邢常瑞，袁翔宇，章 鋮，鞠興榮，袁 建，何 榮

(1.南京財(cái)經(jīng)大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，江蘇省現(xiàn)代糧食流通與安全協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇高校糧油質(zhì)量 安全控制及深加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南京 210023； 2.安徽糧食工程職業(yè)學(xué)院，合肥 523147)

天然植物油中含有復(fù)雜的甘油三酯組分，其在植物油中的含量高達(dá)95%～98%[1]。組成甘油三酯的脂肪酸種類及其在甘油骨架上的位置決定了甘油三酯特殊營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，因此研究甘油三酯的組成具有十分重要的意義。

目前，檢測(cè)甘油三酯常用的方法主要有高溫氣相色譜法、高效液相色譜法等，其中高效液相色譜法尤其是反相高效液相色譜法的應(yīng)用最為普遍。檢測(cè)器有紫外、示差折光[2]、蒸發(fā)光散射[3]等常用來識(shí)別和表征甘油三酯，但是只能對(duì)有標(biāo)準(zhǔn)品且保留時(shí)間不同的甘油三酯進(jìn)行定性定量區(qū)分、測(cè)定，對(duì)于碳原子當(dāng)量(ECN)相同即保留時(shí)間相同的甘油三酯則無法鑒別。蒸發(fā)光散射檢測(cè)器(ELSD)僅能對(duì)植物油中的甘油三酯進(jìn)行初步的定性，確定基本的ECN輪廓。高分辨質(zhì)譜(Triple-TOF-MS/MS)可進(jìn)行未知物的探索，對(duì)沒有標(biāo)準(zhǔn)品的物質(zhì)也能根據(jù)其母離子及碎片離子推測(cè)其結(jié)構(gòu)。

本文在高效液相色譜-蒸發(fā)光散射檢測(cè)器(HPLC-ELSD)法分析以ECN計(jì)的芝麻油、菜籽油、大豆油、花生油、葵花籽油和玉米油的甘油三酯組成與含量的基礎(chǔ)上，采用高分辨質(zhì)譜對(duì)6種食用植物油中的甘油三酯進(jìn)行測(cè)定，并確定每種ECN下的甘油三酯組成與含量，建立一種分析測(cè)定食用植物油中甘油三酯組成與結(jié)構(gòu)的方法。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

芝麻油(采集自安徽主產(chǎn)區(qū)，3個(gè))、菜籽油(采集自湖南主產(chǎn)區(qū)，包括1個(gè)低芥酸菜籽油和2個(gè)高芥酸菜籽油)、大豆油(采集自東北三省，3個(gè))、花生油(市場(chǎng)選購(gòu)，3個(gè))、葵花籽油(市場(chǎng)選購(gòu)，3個(gè))和玉米油(市場(chǎng)選購(gòu)，3個(gè))；0.22 μm尼龍微孔濾膜(天津津騰公司)，乙腈(德國(guó)Merck公司，色譜級(jí))，異丙醇(德國(guó)Merck公司，色譜級(jí))。

BSA223S-CW電子天平；SB25-12DTDN超聲波清洗器；Dionex Utimate3000液相色譜儀(美國(guó)Thermo Fisher公司)；Alltech3300蒸發(fā)光散射檢測(cè)器(美國(guó)Grace公司)；Triple-TOF-MS/MS(美國(guó)AB Sciex公司)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 樣品的前處理

稱取50 mg的植物油樣溶解于乙腈-異丙醇(體積比1∶1)中[4]，并定容至10 mL容量瓶中，經(jīng)0.22 μm尼龍微孔濾膜過濾后，置于2 mL進(jìn)樣瓶中，分別進(jìn)行HPLC-ELSD檢測(cè)和Triple-TOF-MS/MS檢測(cè)。在進(jìn)行Triple-TOF-MS/MS檢測(cè)前，需要對(duì)過膜的樣品稀釋1 000倍。

1.2.2 HPLC-ELSD檢測(cè)條件

色譜柱為Accucore C18反相柱(2.6 μm，4.6 mm×150 mm)；流動(dòng)相為乙腈和異丙醇，進(jìn)行梯度洗脫，洗脫程序見表1；流速0.8 mL/min；柱溫30℃；進(jìn)樣量10 μL。ELSD參數(shù)：漂移管溫度50℃，載氣流速1.8 L/min，增益為1[5]。

