王艷慧， 陶 妍

(上海海洋大學(xué) 食品學(xué)院 上海水產(chǎn)品加工及貯藏工程技術(shù)研究中心， 上海 201306)

目前，抗生素在生物機(jī)體內(nèi)的殘留問題及微生物耐藥性問題已經(jīng)成為醫(yī)學(xué)和環(huán)境科學(xué)界面臨的重大挑戰(zhàn)，因此，研究和開發(fā)能夠替代傳統(tǒng)抗生素的天然生物類抗菌劑勢在必行，由此開展的抗菌肽方面的研究也應(yīng)運(yùn)而生?？咕膹V泛存在于生物體內(nèi)，是一類具有廣譜抗菌活性的小分子多肽[1-2]。研究表明，水生動(dòng)物由于其棲息環(huán)境不同于陸生動(dòng)物而致使其體內(nèi)擁有更為豐富的抗菌肽；尤其是水生動(dòng)物中的甲殼類動(dòng)物，雖然其體內(nèi)缺乏具有“記憶效應(yīng)”的特異性免疫機(jī)制，但仍然能抵御各種病原微生物的侵染，由此可以推斷它們主要是依賴自身先天性非特異性免疫系統(tǒng)中存在的諸多免疫因子[3]，而抗菌肽則是防御細(xì)菌、真菌和病毒等病原微生物入侵的最重要分子屏障[4-6]。

Crustin是甲殼類動(dòng)物來源的一系列富含半胱氨酸的小分子抗菌肽；除去N端信號(hào)肽序列后的肽段被稱為成熟肽，8個(gè)高度保守的半胱氨酸殘基位于成熟肽區(qū)域中，可形成由4個(gè)二硫鍵聯(lián)接的WAP結(jié)構(gòu)域；成熟肽賦予了crustin的生物學(xué)功能[7]。最初從普通濱蟹(Carcinusmaenas)的血淋巴中分離到的I型crustin具有抑制部分革蘭氏陽性菌的活性[8]；之后發(fā)現(xiàn)在三疣梭子蟹(Portunustrituberculatus)的血細(xì)胞和眼柄中存在3種I型crustin的同工型基因(PtCrustin1、PtCrustin2、PtCrustin3)，通過大腸桿菌原核表達(dá)系統(tǒng)對(duì)其中的PtCrustin2基因進(jìn)行重組表達(dá)后，發(fā)現(xiàn)重組體PtCrustin2具有抑制金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)和銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa)的生物學(xué)活性[9]。眾所周知，大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)沒有真核翻譯后加工的功能，難以形成正確的二硫鍵配對(duì)和空間構(gòu)像折疊，因而產(chǎn)生的蛋白質(zhì)經(jīng)常是不溶的，會(huì)在細(xì)菌內(nèi)聚集成包涵體而沒有足夠的生物學(xué)活性[10-11]。有鑒于此，近幾年來我們開展了基于畢赤酵母真核表達(dá)系統(tǒng)的各種水產(chǎn)生物來源抗菌肽的重組DNA表達(dá)[12-15]；就三疣梭子蟹PtCrustin2的真核表達(dá)而言，在先前的研究中，通過RT-PCR獲得編碼其成熟肽的天然cDNA，以pPIC9K為表達(dá)載體、畢赤酵母GS115為工程菌，初步實(shí)現(xiàn)了PtCrustin2的重組DNA 表達(dá)[16]。然而，因使用的表達(dá)載體為pPIC9K，目的片段5′端所添加的限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)為EcoR I，導(dǎo)致表達(dá)的重組體PtCrustin2 帶有非天然的N末端；另一方面，由于使用的編碼PtCrustin2成熟肽的基因?yàn)樘烊籧DNA，對(duì)于畢赤酵母來說可能存在某些密碼子的限制，所以導(dǎo)致了較低的表達(dá)量。

