張雨晴， 尹新堅(jiān)， 吳堅(jiān)平, 楊立榮

(浙江大學(xué) 工業(yè)生物催化浙江省工程實(shí)驗(yàn)室， 杭州 310027)

谷氨酸脫氫酶(Glutamate dehydrogenase，GluDH, EC 1.4.1.2-1.4.1.4)是一類依賴煙酰胺類輔酶NAD(P)+/NAD(P)H的氧化還原酶[1-4]，能夠可逆的將谷氨酸氧化脫氨生成α-酮戊二酸。該酶主要以四聚體和六聚體兩種形式廣泛存在于各種動(dòng)植物、微生物體內(nèi)[5-7]，在碳、氮代謝中起著至關(guān)重要的作用。GluDH在臨床及農(nóng)業(yè)、工業(yè)領(lǐng)域具有非常廣泛的應(yīng)用[8]，同時(shí)為酶學(xué)性質(zhì)研究提供了豐富的素材[9-10]。在有機(jī)合成領(lǐng)域，GluDH 在天然及非天然氨基酸制備方面同樣表現(xiàn)出巨大的應(yīng)用潛力，GluDH催化合成氨基酸類化合物原理如圖1所示。與化學(xué)法相比，利用GluDH等酶合成光學(xué)純的天然及非天然氨基酸[11-13]，具有高效、環(huán)保、安全及立體選擇性高等一系列優(yōu)點(diǎn)，是符合綠色先進(jìn)生產(chǎn)理念的先進(jìn)制造技術(shù)。草銨膦(4-[羥基(甲基)膦?；鵠-DL-高丙氨酸)是一種含磷的氨基酸類除草劑，具有農(nóng)作物安全、活性高、殺草譜廣、藥害小等優(yōu)點(diǎn)，是目前轉(zhuǎn)基因抗性作物理想的除草劑，應(yīng)用前景十分廣闊[14-16]。前期工作中，本實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)開發(fā)出一株能夠胺化還原2-羰基-4-(羥基甲基膦?；∷?(PPO)合成 L-草銨膦的重組谷氨酸脫氫酶。為推進(jìn)該工藝的工業(yè)化應(yīng)用，還需優(yōu)化培養(yǎng)基來降低生物催化劑的制備成本。

重組大腸桿菌培養(yǎng)基優(yōu)化方法主要包括單因素試驗(yàn)法[17]、正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)法[18-19]、均勻設(shè)計(jì)法[20]以及響應(yīng)面設(shè)計(jì)優(yōu)化法[21-25]等。其中響應(yīng)面設(shè)計(jì)優(yōu)化法具有試驗(yàn)周期短，求得的回歸方程精度高，能研究幾種因素間交互作用等優(yōu)點(diǎn)，是一種優(yōu)化反應(yīng)條件和工藝參數(shù)的有效方法[26]。本文首先采用單因素試驗(yàn)，確定發(fā)酵培養(yǎng)基中最適的碳、氮源，再利用Plackett Burman設(shè)計(jì)確定培養(yǎng)基中影響顯著的因子。在此基礎(chǔ)上利用最陡爬坡實(shí)驗(yàn)確定顯著因子的適宜濃度范圍，并根據(jù)Box-Bohnken的中心組合設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)和響應(yīng)面分析確定最優(yōu)的發(fā)酵培養(yǎng)基配方，為工業(yè)化生產(chǎn)提供參考。

圖1 谷氨酸脫氫酶合成氨基酸類化合物示意圖

1 材料與方法

1.1 菌株和培養(yǎng)基

菌株：產(chǎn)GluDH重組菌由本實(shí)驗(yàn)室保藏，該GluDH基因來源于Pseudomonasputida，表達(dá)載體為pET-28a(+)，宿主為E.coliBL21(DE3)。

培養(yǎng)基：重組菌種子LB培養(yǎng)基(g/L)，酵母粉 5，胰蛋白胨 10，NaCl 10，調(diào)pH值至7.0;原始液體發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)：Na2HPO4·12H2O 17.1，KH2PO43.0，NaCl 0.5，NH4Cl 1.5，MgSO4·7H2O 0.1，甘油5，酵母粉10;各培養(yǎng)基根據(jù)需要添加終濃度為50 mg/L的卡那霉素。

