張小卿，馬賢德，吳 怡，王建軍，吳景東△

(1. 遼寧中醫(yī)藥大學(xué)，遼寧省針灸養(yǎng)生康復(fù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，沈陽 110847； 2. 遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬二院， 沈陽 1100342； 3. 西安海棠職業(yè)學(xué)院，西安 710038)

日光中的長波紫外線(UVA)輻射可深入皮膚真皮以下的組織，破壞皮膚膠原蛋白，彈性纖維組織等微細(xì)結(jié)構(gòu)產(chǎn)生皺紋，令皮膚松弛衰老，這在醫(yī)學(xué)上稱之為皮膚光老化[1]。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為皮膚光老化主要由光毒侵襲所致，且其傷害無法逆轉(zhuǎn)[2]。光毒侵襲日久，導(dǎo)致體內(nèi)正氣虛損，日久氣血漸衰，運(yùn)行緩滯，血脈瘀阻，以致血瘀。桃紅四物湯在臨床治療由血瘀引起的多種病證都有顯著效果，在皮膚科常用以治療黃褐斑、過敏性紫癜等疾病?；谇捌趯V輻射致人真皮微血管內(nèi)皮細(xì)胞(HDMEC)損害的研究發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)化生長因子(Transforming growth factor， TGF-β)活性表達(dá)的增加，具有促進(jìn)Ⅰ型膠原和Ⅲ型膠原蛋白含量的作用，細(xì)胞中釋放的TGF-β受體激活Smad蛋白后，形成的TGF-β/Smads信號傳導(dǎo)通路可以通過調(diào)控其下游的基因表達(dá)來控制膠原合成，因此本實(shí)驗(yàn)觀察了桃紅四物湯對UVA輻射致HDMEC細(xì)胞損傷后TGF-β、Smad2/3的含量表達(dá)，進(jìn)而探討其對皮膚光老化的防治作用。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動物

SPF級8周齡SD雄性大鼠20只，體質(zhì)量(200±20) g，購自遼寧本溪長生生物技術(shù)有限公司(許可證號SCXK(遼)2010-0001)。

1.2 桃紅四物湯方藥組成

熟地15 g，當(dāng)歸15 g， 白芍10 g， 川芎8 g， 桃仁9 g，紅花6 g。

1.3 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞

人真皮中微血管內(nèi)皮細(xì)胞(HDMEC)購自通派(上海)科技有限公司。

1.4 實(shí)驗(yàn)試劑

Anti-TGF-β: ab92486，兔多克隆抗TGF -β抗體，適用于人、小鼠、大鼠等來源樣本，ABCAM公司；Anti-Smad2: ab33875，兔單克隆抗Smad2 抗體，適用于人、小鼠、大鼠等來源樣本，ABCAM公司；Anti-Smad3: ab40854，兔單克隆抗Smad3抗體，適用于人、小鼠、大鼠等來源樣本，ABCAM公司；Anti-β-actin：ab8226，小鼠單克隆抗β-Actin抗體，適用于人、小鼠、大鼠等來源樣本，ABCAM公司。TUNEL試劑盒，江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司，KGA7071。

1.5 實(shí)驗(yàn)儀器

UV輻照計(jì)(UV-340)，上海Sigma高科技有限公司；全自動酶標(biāo)儀(anthos 2010型)，奧地利anthos公司；倒置熒光生物顯微鏡，德國萊卡公司；多孔離心機(jī)(c412)，法國Jouan公司；細(xì)胞培養(yǎng)瓶(25 cm2)，美國康寧公司；培養(yǎng)板(6孔、96孔)，美國康寧公司；凝膠成像分析系統(tǒng)(Chemi Imager 5500型)，美國Alphainnotech Chemi Imager 公司；垂直版電泳裝置(Mini-Protein Ⅲ型)，美國BIORAD公司。

2 方法

2.1 含藥血清的提取

將25只SD大鼠隨機(jī)分成5組，空白血清組給予生理鹽水2 ml/只，陽性對照組給予維生素E0.09 mg/只，其余3組分別給予高劑量桃紅四物湯、中劑量桃紅四物湯、低劑量桃紅四物湯。桃紅四物湯給藥量根據(jù)《等效劑量系數(shù)折算法》計(jì)算200 g大鼠每天為1.23 g，低、中、高劑量含藥血清組采用3、6、9倍等效劑量作為實(shí)驗(yàn)用量，將藥物濃縮至2 ml，灌胃7 d后提取大鼠血清。