本研究在前期研究的基礎(chǔ)上，根據(jù)畢赤酵母的密碼子偏愛性對(duì)編碼三疣梭子蟹PtCrustin2成熟肽的天然cDNA進(jìn)行密碼子優(yōu)化并合成，選擇pPICZαA替代pPIC9K作為表達(dá)載體、畢赤酵母X-33為工程菌，以期提高重組體目的蛋白的表達(dá)量，為進(jìn)一步擴(kuò)大制備重組體PtCrustin2及深入研究其抑菌機(jī)理奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 載體、菌種和試劑

表達(dá)載體pPICZαA、畢赤酵母X-33和博來霉素由Invitrogen公司(美國)提供；克隆載體pMD-19T simple、限制性內(nèi)切酶(XhoⅠ、XbaⅠ、SacⅠ)和T4 DNA連接酶由Takara公司(日本)提供；大腸桿菌DH5α來源于本實(shí)驗(yàn)室；PCR反應(yīng)試劑、DNA回收試劑盒、質(zhì)粒小提試劑盒、DNA分子量Marker、蛋白質(zhì)分子量Marker和酵母基因組提取試劑盒均由天根生化科技有限公司(北京)提供；抗His標(biāo)簽鼠單克隆抗體和辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗小鼠IgG (H+L)由北京康為世紀(jì)生物科技公司提供；低鹽LB培養(yǎng)基、YPDS平板、MD平板、MM平板、BMG和BMM培養(yǎng)基均按照Invitrogen公司的說明書配制。

1.2 smPtCrustin2基因的優(yōu)化合成

根據(jù)已經(jīng)登錄(GenBank：JQ728435)的三疣梭子蟹PtCrustin2的cDNA序列，參考酵母的密碼子偏愛性，使用JAVA Codon Adaption Tool(http://www.jcat.de/Start.jsp)，對(duì)編碼PtCrustin2成熟肽的相關(guān)密碼子進(jìn)行優(yōu)化，由上海生工生物工程有限公司合成目的基因smPtCrustin2，在該目的基因的5′端依次添加Kex2信號(hào)肽酶切位點(diǎn)和XhoI酶切位點(diǎn)，在其3′端依次添加6×his標(biāo)簽和XbaI酶切位點(diǎn)。DNA測序委托上海生工生物工程有限公司完成。

1.3 構(gòu)建pPICZαA-smPtCrustin2及其鑒定

合成的目的基因以重組質(zhì)粒(pUCk-smPtCrustin2)的形式存在于大腸桿菌DH5α中；質(zhì)粒經(jīng)純化后，對(duì)pUCk-smPtCrustin2進(jìn)行XhoI和XbaI的雙酶切；目的片段經(jīng)回收后與pPICZαA(經(jīng)同樣酶切割過)混合(1∶ 4，V/V)，于16 ℃經(jīng)T4DNA連接酶作用16 h；轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α后在低鹽LB培養(yǎng)基中37 ℃培養(yǎng)12 h。通過XhoI和XbaI雙酶切驗(yàn)證、菌落PCR和DNA測序驗(yàn)證重組表達(dá)載體pPICZαA-smPtCrustin。

1.4 轉(zhuǎn)化畢赤酵母X-33及陽性酵母轉(zhuǎn)化子的篩選

經(jīng)SacI線性化處理后的pPICZαA-smPtCrustin2與畢赤酵母X-33感受態(tài)細(xì)胞混合(1∶ 8，V/V)，在0.2 cm電轉(zhuǎn)杯中的電轉(zhuǎn)條件如下：25 μF、200 Ω、1.5 kV；加入1 mL山梨醇(1 mol/L)；于30 ℃放置2 h后離心，菌體涂于含100 μg/mL博來霉素的YPDS平板上，在30 ℃避光培養(yǎng)至單克隆產(chǎn)生；挑取單菌落分別轉(zhuǎn)接至MM及MD平板上，篩選高拷貝甲醇利用快速型酵母轉(zhuǎn)化子；同時(shí)將線性pPICZαA空載體電轉(zhuǎn)入畢赤酵母X-33中作為陰性對(duì)照。以篩選到的轉(zhuǎn)化子的基因組DNA為模板，用pPICZαA載體上的醇氧化酶基因的引物5′AOX1和3′AOX1進(jìn)行PCR以鑒定陽性轉(zhuǎn)化子。