1.2 試劑

2-羰基-4-(羥基甲基膦酰基)丁酸(PPO)為實(shí)驗(yàn)室自制；分析級(jí)酵母粉和蛋白胨均為OXOID公司產(chǎn)品；工業(yè)級(jí)酵母粉為安琪酵母股份有限公司產(chǎn)品。其余試劑為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.3 發(fā)酵培養(yǎng)

種子培養(yǎng)：挑取平板上劃線的重組大腸桿菌單菌落接種至種子培養(yǎng)基，37 ℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)7～8 h。

發(fā)酵培養(yǎng)：將培養(yǎng)好的種子液按2%的轉(zhuǎn)接量轉(zhuǎn)接至含50 mg/L卡那霉素的50 mL液體培養(yǎng)基中，37 ℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)3～4 h至OD600達(dá)到1.0時(shí)加入終濃度為0.5 mmol/L的異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)，18 ℃誘導(dǎo)14～16 h。收集發(fā)酵液4 ℃、12 000 r/min離心收集菌體，用pH 7.5的磷酸鹽緩沖液重懸后破胞取上清液測(cè)酶活。

1.4 GluDH活力測(cè)定

高效液相色譜法檢測(cè)L-草銨膦的生成量。

1.5 響應(yīng)面法優(yōu)化培養(yǎng)基組成

1.5.1 Plackett-Burman 設(shè)計(jì)[27]

通過Plackett-Burman試驗(yàn)來確定發(fā)酵培養(yǎng)基中影響酶活的主要組分因素。選用N=12的PB設(shè)計(jì)，每個(gè)因素分別取高、低兩個(gè)水平，高水平取低水平的1.25倍，響應(yīng)值為每毫升發(fā)酵液中谷氨酸脫氫酶的酶活。

1.5.2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)[28]

根據(jù)Box-Benhnken的中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，進(jìn)一步進(jìn)行三因素三水平的響應(yīng)面分析實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用Design Expert 軟件經(jīng)多項(xiàng)式回歸分析，并對(duì)擬合方程做顯著性檢驗(yàn)，其統(tǒng)計(jì)學(xué)上的顯著性由F檢驗(yàn)確定。

2 結(jié)果與分析

2.1 最適碳源、氮源的選擇

碳源的選擇：以10 g/L的安琪酵母粉905作為氮源，在碳源濃度為5 g/L時(shí)對(duì)液體發(fā)酵培養(yǎng)基中的碳源進(jìn)行篩選，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖2。由圖2可知以甘油為碳源時(shí)的酶活力和OD600最高，分別為82.3 U/mL和6.81，表明甘油是最適碳源。

1:蔗糖；2:果糖；3:可溶性淀粉；4:葡萄糖；5:木糖；6:甘油

圖2不同碳源下的酶活力和OD600

Figure 2 Enzyme activity andOD600for different carbon source

氮源的選擇：以5 g/L的甘油作為碳源，在氮源濃度為10 g/L時(shí)對(duì)氮源進(jìn)行篩選，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖3。由圖3可知，以O(shè)XOID公司的酵母粉(分析級(jí))為氮源時(shí)，酶活力和生物量OD600最高，安琪酵母粉905(工業(yè)級(jí))為氮源時(shí)的酶活和生物量次之，考慮到安琪酵母粉在價(jià)格上有顯著優(yōu)勢(shì)，因此采用安琪酵母粉作為氮源。

2.2 Plackett-Burman 篩選影響產(chǎn)酶的重要因素

在單因素優(yōu)化實(shí)驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，對(duì)培養(yǎng)基的7種組分(X1-甘油、X2-Na2HPO4·12H2O、X3-KH2PO4、X4-NaCl、X5-NH4Cl、X6-酵母粉、X7-MgSO4·7H2O)進(jìn)行PB重要性篩選，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果如表1所示。

利用Design Expert軟件對(duì)各因素的主效應(yīng)進(jìn)行分析，結(jié)果見表2。由表2的分析結(jié)果可知，酵母粉(X6)、甘油(X1)和MgSO4·7H2O(X7)這3種因素的Prob>F值均小于0.05，表明這3種因素對(duì)產(chǎn)酶的影響極顯著。另外模型方差分析的可信度R2=96.61%，證明該模型顯著性極高,可對(duì)本研究模擬進(jìn)行較好地解釋。

