品測(cè)定

將1.2.4.2洗脫液過0.45 μm有機(jī)濾膜，進(jìn)行高效液相色譜分析。每次進(jìn)樣100 μL，重復(fù)2次，記錄色譜峰面積，利用標(biāo)準(zhǔn)曲線(y=321.91x+1.234,R2=0.999 9)計(jì)算樣品中黃曲霉毒素B1含量。

2 結(jié)果與討論

2.1 提取條件的優(yōu)化

2.1.1 提取方式優(yōu)化

以不同提取方式為探究因素，利用高效液相色譜對(duì)同一產(chǎn)地、同一批次的棉籽蛋白進(jìn)行黃曲霉毒素B1含量的測(cè)定，結(jié)果見表1。

由表1可以看出，不同提取方式對(duì)棉籽蛋白中黃曲霉毒素B1的檢測(cè)結(jié)果有較大的影響。其中超聲30 min提取方式得出的黃曲霉素毒素B1含量值最高，故確定最優(yōu)提取方式為超聲30 min。

表1 不同提取方式下棉籽蛋白中黃曲霉毒素B1含量

2.1.2 提取溶劑優(yōu)化

根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)資料可知，黃曲霉毒素B1萃取溶劑較多，有80%甲醇溶液、85%丙酮溶液和86%乙腈溶液等。以不同提取溶劑為探究因素，利用高效液相色譜對(duì)同一產(chǎn)地、同一批次的棉籽蛋白進(jìn)行黃曲霉毒素B1含量的測(cè)定，結(jié)果見表2。

表2 不同提取溶劑下棉籽蛋白中黃曲霉毒素B1含量

由表2可以看出，不同的提取溶劑對(duì)棉籽蛋白中黃曲霉毒素B1檢測(cè)結(jié)果有很大的影響。其中，提取溶劑為86%乙腈溶液的檢測(cè)結(jié)果分別為80%甲醇溶液檢測(cè)結(jié)果的2.81倍，85%丙酮溶液檢測(cè)結(jié)果的1.57倍。由此可知，86%乙腈溶液提取效果最好，而80%甲醇溶液提取效果遠(yuǎn)弱于其他兩種溶劑，故確定最優(yōu)提取溶劑為86%乙腈溶液。

2.1.3 固液比優(yōu)化

固液比不同，樣品提取過程中的浸潤(rùn)狀態(tài)不同，最終黃曲霉毒素B1檢測(cè)結(jié)果也會(huì)有很大不同。以不同固液比為探究因素，利用高效液相色譜對(duì)同一產(chǎn)地、同一批次的棉籽蛋白進(jìn)行黃曲霉毒素B1含量的測(cè)定，結(jié)果見表3。

表3 不同固液比下棉籽蛋白中黃曲霉毒素B1含量

由表3可以看出，固液比1∶20提取效果高于固液比1∶5和1∶10。繼續(xù)增大固液比提取可能會(huì)更充分，但考慮溶劑成本及毒性因素，確定最優(yōu)固液比為1∶10。

2.1.4 超聲時(shí)間優(yōu)化

超聲時(shí)間不同，樣品與提取溶劑作用時(shí)間不同，從而導(dǎo)致黃曲霉毒素B1的提取效率不同。以不同超聲時(shí)間為優(yōu)化因素，利用高效液相色譜對(duì)同一產(chǎn)地、同一批次的棉籽蛋白進(jìn)行黃曲霉毒素B1含量的測(cè)定，結(jié)果見表4。

由表4可以看出，黃曲霉毒素B1檢測(cè)結(jié)果隨超聲時(shí)間的延長(zhǎng)而增大，但增大幅度較小。因此，在滿足實(shí)際檢測(cè)需要下，考慮檢測(cè)時(shí)效性，確定最優(yōu)超聲時(shí)間為10 min。

2.2 方法穩(wěn)定性和準(zhǔn)確性驗(yàn)證

針對(duì)2.1探究確定的棉籽蛋白中黃曲霉毒素B1提取方法進(jìn)行重復(fù)性驗(yàn)證，以證明新方法具有實(shí)際檢測(cè)應(yīng)用性。取批號(hào)為1805002M的棉籽蛋白，按照2.1提取條件進(jìn)行日內(nèi)和日間重復(fù)性驗(yàn)證，結(jié)果見表5。選取棉籽蛋白和棉籽油2種已知結(jié)果的產(chǎn)品，加入適當(dāng)濃度的標(biāo)樣，測(cè)定加標(biāo)回收率，結(jié)果見表6。

表4 不同超聲時(shí)間下棉籽蛋白中黃曲霉毒素B1含量

表5 方法穩(wěn)定性驗(yàn)證

表6 方法準(zhǔn)確性驗(yàn)證

由表5和表6可以看出，本文2.1建立的棉籽蛋白中黃曲霉毒素B1提取方法，檢測(cè)重復(fù)性較好，日內(nèi)精密度在1.82%～4.41%之間，日間精密度為6.00%，樣品加標(biāo)回收率在97%～108%之間，可滿足日常實(shí)際檢測(cè)及質(zhì)量控制需求。

2.3 棉籽及棉籽相關(guān)產(chǎn)品中黃曲霉毒素B1的遷移規(guī)律

對(duì)A地區(qū)及B地區(qū)多批次棉籽樣品進(jìn)行仁殼分離，并利用本文建立的測(cè)定方法分別對(duì)棉籽及其相關(guān)產(chǎn)品的黃曲霉毒素B1含量進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果見表7。

