許曉雙， 張大為， 孔 韌

(江蘇理工學(xué)院 生物信息與醫(yī)藥工程研究所， 常州 213001)

HIV-1 整合酶(Integrase，IN)是HIV-1病毒復(fù)制過(guò)程中的關(guān)鍵酶，能夠介導(dǎo)逆轉(zhuǎn)錄后形成的病毒cDNA與宿主細(xì)胞基因組的整合，也是研究抗艾滋病藥物的重要靶標(biāo)[1]。在已上市的藥物中，雷特格韋(Raltegravir，RAL)、埃替格韋(Elvitegravir，EVG)和度魯特韋(Dolutegravir，DTG)是IN催化位點(diǎn)抑制劑，其分子機(jī)制是結(jié)合于整合酶的催化活性口袋從而抑制整合酶的鏈轉(zhuǎn)移反應(yīng)活性[2]。近年來(lái)，由于已上市藥物存在越來(lái)越嚴(yán)重的耐藥性問(wèn)題，迫切需要進(jìn)行基于新機(jī)制的抗艾滋病藥物研發(fā)。

HIV-1自身編碼的蛋白質(zhì)數(shù)量有限，需要依賴宿主細(xì)胞蛋白及其信號(hào)通路完成自身復(fù)制。人轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白SR2(tansportin-SR2，TRN-SR2)是β-核素蛋白，是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的一種HIV-1整合酶輔助因子，主要參與HIV-1生命周期中整合前復(fù)合體PIC(pre-integration complex)核輸入過(guò)程，促進(jìn)HIV感染。通過(guò)核孔蛋白復(fù)合物將HIV-1 PIC及病毒輔助蛋白運(yùn)送到細(xì)胞核的過(guò)程稱為核輸入過(guò)程，是一個(gè)多因子參與的復(fù)雜過(guò)程[3]。HIV-1 PIC包括多種病毒的基質(zhì)蛋白、IN、病毒蛋白R(shí)、cDNA以及多種細(xì)胞輔助因子，如晶狀體上皮細(xì)胞衍生生長(zhǎng)因子(LEDGF /p75)、輸入蛋白α和轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白SR2[3]。因此，HIV-1核輸入過(guò)程主要依賴于PIC成分或單獨(dú)HIV-1蛋白與細(xì)胞核輸入因子之間的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用[4]。Demeulemeester等[5]基于TRN-SR2與HIV-1 IN蛋白-蛋白相互作用利用AlphaScreen高通量篩選技術(shù)從25 608個(gè)小分子中找到2個(gè)活性化合物，它們能夠阻斷HIV-1核輸入過(guò)程，提示TRN-SR2與HIV-IN的相互作用是抗HIV治療的有效靶點(diǎn)。因此，尋找和設(shè)計(jì)開(kāi)發(fā)TRN-SR2與HIV-1 IN相互作用的高效抑制劑具有重要的發(fā)展前景和研究意義。

為了開(kāi)展以TRN-SR2與HIV-1 IN相互作用為靶點(diǎn)的抑制劑篩選研究，本文將人源蛋白TRN-SR2進(jìn)行原核表達(dá)純化，從而獲得可溶表達(dá)且具有活性的重組TRN-SR2蛋白，并利用生物膜干涉技術(shù)(Bio-Layer Interferometry，BLI)檢測(cè)TRN-SR2與HIV-1 IN體外相互作用，同時(shí)采用均相時(shí)間分辨熒光(Homogeneous time resolved fluorescence，HTRF)技術(shù)和交叉滴定實(shí)驗(yàn)確定TRN-SR2與HIV-1 IN相互作用的最適反應(yīng)濃度。本文將為后續(xù)TRN-SR2與HIV-1 IN相互作用為靶點(diǎn)的抑制劑的開(kāi)發(fā)提供研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1菌株及質(zhì)粒

大腸桿菌(Escherichiacoli)菌株Rosetta(DE3)、DH5α購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司。pGST-TRN-SR2重組質(zhì)粒由臺(tái)灣生物醫(yī)學(xué)研究所的Woan-Yuh Tarn博士饋贈(zèng)[5]。

