張 洋，王志娟，張 艷，劉曉宇△，孔繁達(dá)

(1. 大連醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院中醫(yī)科，大連 116000； 2. 航天中心醫(yī)院，北京 100049；3. 遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，沈陽 110032； 4. 遼寧中醫(yī)藥大學(xué)，沈陽 110032)

心力衰竭(簡稱心衰) 是各種原因引起的心臟結(jié)構(gòu)和功能變化，即以心室重構(gòu)為主要改變的心臟泵血功能障礙，臨床上以肺循環(huán)瘀血和(或)體循環(huán)瘀血及組織血液灌注不足為主要表現(xiàn)[1]。基質(zhì)金屬蛋白酶2(MMP-2)作為基質(zhì)金屬蛋白酶家族的重要成員，與心衰的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切；當(dāng)心衰發(fā)生時，MMP-2的表達(dá)和活性逐漸增強(qiáng)，MMP-2的含量水平與心衰進(jìn)程成正相關(guān)[2]。本實(shí)驗(yàn)研究選用ACEI類藥物中的賴諾普利作為陽性對照藥物，ACEI為治療心衰的基石類藥物，研究顯示ACEI可抑制心衰時MMP-2的表達(dá)，并通過抑制心室重構(gòu)及改善心功能達(dá)到防治心衰的作用[3-4]。活血化瘀類中藥作為臨床治療心衰的有效方藥，可顯著緩解心衰癥狀，改善心臟功能，提高患者生活質(zhì)量[5-6]。桃紅四物湯為活血化瘀類基礎(chǔ)方劑，血府逐瘀湯、補(bǔ)陽還五湯等諸多活血化瘀方劑均由此方化裁而來。目前鮮見活血化瘀方劑對心衰后心功能及MMP-2影響的相關(guān)研究報道。本研究旨在觀察不同活血化瘀方劑對心衰大鼠心功能及心肌中MMP-2的表達(dá)影響，從中篩選出療效突出的方劑，并探討其作用機(jī)制及靶點(diǎn)，為中醫(yī)藥防治心衰提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物

實(shí)驗(yàn)所需動物由遼寧長生生物技術(shù)有限公司提供[SCXK(遼)2010-0001]。選用12周齡、普通級、健康、雄性SD大鼠100只，體質(zhì)量220～260 g。

1.2 造模與分組

圖 1、2顯示，大鼠經(jīng)7 d適應(yīng)性喂養(yǎng)后，按每100 g給予10%水合氯醛0.4 mL行腹腔注射麻醉。備皮后于左側(cè)第4肋間開胸，鈍性分離胸部肌肉，暴露肋骨，鈍性分離肋間組織剝離心包膜暴露心臟，于左冠狀動脈前降支起點(diǎn)處結(jié)扎冠狀動脈前降支，重置心臟于胸腔，分層縫合胸壁。術(shù)后連續(xù)注射青霉素鈉3 d以預(yù)防感染。常規(guī)喂養(yǎng)1周后將飼料減半，同時每日游泳至其力竭，每日1次，共4周；行心臟超聲檢測大鼠左室射血分?jǐn)?shù)(LVEF)，計算心臟指數(shù)(CI)；以LVEF≤50%或CI≤180 ml·min-1·kg-1作為心衰成功造模的標(biāo)準(zhǔn)[7-8]。將造模成功的大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為模型組、賴諾普利組、桃紅四物湯組、血府逐瘀湯組、補(bǔ)陽還五湯組，未行冠脈結(jié)扎的大鼠為空白對照組，每組各10只大鼠。

圖1 空白對照組與造模后大鼠心臟超聲比較

1.3 藥物與給藥劑量

桃紅四物湯組由桃仁、紅花、當(dāng)歸、川芎、赤芍、熟地等中藥組成，補(bǔ)陽還五湯組由黃芪、當(dāng)歸尾、赤芍、地龍、川芎、紅花、桃仁等組成，血府逐瘀湯組由桃仁、紅花、川芎、赤芍、當(dāng)歸、生地、牛膝、桔梗、柴胡、枳殼、甘草等組成，中藥方劑制劑由天江藥業(yè)有限公司提供，處方中的全部藥材均符合《中國藥典》2010年版有關(guān)規(guī)定[9]。賴諾普利片(10 mg/片)產(chǎn)自信誼萬象藥業(yè)(國藥準(zhǔn)字H10960265)?？瞻讓φ战M與模型組灌胃蒸餾水3 mL/次，每日1次。各給藥組大鼠按人鼠劑量換算，給藥劑量(g/kg)=給出的人的劑量(g)×系數(shù)(0.018)/所求動物體質(zhì)量(kg)[10]。各中藥組給藥為9.2 g生藥/kg，賴諾普利組給藥為1.5 mg生藥/kg，給藥組藥物均溶于3 mL蒸餾水中，每日1次灌胃，上述各組均灌胃6周。