表7 不同來(lái)源棉籽及棉籽相關(guān)產(chǎn)品中 黃曲霉毒素B1含量 μg/kg

由表7可以看出，不同來(lái)源的棉籽中黃曲霉毒素B1含量差異較大，A地區(qū)棉籽中黃曲霉毒素B1含量較低，B地區(qū)棉籽中黃曲霉毒素B1含量偏高。不同來(lái)源棉籽仁殼分離后的黃曲霉毒素B1主要集中在棉仁中。A地區(qū)和B地區(qū)棉仁生產(chǎn)的棉籽油中均未檢出黃曲霉毒素B1(<1 μg/kg示為未檢出，下同)，A地區(qū)的棉籽蛋白中未檢出黃曲霉毒素B1，而B地區(qū)的棉籽蛋白中黃曲霉毒素B1含量在12.0～99.1 μg/kg。

根據(jù)表7，A地區(qū)棉籽中未檢測(cè)出黃曲霉毒素B1，棉殼和棉仁中也均未檢出。B地區(qū)棉籽中均檢測(cè)出黃曲霉毒素B1，且黃曲霉毒素B1含量差異較大，但在棉殼中均未檢出黃曲霉毒素B1，除2個(gè)樣品外，其余樣品對(duì)應(yīng)棉仁中黃曲霉毒素B1的檢測(cè)值為棉籽中的1.76～2.46倍。B地區(qū)棉籽中均檢測(cè)出黃曲霉毒素B1，但仁殼分離后的棉殼和部分棉仁中未檢出。這可能是因?yàn)辄S曲霉毒素在棉籽中分布非常不均勻，取樣混樣階段無(wú)法完全消除不勻等因素，很難保證同一批次棉籽黃曲霉毒素含量在同一個(gè)水平上。由此可以確定黃曲霉毒素B1在B地區(qū)棉籽中主要分布在棉仁中。

經(jīng)分析，B地區(qū)棉籽成熟期正值夏秋季，溫濕度均適宜，導(dǎo)致容易感染黃曲霉，產(chǎn)生黃曲霉毒素。有關(guān)研究介紹，黃曲霉一旦在果仁上繁殖，由于果仁的蛋白質(zhì)等豐富營(yíng)養(yǎng)條件可迅速產(chǎn)生黃曲霉毒素，而其他部位如棉殼等則不易產(chǎn)生。而A地區(qū)屬溫帶大陸性氣候，具有夏季干熱、冬季干冷的特點(diǎn)，且光線充足，太陽(yáng)輻射總量全年為5 000～6 490 MJ/m2，紫外線較強(qiáng)不適宜黃曲霉的生長(zhǎng)及毒素的產(chǎn)生，故A地區(qū)產(chǎn)棉籽在生長(zhǎng)期間是很少有黃曲霉及毒素產(chǎn)生的。

B地區(qū)棉籽加工的棉籽蛋白中均可檢測(cè)出黃曲霉毒素B1，但棉籽油中均未檢測(cè)出。經(jīng)分析，黃曲霉毒素易溶于醇類溶劑，棉籽蛋白是由棉仁經(jīng)過預(yù)處理、浸出、粉碎后得到的產(chǎn)品，由于棉仁中含有黃曲霉毒素B1，故在生產(chǎn)中易富集于棉籽蛋白中。而棉籽油是棉仁經(jīng)過浸出、精煉后得到的產(chǎn)品，可能一方面是遷移量較少，一方面堿煉和水洗過程中能夠去除大部分黃曲霉毒素B1，故未檢測(cè)出黃曲霉毒素B1。由此可見，從棉籽原料生產(chǎn)至棉籽蛋白和棉籽油的過程中，黃曲霉毒素B1主要遷移至棉籽蛋白中。

3 結(jié) 論

本文建立了棉籽及棉籽相關(guān)產(chǎn)品中黃曲霉毒素B1的測(cè)定方法。將樣品混合均勻粉碎，稱樣量5 g，提取溶劑為86%乙腈溶液，固液比1∶10，超聲提取10 min，提取液經(jīng)免疫親和柱凈化，再進(jìn)行高效液相色譜分析。經(jīng)日內(nèi)和日間重復(fù)性驗(yàn)證可知該方法完全可滿足日常實(shí)際質(zhì)量控制需求。

不同產(chǎn)地的棉籽因氣候因素影響，受黃曲霉毒素污染的水平差異較大。棉籽中棉仁是黃曲霉毒素的主要分布位置。受黃曲霉毒素污染的棉籽在加工過程中，黃曲霉毒素B1會(huì)由棉籽中遷移至棉仁中再遷移至棉籽蛋白中，而棉殼、棉籽油幾乎不會(huì)受到污染。因此，為防止棉籽蛋白產(chǎn)品中黃曲霉毒素超標(biāo)，應(yīng)加強(qiáng)對(duì)棉籽原料的檢測(cè)和控制，已經(jīng)被污染的原料，可在加工過程中通過黃曲霉毒素脫除技術(shù)進(jìn)行脫除，確保棉籽蛋白產(chǎn)品的黃曲霉毒素B1含量符合國(guó)標(biāo)要求。