1.1.2試劑與儀器

GST純化柱填料購(gòu)自常州天地人和生物科技有限公司，黑色96孔板、384孔聚丙烯淺孔微孔板購(gòu)自Perkin Elmer(美國(guó))，Anti-6His-XL665受體磁珠、Anti-GST-Cryptate供體磁珠購(gòu)自Cisbio公司(法國(guó))，其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。微孔板恒溫振蕩器BE-9008(其林貝爾儀器制造有限公司)，多功能酶標(biāo)儀Envision 2102 multilabel reader(珀金埃爾默儀器有限公司PerkinElmer Life Sciences)，F(xiàn)orteBio Octet Red 96分子相互作用分析儀(美國(guó))。

1.2 方法

1.2.1TRN-SR2的表達(dá)純化

重組質(zhì)粒pGST-TRN-SR2的載體為pGEX-2T，將重組質(zhì)粒pGST-TRN-SR2轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，第2天挑取單個(gè)克隆進(jìn)行DNA序列測(cè)定，測(cè)序工作在蘇州金維智公司完成，測(cè)序結(jié)果正確。然后將重組質(zhì)粒pGST-TRN-SR2的轉(zhuǎn)化大腸桿菌Rosetta(DE3)菌株，37 ℃培養(yǎng)過(guò)夜，將單個(gè)克隆37 ℃振蕩培養(yǎng)過(guò)夜，然后擴(kuò)大培養(yǎng)至菌液在600 nm下的吸光值達(dá)到0.6，添加0.5 mmol/L IPTG 28 ℃誘導(dǎo)表達(dá)過(guò)夜，8000 r/min離心收集菌體。裂解液(50 mmol/L Tris-HCl，pH 7.5，150 mmol/L NaCl，5 mmol/L DTT)重懸菌體，超聲破碎后離心收集上清。利用GST親和色譜柱純化TRN-SR2蛋白，用洗脫buffer(50 mmol/L Tris-HCl，pH 7.5，150 mmol/L NaCl，5 mmol/L DTT，20 mmol/L reduced glutathione)洗脫目的蛋白，采用SDS-PAGE檢測(cè)蛋白表達(dá)純化結(jié)果，并使用BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒測(cè)定蛋白質(zhì)含量。HIV-1 IN的表達(dá)純化參考文獻(xiàn)[6]。

1.2.2 BLI體外檢測(cè)TRN-SR2與HIV-1 IN的相互作用

在Octet RED96系統(tǒng)中操作BLI實(shí)驗(yàn)，反應(yīng)體積為200 μL，反應(yīng)溫度為30 ℃。實(shí)驗(yàn)方法如下：1)基線平衡。首先將Streptavidin (SA)標(biāo)記的探針?lè)湃隤BST(0.05% Tween，pH 7.5)中浸濕20 min，在系統(tǒng)中進(jìn)行第一次基線(Baseline)平衡，時(shí)間120 s。2)蛋白固定。將探針轉(zhuǎn)移入含有500 nmol/L biotin標(biāo)記的終濃度為5 μmol/L HIV-1 IN的PBST中進(jìn)行HIV-1 IN蛋白固定(Loading)，時(shí)間600 s。3)結(jié)合測(cè)定。將固定后含有biotin的HIV-1 IN探針重新轉(zhuǎn)移到PBST中進(jìn)行第2次基線(Baseline)平衡，時(shí)間120 s；然后將探針轉(zhuǎn)移至終濃度5 μmol/L TRN-SR2的PBST中進(jìn)行結(jié)合(Association)測(cè)定，時(shí)間150 s。4)蛋白解離。將結(jié)合后的探針再次轉(zhuǎn)移到PBST中進(jìn)行解離(Dissociation)實(shí)驗(yàn)，時(shí)間300 s。