1.5 在畢赤酵母X-33中誘導(dǎo)表達(dá)目的蛋白及其表達(dá)產(chǎn)物的純化

將含pPICZαA-smPtCrustin2的陽性酵母轉(zhuǎn)化子于BMG培養(yǎng)基中培養(yǎng)至OD600為4～5(30 ℃、250 r/min)；對(duì)其進(jìn)行離心后，收集的菌體接種于BMM培養(yǎng)基，在28 ℃、250 r/min條件下使用0.5%甲醇誘導(dǎo)培養(yǎng)96 h，保持甲醇體積為0.5%；培養(yǎng)液經(jīng)離心后，使用0.22 μm濾膜對(duì)上清進(jìn)行過濾，通過固化金屬離子親和層析(IMAC)分離純化重組蛋白，經(jīng)福林-酚法測定純化產(chǎn)物的濃度，并估算表達(dá)量。Tricine-SDS-PAGE條件：4%濃縮膠、10%夾層膠、15.5%分離膠。

1.6 重組體smPtCrustin2的Western Blot分析

經(jīng)Tricine-SDS-PAGE后的凝膠上的條帶在100 V電壓下，經(jīng)過1.5 h電轉(zhuǎn)至PVDF膜上，用TBST洗膜3次(每次10 min)，將膜浸于封閉液中1 h；再用TBST洗膜3次(每次10 min)，先與鼠單克隆抗體室溫下培育2 h，用TBST洗去剩余抗體；再與辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG (H+L) 室溫下培育1 h，用TBST漂洗后使用DAB試劑盒進(jìn)行顯色。

2 結(jié)果與分析

2.1 優(yōu)化前后的PtCrustin2成熟肽基因比較

如圖1所示，優(yōu)化后的smPtCrustin2分子量為270 bp，除去XbaI、XhoI、終止密碼子、6×his標(biāo)簽和Kex2酶切位點(diǎn)，編碼了由77個(gè)氨基酸殘基組成的PtCrustin2成熟肽；在不改變氨基酸殘基的前提下，半胱氨酸、脯氨酸、谷氨酸、賴氨酸、天冬氨酸等15個(gè)殘基的密碼子被修改。與天然cDNA“mPtCrustin2”相比，其5′端添加的XhoI酶切位點(diǎn)和Kex2信號(hào)肽酶切位點(diǎn)預(yù)示了表達(dá)的重組體smPtCrustin2含天然N末端。

2.2 基于菌落PCR和雙酶切的重組表達(dá)載體pPICZαA-smPtCrustin2的鑒定

構(gòu)建的重組表達(dá)載體pPICZαA-smPtCrustin2如圖2所示。首先，采用pPICZαA的通用引物5′AOX1和3′AOX1對(duì)含pPICZαA-smPtCrustin2的大腸桿菌進(jìn)行菌落PCR鑒定，結(jié)果如圖3-a所示，1個(gè)約743 bp的理論分子量條帶非常明顯。另外，采用XhoI和XbaI對(duì)純化的pPICZαA-smPtCrustin2進(jìn)行雙酶切鑒定，電泳結(jié)果顯示了1個(gè)與smPtCrustin2的理論分子量(270 bp)相符的條帶，而另一個(gè)在近10 000 bp處的條帶屬于pPICZαA(圖3-b)。此外，對(duì)pPICZαA-smPtCrustin2的DNA測序結(jié)果也證明了pPICZαA與smPtCrustin2連接正確。

*為終止密碼子；下劃線為Kex2信號(hào)肽酶切位點(diǎn)；斜體為限制性酶切位點(diǎn)；方框?yàn)?×his標(biāo)簽；陰影為半胱氨酸殘基

圖1密碼子優(yōu)化前后的PtCrustin2成熟肽基因的比較

Figure 1 Comparison of mPtCrustin2 optimized and un-optimized for codons

圖2 pPICZαA-smPtCrustin2重組表達(dá)載體的構(gòu)建

M：DNA 分子量Marker；1：PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；2：酶切產(chǎn)物