2.2 紫外線照射

取對數(shù)生長期的HDMEC細(xì)胞，照射前棄去舊培養(yǎng)液，0.25%胰酶消化后，加入新鮮培養(yǎng)液制成細(xì)胞懸液接種于96孔板，于37 ℃ 5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h后棄去舊的培養(yǎng)液，PBS清洗2次，反復(fù)洗至PBS無色加入200 μL PBS，放在紫外線下照射。照射前用UV輻照計(jì)測試UVA紫外燈強(qiáng)度，照射距離固定，UV劑量=UV輻照強(qiáng)度×?xí)r間，對照孔給予錫箔紙覆蓋，照射后吸去孔內(nèi)PBS，加入新鮮培養(yǎng)液放回培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)。

2.3 MTT 法檢測不同劑量UVA對HDMCE細(xì)胞增殖活性的影響

不同劑量UVA(2、5、8、10 J/cm2)照射HDMCE細(xì)胞后培養(yǎng)24 h，加入20 μL 3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴鹽(MTT， 5 g/L)，37 ℃培養(yǎng)箱繼續(xù)孵育4 h后終止培養(yǎng)，每孔加入150 μL 二甲基亞砜(DMSO)低速振蕩致均勻混合，酶標(biāo)儀選擇OD 490 nm處測量各孔A值。

2.4 細(xì)胞分組及干預(yù)

將HDMEC細(xì)胞株分為空白對照組、模型對照組、桃紅四物湯高劑量組、桃紅四物湯中劑量組、桃紅四物湯低劑量組和陽性對照組6組。除空白對照組外，其余各組細(xì)胞株均給予5 J/cm2的UVA照射，之后模型對照組加入空白血清培養(yǎng)液，其他各組加入相應(yīng)含藥血清培養(yǎng)液，培養(yǎng)24 h收集細(xì)胞及50 ml培養(yǎng)上清液，用于檢測上清液中TGF-β含量。瓶底部的細(xì)胞用PBS緩沖液洗滌3次，末次棄掉PBS后，加入1 ml WB及IP細(xì)胞裂解液，輕搖培養(yǎng)瓶使裂解液鋪滿瓶底，冰面上裂解15 min，然后以移液器吹打裂解液，使細(xì)胞全部裂解，冰面上靜置5 min后，12000 g離心力，4 ℃離心15 min，上清液即為總蛋白，BCA法測定蛋白濃度，采用凝膠成像分析系統(tǒng)自帶軟件測定目的蛋白和內(nèi)參蛋白條帶的灰度值，并以目的蛋白條帶灰度值/內(nèi)參條帶灰度值的比值，作為該蛋白的相對表達(dá)水平進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2.5 采用Tunel法對各組細(xì)胞凋亡進(jìn)行檢測

圖1 不同強(qiáng)度UVA照射細(xì)胞活性O(shè)D值折線圖

制備細(xì)胞爬片，并以2%多聚甲醛溶液固定24 h，然后在流水下充分沖洗，吸干爬片周邊水分后滴加蛋白酶K，37 ℃孵育30 min透膜，然后PBS洗滌3次。滴加TDT酶反應(yīng)液50 μl/片，37 ℃避光孵育60 min。取出爬片后PBS漂洗3次，滴加Streptavidin-Fluorescein 標(biāo)記液，濕盒中37 ℃孵育30 min，取出后洗滌3次，熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞凋亡情況。每張細(xì)胞爬片選取5個染色良好視野，計(jì)數(shù)每個視野中凋亡的細(xì)胞數(shù)，以5個視野的平均凋亡數(shù)作為該例樣本的細(xì)胞凋亡水平并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