1:酵母粉(OXOID)；2:胰蛋白胨(OXOID)；3:安琪酵母粉(905)；4:牛肉膏；5:大豆蛋白胨；6:骨蛋白胨；7:魚蛋白胨

圖3 不同氮源下的酶活力和OD600

表2 Plackett-Burman 試驗(yàn)因素水平及效應(yīng)

2.3 最陡爬坡試驗(yàn)設(shè)計(jì)

對(duì)PB實(shí)驗(yàn)結(jié)果確定的3種顯著性試驗(yàn)因素進(jìn)行爬坡實(shí)驗(yàn)，使其濃度盡量靠近最佳水平值區(qū)域，試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果如表3所示。由結(jié)果可見，酶活隨著各組分濃度的升高先增大后減小，酶活最高值在第4組與第5組實(shí)驗(yàn)之間，并且第4組的酶活較之更高，所以以第4組的條件作為最佳因素質(zhì)量濃度的組合并作為下一步響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)的中心點(diǎn)，即酵母粉16 g/L、甘油11 g/L、MgSO4·7H2O 0.8 g/L，并根據(jù)上述結(jié)果，確定響應(yīng)面試驗(yàn)中3種試驗(yàn)因素的3個(gè)水平值。

表3 最陡爬坡試驗(yàn)設(shè)計(jì)及其結(jié)果

2.4 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

采用三因素三水平的Box-Behnken響應(yīng)面分析法進(jìn)一步對(duì)培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化，因素水平見表4，試驗(yàn)結(jié)果表見表5。

表4 響應(yīng)面分析試驗(yàn)因素及水平

表5 培養(yǎng)基組成Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)和結(jié)果

2.5 模型方程的建立與方差分析

運(yùn)用構(gòu)建好的二階經(jīng)驗(yàn)?zāi)Ｐ蛠磉M(jìn)行分析。對(duì)試驗(yàn)?zāi)Ｐ瓦M(jìn)行二階回歸擬合，得到回歸方程為：

表6 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果方差分析

注：“**”表示差異極顯著，P<0.01；“*”表示差異顯著，P<0.05；“—”表示差異不顯著，P>0.05

模型的響應(yīng)面圖及其等高線圖各變量與變量之間對(duì)響應(yīng)值的影響，等高線圖還可揭示出各變量之間交互作用的顯著性[29]。在硫酸鎂(X3)濃度保持固定的情況下，酵母粉(X1)與甘油(X2)對(duì)產(chǎn)酶的影響，如圖4所示，圖5與圖6同理。

圖4 響應(yīng)面法(X1，X2)立體分析及等高線圖

2.6 重組大腸桿菌產(chǎn)GluDH最優(yōu)培養(yǎng)基成分的確定

對(duì)模型方程進(jìn)行典型性分析說明，模型存在最優(yōu)的極值條件，即在相應(yīng)曲面的最高點(diǎn)處，通過分析可以得到GluDH的最大產(chǎn)出和各顯著因素添加的最佳質(zhì)量濃度：安琪酵母粉905 16.28 g/L，甘油11.3 g/L，MgSO4·7H2O 0.63 g/L，預(yù)測(cè)GluDH 活力的最大值為129.3 U/mL。

為證明模型預(yù)測(cè)的準(zhǔn)確性，進(jìn)行3次平行最優(yōu)條件下的重復(fù)試驗(yàn)，結(jié)果分別為128.7、128.9和129.6 U/mL，平均值為129.1 U/mL，與模型方程預(yù)測(cè)結(jié)果基本一致，這說明模型方程真實(shí)可行，能夠很好地預(yù)測(cè)實(shí)際的發(fā)酵結(jié)果。