1.4 檢測方法

給藥4周后行心臟超聲檢測各組大鼠的心功能，包括：左室收縮末期容積(ESV)、左室舒張末期容積(EDV)、射血分?jǐn)?shù)(LVEF)、每搏輸出量(SV),遂處死全部大鼠，每只大鼠心臟按標(biāo)準(zhǔn)處理，取100 mg心肌組織標(biāo)本，于液氮中冷凍后再保存待測,分別用于免疫組化法及實(shí)時定量熒光PCR檢測心肌組織中MMP-2的表達(dá)。

1.4.1 心肌免疫組化學(xué)檢測 3%H2O2去離子水孵育10 min，阻斷內(nèi)源性過氧化物酶，磷酸緩沖液(PBS) 沖洗2 min×3次；分別滴加一抗MMP-2受體抗體(稀釋比例1∶300)，37 ℃孵育 1 h，PBS 沖洗2 min×3次；滴加兔抗山羊IgG抗體，室溫孵育30 min，PBS 溶液沖洗2 min×3次；DBA顯色，顯微鏡下觀察并控制反應(yīng)時間，待組織著色而背底顏色較淡時馬上吸去顯色液；蒸餾水充分沖洗，蘇木精輕度復(fù)染，乙醇脫水、透明、中性樹膠封片。以心肌胞質(zhì)染成棕褐色為陽性細(xì)胞標(biāo)志，采用Imagepro-Plus 6.0圖像分析軟件測定心肌組織切片陽性表達(dá)區(qū)的積分光密度值(IOD)，取平均值作為IOD。

1.4.2 心肌實(shí)時定量PCR檢測 采用TRIZOL從心肌組織中提取總RNA(100 mg/mL)，提取方法嚴(yán)格按照說明書操作。在逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系中加入RNA 2μg，10×RT Mix2μL，NTP混合液2 μL，OligodT152 μL，QuantReverse Transcriptase 1 μL，加入RNase-free水。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系在37 ℃下反應(yīng)60 min，在70 ℃下15 min使產(chǎn)物變性。合成的cDNA于-20 ℃下保存。MMP-2上游引物 5’-GAAGCATCAAATCGGACTG-3’，下游引物5’-GGCGGGAGAAAGTAGCA-3’，產(chǎn)物長度251 bp。PCR反應(yīng)條件均為:95 ℃預(yù)變性5 min 94 ℃ 45 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 40 s,重復(fù)35個循環(huán)后,72 ℃ 5min。梯度稀釋的正常組cDNA，以各引物完成定量PCR反應(yīng)，再將各組cDNA進(jìn)行定量PCR檢測。實(shí)時定量PCR數(shù)據(jù)統(tǒng)計采用相對定量法。以2-ΔΔCt(Livak)法比較未經(jīng)處理樣品和已處理樣品目標(biāo)轉(zhuǎn)錄之間的表達(dá)差異。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠心功能檢測結(jié)果

表1顯示，與空白對照組比較，模型組ESV、EDV明顯升高，LVEF、SV明顯下降(P<0.05)；各給藥組ESV、EDV較模型組明顯下降,LVEF、SV明顯升高(P<0.05)。給藥組組間比較，補(bǔ)陽還五湯組較其他3組ESV、EDV明顯下降，LVEF、SV明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

2.2 各組大鼠MMP-2免疫組化IOD值及mRNA表達(dá)結(jié)果

表1圖2顯示，與空白對照組比較，模型組心肌組織MMP-2的IOD值及mRNA表達(dá)均明顯升高(P<0.05)；各給藥組MMP-2水平較模型組差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。給藥組組間比較，補(bǔ)陽還五湯組MMP-2的IOD值及mRNA水平較其他3組下降更為顯著，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與模型組比較，空白對照組及各給藥組MMP-2的陽性表達(dá)明顯減少(P<0.05)；與補(bǔ)陽還五湯組比較，其他3給藥組MMP-2的陽性表達(dá)明顯升高(P<0.05)。

表1 各組大鼠心功能、MMP-2免疫組化IOD值及mRNA表達(dá)結(jié)果

注：與空白對照組比較：▲P<0.05；與模型組比較：△P<0.05；與補(bǔ)陽還五湯組比較：#P<0.05

注：A.空白對照組；B.模型組；C.賴諾普利組；D.桃紅四物湯組；E.血府逐瘀湯組；F.補(bǔ)陽還五湯組圖2 (A～F) 各組大鼠心肌組織MMP-2免疫組化染色 (40×)