1.2.3基于HTRF確定TRN-SR2與HIV-1 IN相互作用最適濃度

采用交叉滴定實(shí)驗(yàn)考察兩個(gè)蛋白在384孔板中的最適反應(yīng)濃度，實(shí)驗(yàn)中所用蛋白和化合物均用反應(yīng)Buffer(25 mmol/L Tris-HCl pH 7.5，1 mg/mL BSA，2 mmol/L MgCl2，150 mmol/L NaCl，0.1% NP40)稀釋。實(shí)驗(yàn)設(shè)置HIV-1 IN與TRN-SR2的起始濃度為320 nmol/L，并依次梯度稀釋至160、80、40、20和10 nmol/L，以0 nmol/L為對(duì)照。將4 μL HIV-1 IN、4 μL TRN-SR2、2 μL Buffer依次加入到384孔板中混勻，25 ℃，300 r/min反應(yīng)30 min。反應(yīng)結(jié)束后將5 μL 0.8 nmol/L的GST-Cryptate供體磁珠和5 μL 4 nmol/L的Anti-6His-XL665受體磁珠(含100 mmol/L KF)混勻加入到384孔板中，繼續(xù)反應(yīng)1 h后使用Envision 2102 multilabel reader酶標(biāo)儀進(jìn)行檢測(cè)[6]。儀器檢測(cè)條件：以320 nm為激發(fā)光，讀取665 nm和620 nm處的發(fā)射光，分別計(jì)算各孔665 nm和620 nm處熒光強(qiáng)度的比值(Ration 665/620)。

1.2.4數(shù)據(jù)處理

結(jié)合-解離曲線、動(dòng)力學(xué)參數(shù)使用Data analysis(ForteBio，version 7.1)進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。KD值是基于結(jié)合-解離曲線并通過(guò)nonlinear global fitting model模擬計(jì)算得出解離常數(shù)(Kd)與結(jié)合常數(shù)(Ka)的比值，該值可反映分子間親和力的大小。HIV-1 IN與TRN-SR2濃度均為5 μmol/L，重復(fù)3次計(jì)算平均值。使用軟件Graphpad 6.0作柱狀圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 TRN-SR2與IN-HIS的表達(dá)純化結(jié)果

圖1為T(mén)RN-SR2在大腸桿菌Rosetta(DE3)中的表達(dá)結(jié)果，TRN-SR2在經(jīng)0.5 mmol/L的IPTG誘導(dǎo)后，目的蛋白(約130 ku)蛋白量明顯增多，再通過(guò)20 mmol/L GSH洗脫，SDS-PAGE電泳檢測(cè)在130 ku左右有明顯的TRN-SR2蛋白條帶，使用BCA法測(cè)得TRN-SR2蛋白的濃度約為0.8 mg/mL。

2.2 BLI體外檢測(cè)TRN-SR2與HIV-1 IN的相互作用結(jié)果

圖2為BLI體外檢測(cè)5 μmol/L TRN-SR2與HIV-1 IN相互作用的結(jié)合-解離曲線，曲線中的橫坐標(biāo)是結(jié)合解離持續(xù)時(shí)間，縱坐標(biāo)為相位移變化(代表結(jié)合信號(hào)的強(qiáng)弱)。圖2中TRN-SR2與HIV-1 IN在Octet系統(tǒng)Association步驟中曲線明顯升高，說(shuō)明TRN-SR2與HIV-1 IN親和力較高，結(jié)合效果較好。通過(guò)結(jié)合-解離曲線計(jì)算出TRN-SR2與HIV-1 IN的KD值為45.2 nmol/L。

1：誘導(dǎo)前；2：誘導(dǎo)后；3：上清；4-6：20 mmol/L GSH洗脫；M：Marker

圖1SDS-PAGE檢測(cè)TRN-SR2的表達(dá)純化結(jié)果

Figure 1 The expression and purification results of TRN-SR2 was detected by SDS-PAGE

圖2 TRN-SR2與HIV-1 IN相互作用的結(jié)合-解離曲線(平滑的為擬合曲線)