圖5 響應(yīng)面法(X1，X3)立體分析及等高線圖

圖6 響應(yīng)面法(X2，X3)立體分析及等高線圖

3 討論

響應(yīng)面優(yōu)化法是將數(shù)學(xué)方法與統(tǒng)計(jì)方法相結(jié)合，尋求多因素系統(tǒng)中的最佳條件，對(duì)受多個(gè)變量影響的響應(yīng)問題進(jìn)行建模與分析，縮短優(yōu)化時(shí)間，提高應(yīng)用的可信度。該方法實(shí)驗(yàn)次數(shù)少，周期短，精度高，已成功地應(yīng)用于其他發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化，但目前還未有將該方法應(yīng)用于谷氨酸脫氫酶重組菌的發(fā)酵培養(yǎng)的報(bào)道。首先通過單因素試驗(yàn)對(duì)發(fā)酵培養(yǎng)基中最適的碳源和氮源進(jìn)行篩選，從工業(yè)生產(chǎn)成本和酶活兩個(gè)角度考慮，以甘油作為碳源和以安琪酵母粉905作為氮源能獲得較高的酶活，并且具有價(jià)格優(yōu)勢(shì)，能顯著降低工業(yè)化生產(chǎn)的成本。

不同的培養(yǎng)基成分及含量對(duì)酶活有不同程度的影響，因此選擇通過Plackett-Burman設(shè)計(jì)結(jié)果分析確定對(duì)酶活影響顯著的培養(yǎng)基成分，對(duì)培養(yǎng)基中的不同組分分別設(shè)計(jì)高、低兩個(gè)不同水平(高水平為低水平的1.25倍)，通過Design Expert軟件設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)，以酶活為響應(yīng)值，對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行方差分析，由P值可知影響顯著的3個(gè)因素分別為安琪酵母粉905、甘油和MgSO4·7H2O。為了進(jìn)一步逼近響應(yīng)值酶活的最佳區(qū)域，確定響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)點(diǎn)的取值范圍，設(shè)計(jì)最陡爬坡實(shí)驗(yàn)得到酶活的變化趨勢(shì)，并確定一組最高的酶活所對(duì)應(yīng)的培養(yǎng)基組分濃度作為響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)的中心點(diǎn)。最后對(duì)響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行建模和方差分析，得到二階回歸方程，分別對(duì)3個(gè)因素一次項(xiàng)、二次項(xiàng)和交互項(xiàng)影響的顯著性進(jìn)行分析，得到酵母粉和甘油的一次項(xiàng)和二次項(xiàng)均影響顯著，交互項(xiàng)影響不顯著，即各因素之間交互作用的影響較小。同時(shí)可得到響應(yīng)面圖及對(duì)應(yīng)的等高線圖，從各等高線圖可知，各自變量因素之間的交互作用不顯著，從響應(yīng)面圖可知最大橢圓表示在該圓上取值，酶活最低，產(chǎn)量最??；而最小橢圓取值，酶活最高，產(chǎn)量最大，大小橢圓之間酶活逐漸遞進(jìn)。對(duì)模型進(jìn)行分析，酶活的最優(yōu)值在曲面的最高處取得，得到預(yù)測(cè)最高值為129.3 U/mL，通過實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，所得的酶活值與預(yù)測(cè)值基本一致，說明模型有效可靠。

本文采用的是Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)和響應(yīng)面分析法結(jié)合對(duì)發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化，目前還未有將該方法應(yīng)用于谷氨酸脫氫酶重組菌的發(fā)酵培養(yǎng)的報(bào)道。通過響應(yīng)面確定最佳的培養(yǎng)基配方為：甘油11.3 g/L，安琪酵母粉905 16.28 g/L，MgSO4·7H2O 0.63 g/L，Na2HPO4·12H2O 17.1 g/L， KH2PO43 g/L，NH4Cl 1.5 g/L，NaCl 0.5 g/L。采用優(yōu)化后的培養(yǎng)基，搖瓶發(fā)酵產(chǎn)谷氨酸脫氫酶的酶活達(dá)到129.1 U/mL，是LB培養(yǎng)基酶活的2.58倍。結(jié)果證明Plackett-Burman和響應(yīng)面法結(jié)合的試驗(yàn)統(tǒng)計(jì)方法能比較快速地找出顯著的影響因素，并實(shí)現(xiàn)培養(yǎng)基組分優(yōu)化，優(yōu)化結(jié)果與實(shí)際發(fā)酵條件吻合良好，谷氨酸脫氫酶產(chǎn)量提高顯著。本試驗(yàn)成功地提高了谷氨酸脫氫酶的生產(chǎn)效率，為胺化還原制備L-草銨膦的工業(yè)化應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。