3 討論

“心衰”作為病名首見于西晉·王叔和《脈經(jīng)·脾胃部第三》：“心衰則伏，肝微則沉，故令脈伏而沉”[11]。現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的心衰與中醫(yī)文獻(xiàn)記載的心衰尚存在一定差異，屬于中醫(yī)學(xué)“胸痹、水腫、喘證、心悸”等范疇。中醫(yī)古代文獻(xiàn)對于心衰的命名只是抓住了心衰的一些臨床癥狀進(jìn)行闡述，而不是將心衰作為一個獨(dú)立的疾病，不利于反映心衰作為一個疾病發(fā)生發(fā)展的全過程。目前多主張以“心衰病”命名，更有利于體現(xiàn)其疾病特征[12]。臨床中心衰以“血瘀”證候?yàn)橹饕憩F(xiàn)，“不通則痛”決定了心衰的病因病機(jī)主要為“血瘀”所致，故活血化瘀視為心衰的基礎(chǔ)治則。本研究選用桃紅四物湯、血府逐瘀湯及補(bǔ)陽還五湯作為研究藥物，三方均為活血化瘀類代表方劑。桃紅四物湯以祛瘀為核心，輔以養(yǎng)血行氣，使瘀血祛、新血生、氣機(jī)暢，化瘀生新為該方顯著特征。血府逐瘀湯與補(bǔ)陽還五湯皆由桃紅四物湯化裁而來。其中血府逐瘀湯主治諸癥皆為瘀血內(nèi)阻胸中、氣機(jī)郁滯所致，即王清任所稱“胸中血府血瘀”之證。補(bǔ)陽還五湯方中重用黃芪以補(bǔ)氣，使得氣帥血行；另配地龍引領(lǐng)活血化瘀諸藥貫通經(jīng)脈以達(dá)末節(jié)之地，故此方更偏于益氣活血、化瘀通絡(luò)。

心室重構(gòu)是心衰發(fā)生發(fā)展的核心機(jī)制。心室重構(gòu)是心室由于心肌損傷或負(fù)荷(壓力或容量)加重等因素，導(dǎo)致心肌結(jié)構(gòu)發(fā)生改變和心臟功能下降等一系列復(fù)雜的病生理過程。心室重構(gòu)主要表現(xiàn)為心室肥厚、心室腔擴(kuò)大等心肌結(jié)構(gòu)的改變[13]。本研究通過心臟超聲檢測大鼠心功能發(fā)現(xiàn)，模型組大鼠ESV、EDV明顯升高，LVEF、SV明顯下降，說明心衰大鼠出現(xiàn)心室腔擴(kuò)大、左室增厚、心臟收縮功能下降等心肌結(jié)構(gòu)和功能改變，提示大鼠存在心室重構(gòu)。經(jīng)藥物治療后大鼠心肌結(jié)構(gòu)及功能均有明顯改善，表現(xiàn)為ESV、EDV明顯下降及LVEF、SV明顯升高，說明中藥桃紅四物湯、血府逐瘀湯、補(bǔ)陽還五湯和西藥賴諾普利在治療心衰過程中均起到了抗心室重構(gòu)和改善心功能的作用，且補(bǔ)陽還五湯效果優(yōu)于桃紅四物湯、血府逐瘀湯及賴諾普利。

研究表明，心衰時心肌組織中MMP-2的表達(dá)顯著增高，高表達(dá)的MMP-2可降解正常膠原組織，使心肌膠原網(wǎng)絡(luò)發(fā)生重構(gòu)，進(jìn)而導(dǎo)致心室重構(gòu)惡化，從而加快心衰的進(jìn)程[14]。而通過下調(diào)心衰時心肌MMP-2的表達(dá)，可有效改善心功能，抑制心室重構(gòu)，進(jìn)而達(dá)到治療心衰的作用[15]。本研究發(fā)現(xiàn)，中藥桃紅四物湯、血府逐瘀湯、補(bǔ)陽還五湯和西藥賴諾普利均可下調(diào)心衰大鼠心肌中MMP-2的表達(dá)，其中補(bǔ)陽還五湯在下調(diào)心肌MMP-2的表達(dá)上優(yōu)于桃紅四物湯與血府逐瘀湯及賴諾普利。本研究表明，上述中藥活血化瘀方劑可通過改善心衰時受損的心臟功能及抑制心肌MMP-2的表達(dá)起到治療心衰的作用，其作用機(jī)制可能是通過抑制心肌MMP-2活性，從而調(diào)節(jié)心肌膠原的分布及代謝，修復(fù)受損心肌組織，增強(qiáng)心肌的抗?fàn)坷院蛷椥裕瑥亩岣咝募≌w收縮力，改善心功能，抑制心室重構(gòu)，進(jìn)而達(dá)到治療心衰的作用。本研究佐證了“活血化瘀”治則在治療心衰中的重要意義，為“通則不痛”的中醫(yī)理論提供了科學(xué)客觀的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。