2.3 TRN-SR2與HIV-1 IN相互作用的最適濃度

圖3為不同濃度TRN-SR2與HIV-1 IN相互作用的HTRT交叉滴定實(shí)驗(yàn)結(jié)果。結(jié)果表明：當(dāng)TRN-SR2蛋白濃度不變時(shí)，熒光信號(hào)值隨著HIV-1 IN蛋白濃度呈現(xiàn)拋物線狀變化。同樣，當(dāng)HIV-1 IN蛋白濃度不變時(shí)，熒光信號(hào)值隨著TRN-SR2蛋白濃度也呈現(xiàn)拋物線狀變化。TRN-SR2蛋白濃度為20 nmol/L和HIV-1 IN蛋白濃度為40 nmol/L時(shí)，信號(hào)值達(dá)到最大，實(shí)驗(yàn)靈敏度最高。

圖3 不同濃度TRN-SR2與HIV-1 IN相互作用的HTRT實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3 討論與結(jié)論

目前上市治療HIV的藥物雖然能夠有效降低患者體內(nèi)病毒的數(shù)量，但長(zhǎng)期服用均有不良反應(yīng)發(fā)生，而耐藥毒株的快速出現(xiàn)也使艾滋病的治療形勢(shì)更加嚴(yán)峻，因此研究者們迫切希望找到新型抗HIV療法和以新作用機(jī)制為靶點(diǎn)的抗病毒藥物[3]。HIV整合前核輸入過(guò)程中TRN-SR2與HIV-IN的相互作用已成為抗HIV-1 IN藥物篩選的新靶點(diǎn)。本文通過(guò)原核表達(dá)純化能夠簡(jiǎn)單快速得到大量的重組TRN-SR2蛋白用于后續(xù)的抑制劑篩選實(shí)驗(yàn)研究，同時(shí)也降低了經(jīng)濟(jì)成本。

生物膜干涉技術(shù)是一種快速檢測(cè)分子間相互作用的方法，具有準(zhǔn)確度高、高通量和速度快等優(yōu)點(diǎn)[7]。HIV-1 IN晶體結(jié)構(gòu)研究表明[8-10]，二聚化的整合酶CCD形成的結(jié)合口袋是與其他輔助因子發(fā)生相互作用關(guān)鍵位置。因此本文原核表達(dá)純化了HIV-1 IN-CCD蛋白，并通過(guò)BLI檢測(cè)其與TRN-SR2相互作用，計(jì)算出TRN-SR2與HIV-1 IN的KD值為45.2 nmol/L。Stephanie等[11]通過(guò)AlphaScreen的方法確定His6-IN/GST-TRN-SR2相互作用的KD值為16.8 nmol/L。根據(jù)BLI原理，KD值即為親和力常數(shù)，它只與分子間相互作用大小有關(guān)，與分子濃度無(wú)關(guān)，其數(shù)值越小代表的分子間親和力越強(qiáng)[12]。行業(yè)內(nèi)比較認(rèn)可的親和力差異的評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)為：“KD值差異10倍”可認(rèn)定2種分子與配體間的親和力存在明顯差異，因此本文測(cè)得KD值45.2 nmol/L與文獻(xiàn)報(bào)道的16.8 nmol/L沒(méi)有明顯差異[12-13]。根據(jù)計(jì)算公式，當(dāng)KD值為10-6mol/L時(shí)，解離百分比約為0.1%，因此TRN-SR2與HIV-1 IN的KD值為45.2 nmol/L同時(shí)也說(shuō)明兩者結(jié)合后的解離百分比小于0.1%。以上結(jié)果表明TRN-SR2與HIV-1 IN在體外相互作用結(jié)合效果較好，可用于后續(xù)的抑制劑篩選研究。

HTRF是常用于高通量藥物篩選的方法，具有穩(wěn)定、經(jīng)濟(jì)、操作簡(jiǎn)便的特點(diǎn)[14-15]，可用于TRN-SR2與HIV-1 IN相互作用抑制劑的活性評(píng)價(jià)。本文通過(guò)交叉滴定實(shí)驗(yàn)確定篩選體系中TRN-SR2和HIV-1 IN蛋白最適反應(yīng)濃度分別為20 nmol/L和40 nmol/L，這將為開(kāi)展以TRN-SR2與HIV-1 IN相互作用為靶點(diǎn)的抑制劑篩選研究提供良好基礎(chǔ)。