表1 高效液相色譜流動(dòng)相梯度洗脫程序

1.2.3 Triple-TOF-MS/MS檢測(cè)條件

HPLC條件：色譜柱為Accucore C18反相柱(2.6 μm，4.6 mm×150 mm)；流動(dòng)相為乙腈-水(體積比19∶1)和異丙醇，其中在乙腈-水中添加5 mmol/L乙酸銨[6]，進(jìn)行梯度洗脫，洗脫程序見表2；流速0.6 mL/min；柱溫30℃；進(jìn)樣量5 μL。

Triple-TOF-MS/MS條件：ESI正離子源，TOF-MS采集積累時(shí)間0.25 s，采集范圍(m/z)100～1 200，離子源溫度500℃，電噴霧電壓5 000 V，霧化氣壓力310.26 kPa，輔助氣壓力344.75 kPa，氣簾氣壓力241.32 kPa，碰撞氣體為氮?dú)?，去簇電?0 V，碰撞能量35 V[7]。

表2 Triple-TOF-MS/MS梯度洗脫程序

1.2.4 甘油三酯定性分析

根據(jù)AOCS標(biāo)準(zhǔn)中大豆油甘油三酯標(biāo)準(zhǔn)色譜圖進(jìn)行比對(duì)，再結(jié)合甘油三酯在高效液相色譜中的出峰規(guī)律，即碳原子當(dāng)量數(shù)(ECN)越大，保留時(shí)間越長(zhǎng)，確定各個(gè)色譜峰對(duì)應(yīng)的甘油三酯的ECN。

Triple-TOF-MS/MS根據(jù)甘油三酯分子中碳鏈在質(zhì)譜中斷裂規(guī)律，結(jié)合在質(zhì)譜中獲得一級(jí)質(zhì)譜母離子(加氫母離子、加鈉離子和加氨母離子)相對(duì)分子質(zhì)量以及二級(jí)質(zhì)譜的碎片離子([DAG]+)對(duì)各甘油三酯進(jìn)行定性。

1.2.5 甘油三酯定量分析

利用面積歸一化法計(jì)算各甘油三酯的相對(duì)含量，即甘油三酯相對(duì)含量=各甘油三酯峰面積/總峰面積×100%。

2 結(jié)果與討論

2.1 HPLC-ELSD檢測(cè)食用植物油甘油三酯組成

按照1.2.2高效液相色譜條件對(duì)食用植物油樣品進(jìn)行色譜分離，根據(jù)1.2.4初步定性后采用面積歸一化法測(cè)定不同ECN下的甘油三酯相對(duì)含量，結(jié)果見表3。

表3 HPLC-ELSD測(cè)定的植物油不同ECN下甘油三酯相對(duì)含量

由表3可知，6種植物油的甘油三酯多集中在ECN為42～48之間。高芥酸菜籽油與低芥酸菜籽油不同ECN下的甘油三酯含量有很大差別，高芥酸菜籽油的甘油三酯組成更復(fù)雜，其中ECN為50以上的甘油三酯含量明顯高于低芥酸菜籽油和其他5種植物油，花生油中C20以上的飽和脂肪酸如花生酸、山崳酸、木焦油酸的含量都遠(yuǎn)高于其他5種植物油，因此花生油ECN為50的甘油三酯含量也較高。芝麻油與葵花籽油和玉米油在脂肪酸組成上較為相似，其ECN甘油三酯的組成與含量差異也不大。但是在同一保留時(shí)間的色譜峰包括多種具有相同ECN的不同種類的甘油三酯，HPLC-ELSD無法確定各個(gè)色譜峰相對(duì)應(yīng)的甘油三酯，僅能對(duì)甘油三酯的ECN輪廓進(jìn)行初步鑒定。

2.2 Triple-TOF-MS/MS檢測(cè)食用植物油甘油三酯組成

按照1.2.3 HPLC條件進(jìn)行分離后，采用Triple-TOF-MS/MS條件對(duì)食用植物油樣品進(jìn)行質(zhì)譜分析，以相對(duì)分子質(zhì)量為875的質(zhì)譜離子的二級(jí)質(zhì)譜圖分析為例，如圖1所示。首先，可以找到其準(zhǔn)離子分子峰874.771 2m/z，在二級(jí)質(zhì)譜中，可以找明顯的碎片離子[DAG]+857.746 5m/z，與[DAG]+874.771 2m/z相比離子質(zhì)量約減少了17m/z，表明失去了一個(gè)羥基；碎片離子[DAG]+601.510 0m/z，與[DAG]+857.746 5m/z相比離子質(zhì)量約減少了256m/z，表明失去了一個(gè)棕櫚酸(P)分子；碎片離子[DAG]+575.494 8m/z，與[DAG]+857.746 5m/z相比離子質(zhì)量約減少了282m/z，表明失去了一個(gè)油酸(O)分子；碎片離子[DAG]+577.509 8m/z，與[DAG]+857.746 5m/z相比離子質(zhì)量約減少了280m/z，表明失去了一個(gè)亞油酸(L)分子。