圖3基于菌落PCR(a)和雙酶切(b)的pPICZαA-smPtCrustin2鑒定

Figure 3 Identification of pPICZαA-smPtCrustin2 by colony PCR (a) and endonuclease digestion (b)

2.3 酵母轉(zhuǎn)化子的鑒定

通過含100 μg/mL博來霉素的YPDS平板篩選和MM及MD平板篩選，共獲得6株高拷貝酵母轉(zhuǎn)化子；經(jīng)培養(yǎng)并提取基因組DNA為模板，以上述的5′ AOX1和3′-AOX1為引物進(jìn)行PCR驗(yàn)證，同時(shí)以含pPICZαA空載體的酵母轉(zhuǎn)化子作為陰性對(duì)照。PCR結(jié)果如圖4所示，1～6號(hào)泳道均顯示了與理論分子量相符的約743 bp的條帶；另一個(gè)由7號(hào)泳道顯示的約493 bp的條帶符合陰性對(duì)照的理論分子量，據(jù)此，可以證明pPICZαA-smPtCrustin2與畢赤酵母基因組DNA已成功整合。

M：DNA 分子量Marker；1～6：含有pPICZαA-smPtCrustin2的轉(zhuǎn)化子；7：含有pPICZαA的轉(zhuǎn)化子

圖4基于PCR的陽性酵母轉(zhuǎn)化子的鑒定

Figure 4 Identification of positive yeast transformants by PCR

2.4 基于甲醇誘導(dǎo)表達(dá)的重組體smPtCrustin2及其純化

在BMM培養(yǎng)基中于28 ℃、250 r/min條件下，對(duì)篩選到的高拷貝甲醇利用快速型酵母轉(zhuǎn)化子進(jìn)行96 h的0.5%甲醇誘導(dǎo)培養(yǎng)；對(duì)培養(yǎng)液進(jìn)行IMAC法純化后，經(jīng)Tricine-SDS-PAGE分析顯示(圖5)：共有2條清晰明顯的條帶(1號(hào)泳道)，小于14.4 ku的條帶應(yīng)該為目的條帶，而在近20 ku處的條帶被推測是目的蛋白形成的二聚體。另一方面，含空載體的酵母轉(zhuǎn)化子的表達(dá)上清中并未出現(xiàn)任何明顯條帶(2號(hào)泳道)，由此證明重組體smPtCrustin2被成功表達(dá)。通過福林-酚法測定的純化產(chǎn)物濃度為0.56 mg/mL，進(jìn)一步推算至產(chǎn)量為22.4 mg/L。

2.5 基于Western Blot分析的重組體smPtCrustin2的鑒定

對(duì)上述純化產(chǎn)物進(jìn)行Western Blot分析，因重組體smPtCrustin2的C端含6×his標(biāo)簽，所以與鼠單克隆抗體(抗his標(biāo)簽)能夠雜交。結(jié)果如圖6所示，1號(hào)泳道為純化產(chǎn)物，在約10 ku處的一個(gè)明顯雜交條帶應(yīng)該屬于目的蛋白；而大于16 ku的另一個(gè)雜交條帶可能為目的蛋白的二聚體。2號(hào)泳道是含pPICZαA空載體的酵母轉(zhuǎn)化子的表達(dá)上清，未見任何明顯的雜交條帶。Western Blot分析的結(jié)果基本上與Tricine-SDS-PAGE分析的結(jié)果相符，由此證明通過本研究建立的畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)可以成功表達(dá)重組體目的蛋白。