3 結(jié)果

3.1 UVA照射后HDMEC增殖活性變化顯示

隨著UVA照射時(shí)間的加長即照射劑量的不斷加大，各照射組細(xì)胞活性明顯減弱(P<0.05)，UVA照射劑量為5 J/cm2時(shí)，OD值切線與X軸的夾角呈最大，說明在此照射劑量時(shí)HDMEC活性被明顯抑制。因此本研究選擇UVA劑量為5 J/cm2，作為HDMEC損傷模型的UVA照射劑量。

3.2 細(xì)胞凋亡情況

表1圖2顯示，與空白對照組比較，模型對照組細(xì)胞凋亡數(shù)顯著上升，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；與模型對照組比較，桃紅四物湯含藥血清干預(yù)的各組細(xì)胞凋亡數(shù)均顯著下調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，且高劑量含藥血清組干預(yù)效果最為顯著。

注：圖中淺色箭頭所示為發(fā)生凋亡的細(xì)胞圖2 各組細(xì)胞凋亡情況比較

表1 各組細(xì)胞凋亡率及細(xì)胞培養(yǎng)上清液中TGF-β含量比較

注：與空白對照組比較：*P<0.05，**P<0.01；與模型組對照比較：##P<0.01；與桃紅四物湯高劑量組比較：▲▲P<0.01

3.3 細(xì)胞培養(yǎng)上清液中TGF-β含量

表1顯示，與空白對照組比較，其余5組細(xì)胞TGF-β含量顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)；與模型對照組比較，高中低劑量桃紅四物湯組及陽性對照組細(xì)胞培養(yǎng)上清液中TGF-β含量顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，尤以高劑量和陽性對照組上升最為明顯。

3.4 各組細(xì)胞中TGF-β、Smad2/3表達(dá)結(jié)果

表2圖3顯示，UVA輻射后各組TGF-β、Smad2/3表達(dá)降低(P<0.01)；與模型對照組比較，桃紅四物湯高、中劑量組及陽性對照組細(xì)胞中TGF-β表達(dá)顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；與高劑量組比較，低劑量組TGF-β表達(dá)上升不明顯，中、低劑量組Smad2/3表達(dá)上升不明顯，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，P<0.01)。

表2 各組細(xì)胞中TGF-β、Smad2/3蛋白表達(dá)水平比較

注：與空白對照組比較：**P<0.01；與模型對照組比較：##P<0.01；與桃紅四物湯高劑量組比較：▲P<0.05，▲▲P<0.01

圖3 各組細(xì)胞中TGF-β、Smad2/3蛋白條帶比較

4 討論

日光中的紫外線過量照射皮膚，侵襲肌膚腠理，屬于外邪致病范疇，中醫(yī)稱為“光毒”，感受光毒侵襲是引起皮膚光老化的重要病因之一?！肮狻毙匝谉釋訇?，為熱毒之一?！抖刺鞀W旨》記載：“日曬瘡，乃夏天曝烈之日曝而成者也，必先疼而后破，乃外熱所傷，非內(nèi)熱所損也。[3]”當(dāng)光毒熱邪侵入人體后，火熱蘊(yùn)結(jié)灼傷津液，耗氣傷血，日久則氣血虧虛，血液運(yùn)行遲滯。所以，氣血運(yùn)行不暢致使氣血阻滯，血脈瘀阻，易出現(xiàn)色素沉著、斑塊瘀積、皮膚日久失去氣血濡養(yǎng)，則加快皮膚衰老的進(jìn)程[4]。由此可見，血瘀內(nèi)結(jié)是皮膚光老化的主要發(fā)生機(jī)制，我們可以從活血化瘀角度防治皮膚光老化的發(fā)生與發(fā)展。