圖1 相對(duì)分子質(zhì)量為875的質(zhì)譜離子的二級(jí)質(zhì)譜圖

根據(jù)脂肪酸在甘油骨架上分布的情況，?；赟n-1、Sn-3位的脂肪酸要比?；赟n-2位上的脂肪酸更容易斷裂，因而從甘油骨架斷裂一個(gè)Sn-1、Sn-3位脂肪酸形成的1,2-二?；视碗x子或2,3-二酰基甘油離子的豐度高于從Sn-2位斷裂一個(gè)脂肪酸形成1,3-二?；视碗x子的豐度[8]。碎片離子[DAG]+577.509 8m/z的強(qiáng)度略低于[DAG]+575.494 8m/z和[DAG]+601.510 0m/z，因此推測(cè)該甘油三酯可能為PLO(忽略Sn-1、Sn-3位置異構(gòu))。同理，由此對(duì)菜籽油、大豆油、花生油、葵花籽油和玉米油甘油三酯進(jìn)行鑒定，共得到35種甘油三酯，根據(jù)質(zhì)譜母離子及碎片離子可進(jìn)行定性，用面積歸一化法得到其相對(duì)含量。芝麻油、菜籽油、大豆油等食用植物油的甘油三酯組成與含量見表4和表5。

從表4和表5可知，Triple-TOF-MS/MS可準(zhǔn)確地確定相同ECN的不同甘油三酯的種類。6類植物油均含有LnLL、LLO、LOO、LLL、PLO、PLL和OOO 7種甘油三酯。在芝麻油中，共找到15種甘油三酯，其中只含有油酸和亞油酸的甘油三酯最多，占總甘油三酯含量的60%以上；在菜籽油中含量最多的甘油三酯分別是OOO、LOO和PLL。其中，高芥酸菜籽油中共有21種甘油三酯，是6種植物油中鑒定出最多的。此外在高芥酸菜籽油中還檢測(cè)到很多含有芥酸的甘油三酯，如ELnP、AoLnE、ELE、EOE等。而在低芥酸菜籽油中，檢測(cè)到17種甘油三酯；LLO、LOO和PLO是花生油中含量最高的3種甘油三酯，超過總含量的50%；大豆油中主要是LLL、LLO和PLL 3種甘油三酯，占總甘油三酯的46%以上；在葵花籽油和玉米油中都鑒定出15種甘油三酯，LLL、LLO和PLL含量最多的3種甘油三酯，同樣表明葵花籽油和玉米油不僅在脂肪酸組成和含量上具有相似性，在甘油三酯上組成與含量上也高度統(tǒng)一。

表4 Triple-TOF-MS/MS測(cè)定的食用植物油甘油三酯組成及相對(duì)含量

注：“-”表示未檢出；P.棕櫚酸；S.硬脂酸；O.油酸；L.亞油酸；Ln.亞麻酸；A.花生酸；Ao.花生一烯酸；B.山崳酸；E.芥酸；Li.木焦油酸。甘油三酯Sn-1、Sn-3位置異構(gòu)未考慮。下同。

表5 Triple-TOF-MS/MS測(cè)定的食用植物油甘油三酯組成及相對(duì)含量

3 結(jié) 論

本文研究發(fā)現(xiàn)，常規(guī)的HPLC-ELSD法僅能對(duì)甘油三酯的碳原子當(dāng)量數(shù)(ECN)輪廓進(jìn)行初步鑒定，而Triple-TOF-MS/MS能夠根據(jù)一級(jí)質(zhì)譜母離子(加氫母離子、加鈉離子和加氨母離子)相對(duì)分子質(zhì)量以及二級(jí)質(zhì)譜的碎片離子([DAG]+)對(duì)相同ECN的甘油三酯進(jìn)行定性分析，采用該方法檢測(cè)芝麻油、葵花籽油、大豆油、菜籽油、花生油和玉米油，共獲得35種甘油三酯。其中6種植物油中均含有LnLL、LLL、LLO、PLL、LOO、PLO和OOO 7種甘油三酯。將Triple-TOF-MS/MS法應(yīng)用于油脂中甘油三酯的檢測(cè)，可為我國(guó)糧油品質(zhì)控制及分析提供理論基礎(chǔ)。