M：蛋白質(zhì)分子量Marker；1：純化的smPtCrustin2；2：含pPICZαA空載體的酵母培養(yǎng)液上清

圖5純化的smPtCrustin2的Tricine-SDS-PAGE分析

Figure 5 The purified smPtCrustin2 was analyzed by tricine-SDS-PAGE

M：蛋白質(zhì)分子量Marker；1：純化的smPtCrustin2；2：含pPICZαA空載體的酵母培養(yǎng)液上清

圖6純化的smPtCrustin2的WesternBlot分析

Figure 6 The purified smPtCrustin2 was analyzed by Western Blot

3 討論

三疣梭子蟹屬于無脊椎動(dòng)物中的水產(chǎn)甲殼類動(dòng)物，主要依靠血細(xì)胞吞噬和包囊化作用發(fā)揮其防御機(jī)能。它們雖然缺乏抗體介導(dǎo)的特異性免疫功能、不產(chǎn)生免疫球蛋白，但具有先天性的非特異性免疫系統(tǒng)，能夠識(shí)別和有效清除入侵的病原微生物[17]。由此可以推測，較脊椎動(dòng)物而言，由甲殼動(dòng)物免疫系統(tǒng)產(chǎn)生的免疫因子具有更為天然的優(yōu)勢成為天然抗菌劑開發(fā)的良好候選者。我們?cè)谇捌谘芯恐?，聚焦于三疣梭子蟹先天性免疫系統(tǒng)中的重要免疫因子PtCrustin2成熟肽，對(duì)其天然cDNA進(jìn)行了克隆和實(shí)現(xiàn)了在畢赤酵母中的表達(dá)[16]，然而，如前言中述及的因前期研究策略上存在弊端，表達(dá)效率很低。據(jù)此，本文通過3個(gè)方面對(duì)畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行了改進(jìn)。

根據(jù)Yang等[18]的報(bào)道，他們對(duì)黑曲霉(Aspergillusniger)lip2基因的密碼子進(jìn)行優(yōu)化后在畢赤酵母細(xì)胞中的表達(dá)量和生物學(xué)活性分別提高了11.6和5.3倍；王方芹等[19]根據(jù)釀酒酵母的密碼子偏愛性優(yōu)化了黑曲霉的α-L-鼠李糖苷酶基因rha，發(fā)現(xiàn)重組rha的表達(dá)量提高了2.9倍；我們最近報(bào)道的在畢赤酵母X-33中高效表達(dá)的斑馬魚重組β-防御素(zfDB3)的編碼基因中有28個(gè)密碼子也是被優(yōu)化過的[20]。此外，楊剛剛等[21]通過對(duì)載體-宿主菌組合的改變，顯著提高了重組蛋白的表達(dá)量。有鑒于此，本文一方面參考畢赤酵母的密碼子偏愛性，對(duì)編碼三疣梭子蟹PtCrustin2成熟肽的天然cDNA進(jìn)行檢測，對(duì)顯示低頻的53個(gè)密碼子進(jìn)行了優(yōu)化；另一方面，將之前使用的表達(dá)載體pPIC9K改為pPICZαA，因后者分子量較小，其長度僅為pPIC9K的1/3，使得轉(zhuǎn)化操作和染色體的整合相對(duì)更容易；此外，將宿主由原來的畢赤酵母GS115改為畢赤酵母X-33，因X-33屬野生型的酵母菌株，其對(duì)外源蛋白具有更強(qiáng)的分泌和適應(yīng)能力[22]。本研究結(jié)果證明，上述的改進(jìn)策略使重組體smPtCrustin2的表達(dá)量與之前未經(jīng)密碼子優(yōu)化的表達(dá)量(5.25 mg/mL)[16]相比，提高了4倍以上，達(dá)到了本研究的預(yù)期目的。通過對(duì)目的基因5′端進(jìn)行XhoⅠ酶切位點(diǎn)和Kex2信號(hào)肽酶切位點(diǎn)的添加，確保了“重組體smPtCrustin2”在分泌表達(dá)至胞外時(shí)含有純粹的N末端。

4 結(jié)論

本研究通過使用經(jīng)密碼子優(yōu)化的三疣梭子蟹PtCrustin2成熟肽基因“smPtCrustin2”和構(gòu)建重組表達(dá)載體pPICZαA-smPtCrustin2，在畢赤酵母X-33中，經(jīng)0.5%甲醇誘導(dǎo)，在28 ℃、250 r/min條件下培養(yǎng)96 h，獲得含重組體smPtCrustin2的表達(dá)產(chǎn)物，經(jīng)IMAC法得到純化的重組體smPtCrustin2，表達(dá)量為22.4 mg/L。