UV輻射引起皮膚光老化的損傷機(jī)制包括氧化應(yīng)激、DNA損傷、炎癥反應(yīng)、免疫抑制、晚期糖基化終末產(chǎn)物(advanced glycation end products，AGEs)、分解細(xì)胞間基質(zhì)、減少細(xì)胞間基質(zhì)合成、破壞皮膚組織間結(jié)構(gòu)、提高細(xì)胞突變頻率、延緩細(xì)胞周期、誘發(fā)細(xì)胞凋亡等[5-7]方面。真皮微血管內(nèi)皮細(xì)胞是真皮的主要細(xì)胞，組織定位決定了真皮微血管內(nèi)皮細(xì)胞在皮膚各種生理及生化反應(yīng)中發(fā)揮著關(guān)鍵作用[7]，能夠活化參與多種生理過程，通過增殖、休眠、凋亡和老化這4個基本細(xì)胞狀態(tài)建立皮膚微血管維持和重塑之間的動態(tài)平衡。長期照射可以引起真皮微血管內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能的改變，血管通透性明顯增高，導(dǎo)致氧化損傷的發(fā)生及炎癥因子的聚集，從而影響真皮的結(jié)構(gòu)和功能，導(dǎo)致皮膚損傷及光老化的發(fā)生。桃紅四物湯中含有的多種有效成分，李雙雙等[8]測定桃紅四物湯中含有苦杏仁苷、羥基紅花黃色素A、梓醇、地黃苷A、阿魏酸、芍藥苷、原兒茶酸、綠原酸、沒食子酸9種水溶性活性成分。上述成分可以清除血液內(nèi)的自由基，提高抗氧化酶活性，抑制UV誘導(dǎo)的膠原蛋白降解，改善皮膚微循環(huán)，從而減緩皮膚的衰老，增強(qiáng)皮膚的抗衰老能力。

通過前期對UV輻射致人真皮微血管內(nèi)皮細(xì)胞損害的研究發(fā)現(xiàn)，TGF-β活性表達(dá)的增加具有促進(jìn)Ⅰ型膠原和Ⅲ型膠原蛋白含量的作用，與皮膚光老化發(fā)病機(jī)制密切相關(guān)，具有調(diào)節(jié)炎癥、防止細(xì)胞外基質(zhì)的降解、促進(jìn)血管生成和膠原合成的作用[9]。Smad蛋白是介導(dǎo)TGF-β信號傳導(dǎo)過程中的關(guān)鍵，TGF-β受體被激活后磷酸化產(chǎn)生Smads蛋白，與TGF-β超家族形成TGF-β/Smads信號傳導(dǎo)通路共同發(fā)揮調(diào)控細(xì)胞因子的作用與生理功能[10]。紫外線照射可通過影響TGF-β/Smads信號傳導(dǎo)通路，使體內(nèi)膠原蛋白水平表達(dá)降低[11]，進(jìn)而出現(xiàn)皮膚衰老。Gambichler[12]等學(xué)者發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過UV輻射24 h后的皮膚中TGF-β與Smads蛋白含量表達(dá)明顯減少，TGF-β信號傳導(dǎo)通路在Smad2/3的誘導(dǎo)下影響膠原蛋白的合成，加速了衰老。另外，基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)在皮膚光老化發(fā)生機(jī)制中起核心作用。何永靜[15]等通過觀察UVA 照射下TGF-β1對成纖維細(xì)胞中MMP-1、MMP-3 的表達(dá)影響證實(shí)，TGF-β1可以通過抑制細(xì)胞中 MMP-1、MMP-3mRNA 的表達(dá)降低，促進(jìn)對Ⅰ型、Ⅲ型膠原的合成，說明TGF-β1對成纖維細(xì)胞起到保護(hù)作用以及在皮膚光老化形成機(jī)制中具有重要作用。

本研究發(fā)現(xiàn)，HDMEC經(jīng)過UV輻射刺激受到損害后，細(xì)胞中TGF-β的表達(dá)含量降低，直接導(dǎo)致其分泌的Smad蛋白減少，由Smad介導(dǎo)的TGF-β/Smad信號傳導(dǎo)通路信號的調(diào)控作用則會隨之減弱，用不同劑量的桃紅四物湯含藥血清干預(yù)后，各組細(xì)胞中TGF-β、Smad2/3的表達(dá)含量都有不同的升高，且劑量越高效果越好，說明桃紅四物湯可以促進(jìn)受損的HDMEC分泌TGF-β、Smad蛋白含量，增強(qiáng)TGF-β/Smad信號傳導(dǎo)通路的信號強(qiáng)度，使其能夠正常發(fā)揮對下游信號分子的調(diào)控影響作用，為應(yīng)用桃紅四物湯治療皮膚光老化的研究提供新的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。